一種重組t4噬菌體多核苷酸激酶及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種T4噬菌體多核苷酸激酶(T4bacteriophage?polynucleotide?kinase，T4PNK)的表達和純化，特別涉及一種T4噬菌體多核苷酸激酶(T4bacteriophage?polynucleotide?kinase，T4PNK)的可溶性表達及純化方法。屬生物化學領域。本發明通過載體構建將T4噬菌體多核苷酸激酶基因克隆到pGEX載體中，在低溫條件下T4多核苷酸激酶與GST融合表達，蛋白表達量達到15％，可溶性達95％。
【專利說明】一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種T4卩遼菌體多核苷酸激酶(T4 bacter1phage polynucleotidekinase, T4PNK)的表達和純化，特別涉及一種T4噬菌體多核苷酸激酶(Τ4 bacter1phagepolynucleotide kinase, T4 ΡΝΚ)的可溶性表達及純化方法。屬生物化學領域。

【背景技術】
[0002]T4 卩遼菌體多核苷酸激酶(Τ4 bacter1phage polynucleotide kinase, T4 ΡΝΚ),是一種多聚核苷酸5'羥基激酶，可以催化ATP的？位磷酸基團向單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3'磷酸基團的單核苷酸的5'羥基轉移。其他NTP也可產生相同的反應:5' -0Η+ΝΤΡ ? 5' -P+NDP。T4Polynucleotide Kinase 同時具有 3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化:3' -P? 3' -OH+Pi。T4噬菌體多核苷酸激酶應用廣泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端標記,用作Southern、Northern、EMSA等的探針，凝膠電泳的marker,DNA測序引物,PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化,確保后續連接反應順利進行。作為常用的分子生物學產品，T4噬菌體多核苷酸激酶市場需求量大，目前基因工程技術克隆的重組T4噬菌體多核苷酸激酶在pET系統中表達量高，但是容易形成包涵體，純化后只能得到少量的活性蛋白。


【發明內容】

[0003]本發明的目的是為克服上述技術的不足之處，提供一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶在大腸桿菌中可溶性表達及純化方法。本發明通過載體構建將T4噬菌體多核苷酸激酶基因克隆到PGEX載體中，在低溫條件下T4噬菌體多核苷酸激酶與GST融合表達，T4噬菌體多核苷酸激酶蛋白表達量可以達到15%，可溶性達到95%。
[0004]本發明是以如下技術方案實現的:一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶，其特征在于的T4噬菌體多核苷酸激酶的核苷酸序列如序列表SEQ IF NO:1所示。
[0005]其制備方法包括如下步驟:通過載體構建將密碼子優化的T4噬菌體多核苷酸激酶基因克隆到PGEX載體中，在低溫條件下通過與GST融合表達，來提高蛋白表達量和可溶性；T4噬菌體多核苷酸激酶基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；Τ4噬菌體多核苷酸激酶與GST在宿主菌中融合表達，融合表達蛋白為GST-T4 PNK ;融合表達蛋白含有GST標簽，用GST柱子純化融合蛋白。
[0006]進一步的,載體構建步驟具體為如下步驟:
[0007]引物設計如下:
[0008]所用正向引物為:5 ’ -CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3 下劃線部分為BamHI的酶切位點；
[0009]所用反向引物為:5’-CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3’ ；下劃線部分為 XhoI 的酶切位點；
[0010]以合成的Τ4 PNK為模板，用PCR的方法擴增Τ4 PNK編碼序列，PCR反應條件為:94°C熱變性I分鐘，55°C退火lmin，72°C延伸90秒，共進行25個循環；純化的PCR產物用BamHI和XhoI進行雙酶切，然后插入pGEX的多克隆位點；對融合蛋白表達載體pGEX_T4PNK進行DNA測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。
[0011]進一步的，融合表達步驟具體為如下步驟:
[0012]分別將融合蛋白表達載體PGEX-T4PNK和對照載體pGEX轉入表達宿主菌Escherichiacoli BL21 (DE3),挑取單克隆接種至新鮮的含50mg/l氨節青霉素的LB培養基；待細菌長至OD6tltl為0.6左右，分別加入終濃度為0.6mM的IPTG誘導T4PNK的表達；將誘導過程中的溫度設定為15°，誘導兩個小時后收集菌體。
[0013]進一步的，純化融合蛋白步驟具體為如下步驟:
[0014]收集一升發酵液的細胞，并用40ml冰浴的PBS重懸，PBS含有137mM NaCl, 2.7mMKCl，1mM Na2HPO4.12H20,2mM KH2PO4, pH7.4，冰浴超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過PBS預平衡的GST resin，上樣完畢用PBS充分洗滌，最后用GST洗脫液，GST洗脫液為0.154gGSH溶于50ml 50mM Tris_HCl，洗脫目的蛋白；GST親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，離子交換進一步去除雜蛋白和痕量的DNA。
[0015]本發明的優點是:通過載體構建將T4多核苷酸激酶基因克隆到pGEX載體中，在低溫條件下與GST融合表達，使表達蛋白可溶性大大增加。另外，GST標簽的加入則使T4多核苷酸激酶的純化更加簡化、高效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步說明:
[0017]圖1A是重組表達載體pGEX-T4 PNK的質粒圖譜；
[0018]圖1B是重組T4多核苷酸激酶蛋白表達的SDS-PAGE分析；
[0019]其中，泳道I為蛋白marker(KD),泳道2和泳道3分別為IPTG誘導前和誘導后PGEX-T4PNK的全菌蛋白表達；
[0020]圖2是T4多核苷酸激酶表達條件的優化；
[0021]其中，M:蛋白marker(KD) ;T、S、I分別代表全蛋白、上清和沉淀；15°C和37°C代表不同的誘導溫度；
[0022]圖3 是純化后的 GST-T4 PNK 的 SDS_PAGE(12% )分析:
[0023]其中，泳道1:大量表達超聲上清；泳道2 =GST純化介質穿過；泳道3:buffer A洗漆；泳道4:buffer B洗漆；泳道5:buffer C洗漆；泳道6:buffer D洗脫融合蛋白；M:蛋白 marker (KD)；
[0024]圖4是純化后的T4多核苷酸激酶的活性測定；

【具體實施方式】
[0025]本發明通過重組T4多核苷酸激酶原核表達載體pGEX-T4 PNK的構建，成功將密碼子優化的T4多核苷酸激酶基因克隆至GST標簽編碼序列的下游并與之處于同一閱讀框，構建了融合蛋白GST-T4 PNK的原核表達載體，測序結果表明閱讀框及DNA序列全部正確。通過對比實驗，發現在低溫誘導條件下PGEX-T4多核苷酸激酶蛋白的表達量達到15%，而可溶性達到95%。GST親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，離子交換進一步去除雜蛋白和痕量的DNA，一升發酵液中得到了約7mg的T4多核苷酸激酶(純度約95% )。12% SDS-PAGE分析表明，純化的T4多核苷酸激酶分子量為65kD。純化的T4多核苷酸激酶表現出和商品化酶(NEB公司)相似的活性，比活約為10000units/mg。
[0026]下面通過優選實例對本發明做更詳細的論述。
[0027]重組T4多核苷酸激酶原核表達載體pGEX-T4 PNK的構建:
[0028]以合成的T4 PNK為模板，用PCR的方法擴增T4 PNK編碼序列，
[0029]所用正向引物為:5’ -CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3 ’，
[0030]反向引物為:5’ -CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3 ’。
[0031]在正向引物中有一個BamHI的酶切位點(下劃線)，反向引物中有一個XhoI的酶切位點(下劃線)。PCR反應條件為:94°C熱變性I分鐘，55°C退火lmin，72°C延伸90秒，共進行25個循環。純化的PCR產物用BamHI和XhoI進行雙酶切，然后插入pGEX的多克隆位點。對重組表達載體pGEX-T4 PNK進行DNA測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。
[0032]按照方法中所述的步驟，將密碼子優化的T4 PNK基因克隆至GST標簽編碼序列的下游并與之處于同一閱讀框。重組質粒經測序驗證，成功構建了融合蛋白T4 PNK的原核表達載體，閱讀框及DNA序列全部正確，其簡圖參見圖1A。
[0033]1、T4PNK爾的表達:
[0034](I)融合蛋白T4 PNK的表達
[0035]分別將T4 PNK融合蛋白表達載體pGEX-T4 PNK和對照載體pGEX轉入表達宿主菌Escherichiacoli BL21 (DE3),挑取單克隆接種至新鮮的LB培養基(含50mg/l氨節青霉素)。待細菌長至OD6tltl為0.6左右，分別加入終濃度為0.6mM的IPTG誘導T4 PNK的表達。誘導兩個小時后收集菌體，處理后的菌體蛋白樣品走12% SDS-PAGE，使用UVP white/ultrav1let transilluminator對考馬斯亮藍染色的凝膠進行掃描記錄,采用專業分析軟件Grab-1t2.5和Gelwork分析目的蛋白占菌體總蛋白的比例。本文中，可溶性定義為:可溶性的目的蛋白/總的目的蛋白X 100%。在IPTG誘導后，出現了一條約為65kD的蛋白條帶，和理論分子量大小吻合，經凝膠掃描灰度分析，T4多核苷酸激酶融合蛋白約占菌體總蛋白的15%左右(圖1B)。(3)融合蛋白T4 PNK表達條件的優化
[0036]經對比實驗發現，在低溫15°的誘導條件下，融合蛋白T4 PNK的可溶性增加，約為37°C誘導條件下的3倍。實驗結果如圖2所示。
[0037](2)蛋白的純化
[0038]收集一升發酵液的細胞，并用40ml冰浴的PBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl，1mMNa2HPO4.12H20, 2mM KH2PO4, pH7.4)重懸，冰浴超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過PBS預平衡的GST resin，上樣完畢用PBS充分洗滌，最后用GST洗脫液(0.154g GSH溶于50ml50mMTris-HCl pH8.0)洗脫目的蛋白。GST親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，離子交換進一步去除雜蛋白和痕量的DNA，一升發酵液中得到了約7mg的T4多核苷酸激酶(純度約95% )0 12% SDS-PAGE分析表明，純化的T4多核苷酸激酶分子量為65kD(圖3)。
[0039](4) T4 PNK的活性測定方法
[0040]T4PNK的活性采用[Y -32PlATP摻入法進行定量分析，具體流程參考文獻(Proc.Natl Acad.Sc1.USA.54(1965)，158-165)。I 單位即 I 個 Richardson 單位，指 37°C條件下，30分鐘內催化Inmol酸不溶性[32p]摻入所需要的酶量。
[0041]如圖4所示，在50μ 1T4多聚核苷酸激酶反應緩沖液體系中，37°C溫育30分鐘，？-磷酸基團從ATP轉移至d(T)8的5'羥基末端[ATP與d(T)8比例是1: 1，量為50pmol]，結果顯示 20單位酶量可使超過90%的磷酸基團轉移。
【權利要求】
1.一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶，其特征在于所述的T4噬菌體多核苷酸激酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.如權利要求1所述的一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:通過載體構建將密碼子優化的T4噬菌體多核苷酸激酶基因克隆到pGEX載體中，在低溫條件下通過與GST融合表達，來提高蛋白表達量和可溶性；所述T4噬菌體多核苷酸激酶基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；T4噬菌體多核苷酸激酶與GST在宿主菌中融合表達，融合表達蛋白為GST-T4 PNK ;所述融合表達蛋白含有GST標簽，用GST柱子純化融合蛋白。
3.根據權利要求2所述的一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶的制備方法，其特征在于所述載體構建步驟具體為如下步驟: 引物設計如下: 所用正向引物為:5’ -CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3’:下劃線部分為BamHI的酶切位占.所用反向引物為:5’ -CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3’ ;下劃線部分為XhoI的酶切位點； 以合成的T4 PNK為模板，用PCR的方法擴增T4 PNK編碼序列，PCR反應條件為:94°C熱變性I分鐘，55°C退火Imin，72°C延伸90秒，共進行25個循環；純化的PCR產物用BamHI和XhoI進行雙酶切，然后插入pGEX的多克隆位點；對融合蛋白表達載體pGEX-T4 PNK進行DNA測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。
4.根據權利要求 2所述的一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶的制備方法，其特征在于所述融合表達步驟具體為如下步驟: 分別將融合蛋白表達載體PGEX-T4 PNK和對照載體pGEX轉入表達宿主菌Escherichiacoli BL21 (DE3),挑取單克隆接種至新鮮的含50mg/l氨節青霉素的LB培養基；待細菌長至OD6tltl為0.6左右，分別加入終濃度為0.6mM的IPTG誘導T4 PNK的表達；將誘導過程中的溫度設定為15°，誘導兩個小時后收集菌體。
5.根據權利要求2所述的一種重組T4噬菌體多核苷酸激酶的制備方法，其特征在于所述純化融合蛋白步驟具體為如下步驟: 收集一升發酵液的細胞，并用40ml冰浴的PBS重懸，所述PBS的構成為137mM NaCl，.2.7mM KCiaOmM Na2HPO4.12H20,2mM KH2PO4, pH7.4，冰浴超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過PBS預平衡的GST resin,上樣完畢用PBS充分洗滌，最后用GST洗脫液，所述GST洗脫液的構成為0.154g GSH溶于50ml 50mM Tris-HCl，洗脫目的蛋白；GST親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，離子交換進一步去除雜蛋白和痕量的DNA。
【文檔編號】C12N15/54GK104178467SQ201410361153
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】孫啟明, 張亞, 徐衛國, 陳遠 申請人:孫啟明