甲基化dna富集試劑及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及甲基化DNA富集試劑及其制備方法和應用。甲基化DNA富集試劑是一種由甲基化結合蛋白和凝膠或磁珠合成的甲基化DNA親和介質。利用本發明的甲基化DNA親和介質可建立簡單、高效的尿液甲基化DNA富集試劑和DNA轉化的一步法。大體積尿液中的甲基化DNA可以通過甲基化結合蛋白的親和介質富集，提高了檢測的靈敏度和速度。富集的甲基化DNA無需進一步的DNA分離純化，可以直接用于甲基化分析。
【專利說明】甲基化DNA富集試劑及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體地涉及一種利用甲基化結合蛋白直接富集，轉化并鑒定尿液中甲基化DNA的試劑及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002]DNA甲基化(DNA methylat1n)是指在DNA甲基化轉移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉移至DNA鏈中特定堿基上的化學修飾過程。哺乳動物基因組中，DNA甲基化多發生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一種表觀(epigenetic)修飾，它在不改變DNA序列的情況下，對個體的生長、發育、基因表達模式以及基因組的穩定性起到重要的調控作用，并且這種修飾在發育和細胞增殖的過程中是可以穩定傳遞的。近年來的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發生、發展、細胞癌變有著密切的聯系。目前基礎研究表明DNA甲基化異常在腫瘤發生、發展中的作用主要包括:(I)DNA甲基化異常促使C~T突變發生，研究表明DNA甲基化使胞嘧啶轉變成5 mC,而5mC的突變率比其他堿基(包括沒有甲基化的胞嘧啶)突變率高。同時DNA甲基轉移酶(DNMT)在催化突變反應方面有重要作用，參與導致C-U-T的轉換，包括p53在內的許多腫瘤抑制基因的5 mC在惡性腫瘤中都是突變的熱點，DNA甲基化異常在這些突變中發揮一定的作用。(2)DNA甲基化異常影響基因的表達。腫瘤組織中基因組甲基化狀態不同于正常組織，表現為整個基因組的低甲基化與部分區域特別是基因啟動子區CpG島的高甲基化共存，這種甲基化狀態與許多腫瘤相關基因的異常表達有關。腫瘤中基因組甲基化程度普遍降低，其中許多特異癌基因也出現低甲基化，同時伴隨它們的表達有不同程度的增加。有報道認為在細胞群體中，DNA低甲基化可能是導致腫瘤形成的原始細胞克隆增殖的關鍵因素之一。但低甲基化與基因表達的關系還有待進一步研究闡明。腫瘤細胞中許多抑癌基因的啟動子區CpG島發生高甲基化目前被廣泛研究，這種甲基化異常與該基因的轉錄抑制相關，并能通過有絲分裂穩定的遺傳。所以認為，啟動子區CpG島的異常高甲基化是抑癌基因失活的一種機制。研究發現在結直腸癌細胞株中，一個P16等位基因發生突變而未甲基化，另一個未突變但高度甲基化，最終該基因發生轉錄抑制。此外越來越多的基因被報道在腫瘤中因高甲基化而導致轉錄抑制，這些基因涉及細胞周期調控、生長和分化(ER基因)、血管生成(THBS1基因)、粘連和轉移(--ΜΡ3基因)、DNA修復(MGMT基因)等多方面，表明高甲基化在腫瘤形成中發揮著作用。
[0003]DNA甲基化在腫瘤中的作用主要表現在以下幾個方面:一，甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶，造成基因突變；二，抑癌基因和DNA修復基因由于超甲基化而沉默；三，癌基因甲基化水平降低而活化；四，基因組總體甲基化水平降低使轉座子、重復序列活化導致染色體穩定性下降。這些因素是腫瘤發生、發展、轉移、惡化最終導致患者死亡的重要原因。DNA總體甲基化水平(即甲基化譜)和特定基因甲基化程度改變可作為腫瘤診斷指標。
[0004]目前常用的甲基化DNA檢測方法是從組織樣本中提取DNA進行甲基化DNA檢測。此種方法的缺點是不適合腫瘤的早期診斷。而早期腫瘤的治愈率遠高于晚期腫瘤。相應的死亡率也大大降低。因此能夠提高腫瘤早期診斷率的方法和技術一直是醫學界探索的重要目標。
[0005]尿液做為常規檢驗樣本，收集簡單，易于處理，可以大量獲得。如果能從尿液中富集甲基化DNA，那么當腫瘤出現DNA甲基化時，在早期階段即有可能被發現。醫生可以迅速采取必要的醫療措施，及早消除病患。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種方法簡單、高效，可將富集和轉化一步完成的甲基化DNA富集試劑。
[0007]本發明的另一目的是提供一種利用甲基化DNA富集試劑富集尿液中甲基化DNA的方法。
[0008]本發明采用的技術方案是:一種甲基化DNA富集試劑，是一種由甲基化結合蛋白和帶有鎳配基的凝膠或磁珠合成的甲基化結合蛋白凝膠或甲基化結合蛋白磁珠。
[0009]上述的甲基化DNA富集試劑，所述的鎳配基的凝膠是金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠；所述的鎳配基的磁珠是瓊脂糖鎳磁珠。
[0010]上述的甲基化DNA富集試劑，甲基化DNA富集試劑中含有穩定劑，所述的穩定劑包含 PPG 或 Tween20。
[0011]上述的甲基化DNA富集試劑，所述的甲基化結合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]上述的甲基化DNA富集試劑的制備方法如下:
[0013]I)按SEQ ID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質粒PET中，構建甲基化結合蛋白表達質粒ρΕΤ-ΜΒΡ，將質粒ρΕΤ-ΜΒΡ轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度值達到0.4時，在37°C條件下用IPTG誘導，使IPTG的終濃度為0.5mM,誘導15~17小時，7000轉/分鐘離心，收集菌體細胞；
[0014]2)將菌體細胞經溶菌酶裂解30分鐘后，超聲波破碎，離心，得到含有甲基化結合蛋白的裂解液，加入金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠或瓊脂糖鎳磁珠，混合并在4°C孵育2小時，1000轉/分鐘離心，除去上清液，并用1ml 50mM Tris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl緩沖液洗兩次，每次用1000轉/分鐘離心，最后以Iml的50mM Tris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結合蛋白的凝膠，制得甲基化DNA富集試劑。
[0015]本發明的甲基化DNA富集試劑用于富集尿液中甲基化DNA，方法如下:
[0016]I)取尿樣，3000轉/分鐘，取上清液；
[0017]2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集試劑10微升，于4_25°C下振蕩保溫Ih ；
[0018]3) 1000 轉 / 分鐘離心，除去上清液，以 Iml 的 50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl緩沖液將甲基化結合蛋白凝膠轉移到離心管中，離心除去上清液，即得富集了尿樣中甲基化DNA的甲基化結合蛋白凝膠。
[0019]本發明的甲基化DNA富集試劑還可用于制備富集甲基化DNA的試劑盒。
[0020] 本發明的有益效果是:本發明是一種利用凝膠或磁珠與甲基化結合蛋白結合而建立的簡單、高效的尿液甲基化DNA富集、轉化一步法。本發明將甲基化結合蛋白的基因克隆到細菌表達質粒的基因表達位點。表達出來的甲基化結合蛋白帶有六個組氨酸的C-末端。該蛋白可以用親和層析方法直接純化，并以非共價鍵形式連接在凝膠或磁珠上，制成的甲基化富集試劑可以用于甲基化的DNA富集。腫瘤組織釋放出的甲基化DNA可以通過血液進入尿液。尿液的成份相對血液要簡單并容易收集，更容易用于腫瘤檢測。大體積尿液中的甲基化DNA可以通過甲基化結合蛋白凝膠或磁珠富集，進一步提高檢測的靈敏度和速度。富集的甲基化DNA無需進行通常的DNA分離純化，直接用于甲基化分析。
[0021]尿樣中含有兩類DNA:—類來自血液，另外一類來自輸尿管和膀胱。有診斷意義的DNA是來自血液的較小的DNA片段。本發明首先經離心將尿液里的大分子DNA和細胞碎片分離。然后將含有血液DNA的尿液與帶有甲基化結合蛋白的凝膠或磁珠混合。經孵育后，離心過濾收集帶有甲基化DNA的甲基化結合蛋白凝膠。凝膠-甲基化結合蛋白-DNA復合沉淀可以直接用于甲基化DNA的轉化和測定。尿液中甲基化基因特定位點的甲基化可通過亞硫酸氧化和快速、靈敏的實時定量PCR方法測定。本發明的創新之處在于通過簡單的一步法可以將大量尿液中待測的甲基化DNA特異性富集，無需進一步的分離純化直接進行轉化和檢測，進而提高了檢測速度和靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1.甲基化結合蛋白表達質粒的構建。
[0023]圖2.甲基化結合蛋白的電泳圖；
[0024]圖中，I).純化甲基化結合蛋白；2).凝膠-甲基化結合蛋白；
[0025]3).磁珠-甲基化結合蛋白。
[0026]圖3.甲基化DNA亞硫酸鹽轉化和PCR分析；
[0027]圖中，I).DNA標準物；2).陰性對照；3).陽性結果。
[0028]具體實施方法
[0029]實施例1甲基化DNA富集試劑
[0030]I)甲基化結合蛋白表達質粒(ρΕΤ-ΜΒΡ)的構建
[0031]按SEQ ID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質粒PET中，構建甲基化結合蛋白表達質粒ρΕΤ-ΜΒΡ，將質粒ρΕΤ-ΜΒΡ轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度值達到0.4時，在37°C條件下用IPTG誘導，使IPTG的終濃度為0.5mM，誘導16小時，7000轉/分鐘離心，收集菌體細胞，保存在_80°C低溫冰箱。
[0032]2)凝膠甲基化DNA富集試劑
[0033]菌體細胞經溶菌酶裂解(lmg/ml，30分鐘，不時搖動)，然后，超聲波破碎(1x10分鐘，冰浴控制溫度)，離心，得到含有甲基化結合蛋白的裂解液，加入2毫升的金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠，混合并在4°C孵育2小時，1000轉/分鐘離心，除去上清液，并用50mM Tris-HClpH7.5 ；150mM NaCl緩沖液1ml洗兩次，每次用1000轉/分鐘分離，最后以Iml的50mMTris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結合蛋白的凝膠，從而得到甲基化結合蛋白凝膠，即甲基化DNA富集試劑。其電泳檢測分子量2.6kDa(如圖2)。
[0034]3)磁珠甲基化DNA富集試劑
[0035]菌體細胞經溶菌酶裂解(lmg/ml，30分鐘，不時搖動)，然后，超聲波破碎(1x10分鐘，冰浴控制溫度)，離心，得到含有甲基化結合蛋白的裂解液，加入2毫升的瓊脂糖鎳磁珠，混合并在4°C孵育2小時，1000轉/分鐘離心，除去上清液，并用50mM Tris-HClpH7.5 ；150mM NaCl緩沖液1ml洗兩次，每次用1000轉/分鐘分離，最后以Iml的50mMTris_HClpH7.5 ；150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結合蛋白的磁珠，從而得到甲基化結合蛋白磁珠，即甲基化DNA富集試劑。
[0036]得到的甲基化DNA富集試劑的穩定性也可以通過加入甲基化結合蛋白穩定劑增加其穩定性。穩定劑包含PPG、Tween20或者特異蛋白等。
[0037]實施例2尿樣中甲基化DNA的富集
[0038]方法如下:
[0039]1.尿樣采集
[0040]可以采用標準尿樣容器，采集量約50毫升。尿樣轉移到50ml的離心管中，然后離心，3000轉/分鐘，除去尿樣中雜質。將離心得到的上清液轉移至新的50ml的離心管中，進入下面結合步驟。
[0041]2.甲基化DAN結合
[0042]向50ml上清液中加入實施例1中2)制備的凝膠甲基化DNA富集試劑10微升，并在室溫搖動(60次左右/分鐘)，保溫一小時。此過程也可以在4°C下進行。此時尿樣中的甲基化DNA已和富集試劑中的甲基化結合蛋白結合。
[0043]3.甲基化DAN富集
[0044] 1000 轉 / 分鐘離心，除去上清液，并以 Iml 的 50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl緩沖液將富集了甲基化DNA的凝膠轉移到1.5ml的離心管中。1000轉/分鐘離心，除去上清，即得富集了甲基化DNA的甲基化結合蛋白凝膠。所得到的凝膠可以直接用于甲基化分析。包括轉化、雜交、CPR以及DNA序列測定等甲基化分析。
[0045]4.甲基化DNA亞硫酸鹽轉化和PCR分析
[0046]富集了甲基化DNA的凝膠試劑不需分離和純化，直接經亞硫酸鹽轉化和PCR甲基化分析。首先，向富集的甲基化DNA樣品中加入100微升的轉化試劑，然后對轉化的樣品進行脫磺酸基處理(Zymo甲基化DNA轉化試劑盒)。轉化后的DNA經甲基化特異性引物(正向引物為 TATAAACCCTAAACACTAAACCACG，反向引物為 TATATTCGGGGTGTGTGTGTTTGAC)進行PCR擴增，得到PCR產物，其電泳圖如圖3所示。PCR條件:20微升反應物，95oC 10分鐘；40X(95oC，30秒;60oC，30秒;72oC，30秒)；72oC，3分鐘。實驗中采用的是正常人甲基化DNA靶物。PCR得到的DNA條帶長度為130對堿基(圖3)。
[0047]本發明采用尿樣為檢測樣品，方便、無創。采用甲基化DNA富集凝膠或磁珠富集甲基化DNA，方法簡便，并可以提高檢測靈敏度。甲基化DNA直接在磁珠上進行轉化，不需DNA純化。因此本發明所闡述的方法具有快速、無創、方便、準確等諸多優點。
【權利要求】
1.一種甲基化DNA富集試劑，其特征在于:甲基化DNA富集試劑是由甲基化結合蛋白和帶有鎳配基的凝膠或磁珠合成的甲基化結合蛋白凝膠或甲基化結合蛋白磁珠。
2.如權利要求1所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于:所述的帶有鎳配基的凝膠是金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠；所述的鎳配基的磁珠是瓊脂糖鎳磁珠。
3.如權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于:甲基化DNA富集試劑中含有穩定劑，所述的穩定劑包含PPG或TWeen20。
4.如權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于:所述的甲基化結合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
5.權利要求4所述的甲基化DNA富集試劑的制備方法，其特征在于方法如下: 1)按SEQID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質粒中，構建甲基化結合蛋白表達質粒，將質粒轉入大腸桿菌感受態細胞中，得到重組大腸桿菌； 2)將菌體細胞經溶菌酶裂解30分鐘后，超聲波破碎，離心，得到含有甲基化結合蛋白的裂解液，加入金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠或瓊脂糖鎳磁珠 ，混合并在4°C孵育2小時，1000轉/分鐘離心，除去上清液，并用1ml 50mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl緩沖液洗兩次，每次用1000轉/分鐘離心，最后以Iml的50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結合蛋白的凝膠，制得甲基化DNA富集試劑。
6.權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑在富集尿液中甲基化DNA的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于方法如下: 1)取尿樣，3000轉/分鐘，取上清液； 2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集試劑10微升，于4_25°C下振蕩保溫Ih； 3)1000轉/分鐘離心，除去上清液，以Iml的50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl緩沖液將甲基化結合蛋白凝膠轉移到離心管中，離心除去上清液，即得富集了尿樣中甲基化DNA的甲基化結合蛋白凝膠。
8.權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑在甲基化DNA富集試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK104131004SQ201410361087
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】李偉東 申請人:沈陽百創特生物科技有限公司