神經元與神經膠質細胞有序共培養裝置、制備方法及神經元與神經膠質細胞有序共培養方法
【專利摘要】本發明涉及細胞生物學領域，公開了一種神經元細胞和神經膠質細胞有序共培養裝置及其制備方法和應用。該裝置包括基底和聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章可移除地復合在所述基底上；所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距離為500μm～2000μm。本發明通過垂直于基底的第一通孔和第二通孔接種神經元細胞和神經膠質細胞，兩種細胞在各自區域接種時均勻性易于控制，可使用的細胞量增大，群體效應明顯，利于觀察研究。
【專利說明】神經元與神經膠質細胞有序共培養裝置、制備方法及神經元與神經膠質細胞有序共培養方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞生物學領域，具體涉及一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置、其制備方法及神經元與神經膠質細胞有序共培養的方法。

【背景技術】
[0002]近年來的研究結果表明，神經元與神經膠質細胞不僅存在物質交換，也存在信息交換。神經元與膠質細胞之間相互作用方式如何影響其物質、信息交流，以及它們相互作用方式的改變與多種腦部疾病如阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥等相關性研究成為神經科學的又一研究熱點。
[0003]目前可用于研究神經元與膠質細胞相互作用體外共培養體系是Banker等于20世紀90年代建立起來的以培養神經元細胞為目的的培養方法，有學者在此基礎上進行改良，成功建立了神經元與膠質細胞的共培養方法。但是上述方法是以膠質細胞為滋養層，在其表面接種上神經元細胞，兩種細胞無序錯落生長，難以用于研究神經元與膠質細胞相互作用研究。
[0004]專利號為200710117815.8和200710119997.2的發明專利基于微流控技術建立了在金表面多種細胞共培養裝置及方法，此兩種粘附和操縱多種細胞的方法所用基底均采用在玻璃表面蒸鍍一層金的方法制備，這種基底需要在超凈間利用高真空設備制備，價格較貴，并且金層性質不穩定，不可以長期保存，不利于在生物實驗室推廣。
[0005]專利號為201010105018.X的發明專利公開了一種基于微流控技術建立了在玻璃表面研究多種細胞相互作用的裝置及其制備方法和用途，這種方法將多種細胞分別接種于不同的微流孔道中待其在基底粘附后，除去微流孔道，實現多種細胞相互作用。但是這種裝置用于神經元和神經膠質細胞有序共培養時存在很多不足，第一，在微流孔道中接種細胞，細胞在狹長的孔道中分布不均勻；第二，細胞在微流孔道中由于培養基量少，細胞生存時間很短，而較短的時間并不能保證神經元與膠質細胞同時處于培養好的時間段；如果要不停的更換培養基，易使細胞漂浮，最終不穩定死亡；第三，微流孔道中細胞容量少，用于研究兩種胞相互作用的群體效應不明顯，不利于觀察研究。另外，由于神經元細胞不能傳代培養，而上述裝置要求各種細胞接種時間不宜間隔過長，因此，上述裝置難以用于神經元與神經膠質細胞相互作用研究。


【發明內容】

[0006]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置及其制備方法及神經元與神經膠質細胞有序共培養的方法，使得本發明所述裝置在接種神經元細胞與膠質細胞時易于控制細胞均勻性，并可以延長兩種細胞接種間隔時間，實現神經元與神經膠質細胞的有序共培養，增加可使用細胞量。
[0007]為實現以上發明目的，本發明提供如下技術方案:
[0008]一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置，包括基底和聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章可移除地復合在所述基底上；
[0009]所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；
[0010]所述第一通孔和第二通孔的距離為500 μ m~2000 μ m。
[0011]為了便于理解本發明所述裝置的發明原理，可參見圖1，需要說明的是，本發明附圖不對其中的形狀、尺寸、材質進行限定，其只是為了便于在本發明權利要求描述的基礎上理解本發明裝置核心技術，本領域技術人員能夠在本發明附圖的基礎上，合理預料到本發明限定的各種形狀、尺寸和材質的其他不脫離本發明發明原理的裝置。
[0012]針對現有專利201010105018.X基于微流控技術建立的在玻璃表面研究多種細胞相互作用的裝置的缺陷，本發明以成本低廉、簡單易操作的新型細胞共培養裝置，解決了其接種細胞均勻性不易控制、兩種細胞接種間隔時間短，可使用細胞量較少的問題，尤其適用于神經元與神經膠質細胞有序共培養。
[0013]本發明提供的用于神經元與神經膠質細胞有序培養的裝置包括基底，所述基底優選具有平整表面，以便與聚二甲基硅氧烷印章緊密結合，防止漏液。所述基底可以為任意能夠用于培養細胞的蓋玻片、載玻片、細胞培養皿等，本發明對此并無特殊限制。所述基底表面可以孵育有細胞外基質，也可以在使用時，即用于神經元與神經膠質細胞培養時再孵育細胞外基質。作為優選，所述細胞外基質為多聚賴氨酸，更優選為左旋多聚賴氨酸。
[0014]所述基底上可移除地復合有聚二甲基硅氧烷印章，即聚二甲基硅氧烷印章可從基底上移除。所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距離為 500 μ m ~2000 μ m。
[0015]作為優選，所述聚二甲基硅氧烷為(CH3O)3Si(CH2)CN(OCH2OCH2)nCH3或(CH3CH2O)3Si (CH2) CN(OCH2OCH2)nCH3,其中，η 為 3、6、17 或 100。
[0016]作為優選，所述聚二甲基硅氧烷印章為帶有微通孔的六面體，如正方體或長方體，其長寬高規格可根據實際試驗的需要具體制定，本發明不做具體限定。
[0017]所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔。第一通孔和第二通孔依次排列，且分別垂直于基底，即通孔是豎直通孔。本發明所述第一通孔和第二通孔的橫截面可以為任何適宜的形狀，作為優選，所述第一通孔和第二通孔的橫截面均為長方形。更優選地，所述第一通孔的長為1.0cm~2.0cm,寬為0.5cm~2.0cm,其高度(或稱為厚度、深度)視聚二甲基硅氧烷印章高度(或厚度或深度)確定；并列更優選地，所述第二通孔的長為1.0cm~2.0cm,寬為0.5cm~2.0cm,其高度(或稱為厚度、深度)視聚二甲基硅氧烷印章高度(或厚度或深度)確定。作為優選，所述第一通孔和第二通孔的距離為500 μ m~2000 μ m,更優選為1000 μ m~1500 μ m。
[0018]作為優選，所述微孔單元還包括與第一通孔和第二通孔依次排列的至少一個垂直于所述基底的第三通孔。第三通孔的橫截面優選為長方形，更優選的，所述第三通孔的長為1.0cm~2.0cm,寬為0.5cm~2.0cm,其高度(或稱為厚度、深度)視聚二甲基硅氧烷印章高度(或厚度或深度)確定。所述第三通孔與所述第二通孔的距離為500 μ m~2000 μ m,更優選為1000 μ m~1500 μ m。
[0019]所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，可以根據聚二甲基硅氧烷印章的大小以及使用需要包含兩個、三個甚至十個微孔單元；所述各微孔單元之間的距離優選為2.0cm~3.0cm。所述微孔單元包括至少一個第一通孔和至少一個第二通孔,可以使用需要包含兩個、三個甚至十個通孔。
[0020]聚二甲基硅氧烷印章復合于基底上時，第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽，即基底將第一通孔和第二通孔的一端封端。
[0021]本發明還提供了一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置的制備方法，包括:
[0022]制備聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔的距離為500 μ m~2000 μ m ；
[0023]將所述聚二甲基硅氧烷印章貼附于基底表面，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽。
[0024]本發明首先制備聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章與上述技術方案中相同，本發明在此不再贅述。
[0025]作為優選，所述聚二甲基硅氧烷印章按照以下方法制備:
[0026]采用微機械加工技術在模板上制備至少一個凹形線型微結構單元，所述凹形線型微結構單元包含依次排列的、至少一個第一凹形條和至少一個第二凹型條，所述第一凹型條和第二凹型條的距離為500 μ m~2000 μ m ；
[0027]用聚二甲基硅氧烷對所述模板上的凹形線型微結構單元進行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷I旲板；
[0028]去除所述聚二甲基硅氧烷模板上第一凹型條和第二凹型條的底面，得到聚二甲基硅氧烷印章。
[0029]首先采用微機械加工技術在模板上制備至少一個凹形線型微結構單元，所述凹形線型微結構單元包含依次排列的、至少一個第一凹形條和至少一個第二凹型條，所述第一凹型條和第二凹型條的距離為500μπι~2000μπι。在本發明中，所述第一凹型條的橫截面為長方形，長為1.0~2.0cm,寬為0.5~2.0cm ;所述第二凹型條的橫截面為長方形，長為1.0~2.0cm,寬為0.5~2.0cm0所述第一凹型條和第二凹型條的距離為500 μ m~2000 μ m，優選為100ym~1500 μ m。本發明對所述第一凹型條和第二凹型條的高度沒有特殊限制，可以根據需要自行選擇。
[0030]然后用聚二甲基硅氧烷對所述模板上的凹形線型微結構單元進行二次翻膜，第一步翻模得到凸型條，第二翻模得到凹形槽；經過二次翻模后，得到聚二甲基硅氧烷模板，聚二甲基硅氧烷模板與初始模板結構相同，即包括至少一個凹形線型微結構單元，所述凹形線型微結構單元包含依次排列的、至少一個第一凹形條和至少一個第二凹型條，所述第一凹型條和第二凹型條的距離為500 μ m~2000 μ m。
[0031]得到聚二甲基硅氧烷模板后，去除第一凹型條和第二凹型條的底面，使第一凹型條和第二凹形條成為通孔，即可得到聚二甲基硅氧烷印章。
[0032]作為優選，在模板上制備凹形線型微結構單元時，所述凹形線型微結構單元包括與第一凹型條和第二凹型條依次排列的第三凹型條，經過二次翻模、去除底面后得到的聚二甲基硅氧烷印章上包括第三通孔。對此，本領域技術人員可以參照上文所述，本發明在此不再贅述。
[0033]得到述聚二甲基硅氧烷印章后，將其貼附于基底表面，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽，即可得到用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置。其中，所述基底表面優選孵育有細胞外基質，方法如下:
[0034]將基底表面進行預處理；
[0035]向預處理后的基底表面滴加細胞外基質進行孵育。
[0036]首先用飛虎酸溶液(濃硫酸:雙氧水=3:1)浸泡玻璃類基底，浸泡時間為20~60min ;然后用雙蒸水洗滌至中性，干燥后即完成對基底的處理。
[0037]然后向基底表面滴加細胞外基質，所述細胞外基質的濃度優選為0.1%，孵育
0.5h~lh，將剩余溶液吸去，再用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌I~3次，晾干即可。
[0038]本發明還提供了一種神經元細胞與膠質細胞有序共培養的方法，包括:
[0039]在基底上孵育細胞外基質；
[0040]將聚二甲基硅氧烷印章連接在孵育有細胞外基質的基底上，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距離為500μπι-2000μπι ;
[0041]分別向所述第二通孔中加入神經膠質細胞懸浮溶液和第一通孔中加入神經元原代細胞懸浮液，進行培養；
[0042]待兩種細胞粘附于基底后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將表面粘附有神經膠質細胞和神經元細胞的基底浸泡于兩種細胞混合培養基中，進行神經膠質細胞和神經元細胞的共培養。
[0043]本發明首先在基底上孵育細胞外基質，方法如上文所述，本發明在此不再贅述。
[0044]然后將聚二甲基硅氧烷印章連接在孵育有細胞外基質的基底上，所述聚二甲基硅氧烷印章的結構及其制備方法如上文所述，本發明在此不再贅述。
[0045]本發明分別向所述第二通孔中加入神經膠質細胞懸浮溶液和第一通孔中加入神經元原代細胞懸浮液，進行培養；待兩種細胞粘附于基底后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將有序粘附于同一基底的神經膠質細胞和神經元細胞進行共培養。
[0046]本發明首先將神經膠質細胞和神經元細胞設置在各自獨立的凹槽中分別培養，此時，神經膠質細胞和神經元細胞分別在各自限定的區域內生長，待其分別粘附在基底上后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將基底上的神經膠質細胞和神經元細胞進行共培養，實現神經膠質細胞和神經元細胞的有序生長。在本發明中，神經膠質細胞和神經元細胞的接種間隔可以為Imin~10天，當神經膠質細胞和神經元細胞接種間隔時間較長，例如超過Ih時，接種神經膠質細胞后，為防止污染、防止細胞死亡，優選進行第一步培養，即將其放入培養箱中進行培養至神經膠質細胞粘附在基底表面；然后再接種神經元細胞進行第二步培養，即再次將其放入培養箱中進行培養至神經元細胞粘附在基底表面。作為優選，本發明首先加入神經膠質細胞懸浮溶液，進行第一步培養至神經膠質細胞粘附在基底表面；然后加入神經元原代細胞懸浮液，進行第二步培養至神經元細胞粘附在基底表面。
[0047]具體而言，當聚二甲基硅氧烷印章上的微孔單元僅包括第一通孔和第二通孔時，培養方法如下:
[0048]向聚二甲基硅氧烷印章的第二通孔中加入神經膠質細胞懸浮溶液進行第一步培養至神經膠質細胞粘附在基底表面。其中，所述神經膠質細胞懸浮溶液的細胞密度為15~17個/mL ;第一步培養的溫度為37°C，二氧化碳體積濃度為5 %，培養時間優選為0.5h~Ih0
[0049]第一步培養后，向聚二甲基硅氧烷印章的第一通孔中加入神經元原代細胞懸浮液進行第二步培養至神經元細胞粘附在基底表面。其中，所述神經元原代細胞懸浮溶液的細胞密度為14~16個/mL ;第二步培養的溫度為37°C，二氧化碳體積濃度為5%，培養時間優選為0.5h~1.5h。
[0050]作為優選，在第一步培養和第二步培養時間可以有較大的時間間隔，如Ih~7天甚至10天等，本發明對此并無特殊限制。
[0051]第二步培養后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將表面粘附有神經膠質細胞和神經元細胞的基底浸泡于兩種細胞混合培養基中，進行神經膠質細胞和神經元細胞的共培養，即可使神經膠質細胞和神經元細胞有序生長。在共培養過程中，神經膠質細胞和神經元細胞首先在各自限定區域內生長，完成兩種細胞有序粘附在同一基底上；然后，神經膠質細胞向神經元細胞方向移動，神經元細胞向各個方向生長出突出，其突出與膠質細胞接觸形成神經膠質細胞和神經元細胞接觸的界面，可以用于研究二者的相互作用。在共培養中，培養基為體積比為1:1的兩種細胞培養基的混合培養基，其中，兩種細胞培養基分別為:含有2%(體積比)神經營養因子B27的Neurobasal培養基和含有10%血清的DMEM/F12培養基。所述共培養的溫度為37°C，二氧化碳體積濃度為5%，本發明對所述共培養的時間沒有特殊要求，根據需要控制即可。
[0052]當聚二甲基硅氧烷印章上的微孔單元還包括與第一通孔和第二通孔依次排列的至少一個垂直于所述基底的第三通孔時，其培養方法如下:
[0053]向聚二甲基硅氧烷印章的第二通孔中加入神經膠質細胞懸浮溶液進行第一步培養至神經膠質細胞粘附在基底表面；
[0054]第一步培養后，向聚二甲基硅氧烷印章的第一通孔和第三通孔中加入神經元原代細胞懸浮液進行第二步培養至神經元細胞粘附在基底表面；
[0055]第二步培養后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將表面粘附有神經膠質細胞和神經元細胞的基底進行共培養，即可使神經膠質細胞和神經元細胞有序生長。
[0056]也可以按照以下方法進行培養:
[0057]當聚二甲基硅氧烷印章上的微孔單元還包括與第一通孔和第二通孔依次排列的至少一個垂直于所述基底的第三通孔時，其培養方法如下:
[0058]向聚二甲基硅氧烷印章的第一通孔和第三通孔中加入神經膠質細胞懸浮溶液進行第一步培養至神經膠質細胞粘附在基底表面；
[0059] 第一步培養后，向聚二甲基硅氧烷印章的第二通孔中加入神經元原代細胞懸浮液進行第二步培養至神經元細胞粘附在基底表面；
[0060]第二步培養后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將表面粘附有神經膠質細胞和神經元細胞的基底進行共培養，即可使神經膠質細胞和神經元細胞有序生長。
[0061]本發明通過垂直于基底的第一通孔和第二通孔接種神經元細胞和神經膠質細胞，兩種細胞在各自區域接種時均勻性易于控制，可使用的細胞量增大，群體效應明顯，利于觀察研究。更重要的是，神經元細胞和神經膠質細胞的接種時間間隔可以延長至數天，從而更有利于在同一平面上獲得較大面積的神經元細胞和神經膠質細胞的接觸界面，更有利于研究兩種細胞間的相互作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1所示為本發明所述裝置示意圖；
[0063]圖2為本發明提供的神經元細胞與膠質細胞生長的界面。

【具體實施方式】
[0064]本發明公開了一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置及其制備方法和用途，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述裝置、制備方法和應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0065]實施例1
[0066]I)取3*3厘米蓋玻片，表面首先用飛虎酸溶液(濃硫酸:雙氧水=3:1)浸泡40分鐘，然后用雙蒸水清洗至中性，干燥，在其表面滴加0.8毫升0.1 %的多聚賴氨酸，孵育1.0小時，將剩余溶液吸去，在用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，晾干，待用；
[0067]2)使用微機械加工技術，在一有機玻璃板上制備一組凹型線型微結構單元，該凹型線型微結構單元由從左至右依次排列的兩個凹槽組成，其中，所述左側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.0厘米，寬度為0.5厘米；所述右側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.0厘米，寬度為1.0厘米；左側凹槽與右側凹槽間距離為2000微米；
[0068]3)用聚二甲基硅氧烷對步驟2)得到的具有一組凹型線型微結構單元的有機玻璃板進行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板，該聚二甲基硅氧烷模板下表面上有微凹槽單元，該微凹槽單元由從左至右依次排列的兩條凹槽組成；其中，所述左側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.0厘米，寬度為0.5厘米；所述右側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.0厘米，寬度為1.0厘米；左側凹槽與右側凹槽間距離為2000微米；
[0069]分別去除兩條凹槽的底面，形成兩個橫截面為長方形的通孔，得到聚二甲基硅氧烷印章，其中，所述左側通孔長度為1.0厘米，寬度為0.5厘米；所述右側通孔長度為1.0厘米，寬度為1.0厘米；所述兩條微孔洞之間的間距為2000微米；所述兩個通孔構成微孔單元，所述微孔單元的長度為2.0厘米，寬度為2.8厘米；
[0070]然后把聚二甲基硅氧烷印章高壓消毒；
[0071]4)將步驟3)經高壓消毒后的無菌聚二甲基硅氧烷印章與步驟I)所述玻璃基底進行接觸性連接，使左側通孔和右側通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；
[0072]5)制備膠質細胞的懸浮溶液，細胞密度為16個/ml，然后把膠質細胞滴加入右側凹槽中；
[0073]6)制備神經元的原代細胞懸浮液，細胞密度為15個/ml ;把神經元細胞滴加入步驟5)裝置的左側凹槽中，注意用移液器將細胞吹散，使神經元細胞均勻分布，左側凹槽加入神經元細胞培養基，并注意使其不與膠質細胞培養基混合，裝置放入細胞培養箱，在37°C，二氧化碳體積濃度5%，培養I小時，使神經元細胞粘附在基底上；
[0074]7)待膠質細胞和神經元細胞完全粘附于基底后，揭掉聚二甲基硅氧烷印章，加入體積比1:1混合的兩種細胞培養液，在37°c，二氧化碳體積濃度5%的細胞培養箱中進行兩種細胞共培養，其中，兩種細胞培養液分別為:含有2% (體積比)神經營養因子B27的Neurobasal培養基和含有10%血清的DMEM/F12培養基，兩種細胞首先在各自限定區域內生長，實現兩種細胞有序粘附于同一基底上；
[0075]然后，膠質細胞開始向神經元細胞方向移動，神經元細胞向各個方向生長出突處，其突處與膠質接觸形成兩種細胞接觸長度不小于1.0厘米的界面，可以用于觀察神經元與膠質細胞相互作用的研究，參見圖2，圖2為本發明提供的神經元細胞與膠質細胞生長的界面。由圖2可知，本發明提供的方法獲得的神經元細胞與膠質細胞有序生長狀態良好。
[0076]實施例2
[0077]I)取直徑25毫米的細胞培養皿，在其底面滴加1.0毫升0.1 %的左旋多聚賴氨酸，孵育1.0小時,將剩余溶液吸去,在用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌3次，晾干,待用；
[0078]2)使用微機械加工技術，在一有機玻璃板上制備至少一組凹型線型微結構單元，該凹型線型微結構單元由從左至右依次排列的三個凹槽組成；其中，所述左側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；所述中間凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為1.1厘米；所述右側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；左側凹槽和中間凹槽、中間凹槽和右側凹槽的距離均為1000微米；
[0079]3)用聚二甲基硅氧烷對步驟2)得到的具有至少一組凹型線型微結構單元的有機玻璃板進行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板，該聚二甲基硅氧烷印章下表面上有微凹槽單元，該微凹槽單元由從左至右依次排列的三條凹槽組成:其中，所述左側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；所述中間凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為1.1厘米；所述右側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；左側凹槽和中間凹槽、中間凹槽和右側凹槽的距離均為1000微米；
[0080]分別去除所述三條凹槽的底面，形成三個橫截面為長方形的通孔，得到聚二甲基硅氧烷印章；其中，所述左側通孔的長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；所述中間通孔的長度為1.8厘米，寬度為1.1厘米；所述右側通孔的長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；第一通孔和第二通孔、第二通孔和第三通孔間的距離均為1000微米；所述三個通孔構成微孔單元，所述微孔單元的長度為2.0厘米，寬度為2.3厘米；
[0081]然后把聚二甲基硅氧烷印章高壓消毒；
[0082]4)將步驟3)經高壓消毒后的無菌聚二甲基硅氧烷印章與步驟I)所述玻璃基底進行接觸并緊密連接，使左側通孔、中間通孔和右側通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；
[0083]5)制備膠質細胞的懸浮溶液，細胞密度為16個/ml，然后把膠質細胞滴加入中間通孔中，注意用移液器將細胞吹散，使膠質細胞均勻分布，在37°C，二氧化碳體積濃度5%的培養箱中培養，使膠質細胞粘附在基底上，每天使用膠質細胞培養基換液一次；
[0084]6)制備神經元的原代細胞懸浮液，細胞密度為15個/ml，第一步培養間隔2天后把神經元細胞滴加入左右兩側通孔中，注意用移液器將細胞吹散，使神經元細胞均勻分布，兩側凹槽加入神經元細胞培養基，并注意使其不與膠質細胞培養基混合，在37°C，二氧化碳體積濃度5%的細胞培養箱中培養I小時，使神經元細胞粘附在基底上；
[0085]7)揭掉聚二甲基硅氧烷印章，將粘附有神經元和膠質細胞的培養皿中加入體積比I: I混合的兩種細胞培養基，在37°C，二氧化碳體積濃度5%的細胞培養箱中進行兩種細胞共培養，其中，兩種細胞培養液分別為:含有2% (體積比)神經營養因子B27的Neurobasal培養基和含有10%血清的DMEM/F12培養基，細胞首先在各自限定區域內生長，完成兩種細胞有序粘附于同一基底上；
[0086]然后，膠質細胞開始向兩側神經元細胞方向移動，兩側神經元細胞向各個方向生長出突處，其突處與中間條帶的膠質接觸形成兩條兩種細胞接觸長度不小于1.8厘米的界面。
[0087]實施例3
[0088]I)取直徑25毫米細胞培養皿，在其底面滴加1.0毫升0.1 %的多聚賴氨酸，孵育1.0小時，將剩余溶液吸去，在用磷酸鹽緩沖液(PH7.4)洗滌3次，晾干，待用；
[0089]2)使用微機械加工技術，在有機玻璃板上制備至少一組凹型線型微結構單元，該凹型線型微結構單元由從左至右依次排列的三個凹槽組成；其中，所述左側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.8厘米；所述中間凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；所述右側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.8厘米；左側凹槽和中間凹槽、中間凹槽和右側凹槽的距離均為500微米；
[0090]3)用聚二甲基硅氧烷對步驟2)得到的具有至少一組凹型線型微結構單元的有機玻璃板進行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板，該聚二甲基硅氧烷印章下表面上有微凹槽單元，該微凹槽單元由從左至右依次排列的兩條凹槽組成；其中，所述左側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.8厘米；所述中間凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.5厘米；所述右側凹槽的橫截面為長方形，長度為1.8厘米，寬度為0.8厘米；左側凹槽和中間凹槽、中間凹槽和右側凹槽的距離均為500微米；
[0091]去除所述三條凹槽的底面，形成三個橫截面為長方形的通孔，得到聚二甲基硅氧烷印章；其中所述左側通孔的長度為1.8厘米，寬度為0.8厘米；所述中間通孔的長度為
1.8厘米，寬度為0.5厘米；所述右側通孔的長度為1.8厘米，寬度為0.8厘米；左側通孔和中間通孔、中間通孔和右側通孔的距離均為500微米；所述三個通孔構成微孔單元，所述微孔單元的長度為1.8厘米，寬度2.2厘米；
[0092]然后把聚二甲基硅氧烷印章高壓消毒；
[0093]4)將步驟3)經高壓消毒后的無菌聚二甲基硅氧烷印章與步驟I)所述玻璃基底進行接觸性連接，使左側通孔、中間通孔和右側通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；
[0094]5)制備膠質細胞的懸浮溶液，細胞密度為16個/ml，然后把膠質細胞滴加入左右兩側通孔中，注意用移液器將細胞吹散，使膠質細胞均勻分布，在37°C，二氧化碳體積濃度5%的培養箱中培養，使膠質細胞粘附在基底上，每天使用膠質細胞培養基換液一次；；
[0095]6)制備神經元的原代細胞懸浮液，細胞密度為15個/ml，第一步培養間隔5天后把神經元細胞滴加入中間微凹槽中，注意用移液器將細胞吹散，使神經元細胞均勻分布，兩側凹槽加入神經元細胞培養基，并注意使其不與膠質細胞培養基混合，在37°C，二氧化碳體積濃度5%的細胞培養箱中培養I小時，使神經元細胞粘附在基底上；
[0096]7)揭掉聚二甲基硅氧烷印章，將粘附有神經元和膠質細胞的培養皿中加入體積比I: I混合的兩種細胞培養基，在37°C，二氧化碳體積濃度5%的細胞培養箱中進行兩種細胞共培養，其中，兩種細胞培養液分別為:含有2% (體積比)神經營養因子B27的Neurobasal培養基和含有10%血清的DMEM/F12培養基，細胞首先在各自限定區域內生長，完成兩種細胞有序粘附于同一基底上；
[0097]然后，膠質細胞開始向神經元細胞方向移動，神經元細胞向各個方向生長出突處，其突處與膠質接觸形成兩條兩種細胞接觸長度不小于1.8厘米的界面。
[0098]比較例I
[0099]按照中國專利CN201010105018.X中實施例1步驟I~6公開的方法制備用于細胞有序共培養的裝置，然后分別制備細胞密度為16個/ml的膠質細胞的懸浮溶液和細胞密度為15個/ml的神經元細胞懸浮液，分別加入第二條微流孔道和第五條微流孔道，將裝置置于細胞培養箱中，37°C、二氧化碳體積濃度5%的條件下培養Ih ；
[0100]揭掉聚二甲基硅氧烷印章，將生長有神經元和膠質細胞的玻璃表面放入體積比1:1混合的兩種細胞培養液中，實驗結果表明，在第二條孔道的出口和入口處膠質細胞密集堆積，在第二條孔道中間部位膠質細胞比較稀疏，并且細胞分布不夠均勻；在第五條孔道的出口和入口處神經元細胞密集堆積，在第五條孔道中間部位膠質細胞比較稀疏，并且細胞分布不夠均勻。
[0101]比較例2
[0102]按照中國專利CN201010105018.X中實施例1步驟I~6公開的方法制備用于細胞有序共培養的裝置，然后分別制備細胞密度為16個/ml的膠質細胞的懸浮溶液加入第二條微流孔道后將裝置置于細胞培養箱中進行第一步培養，37°C、二氧化碳體積濃度5%的條件下培養每天換液4-5次；培養膠質細胞2天后，將神經元細胞加入到第五條微流孔道，置于細胞培養箱中37°C、二氧化碳體積濃度5%的條件下Ih ；
[0103]揭掉聚二甲基硅氧烷印章，將生長有神經元和膠質細胞的玻璃表面放入體積比I: I混合的兩種細胞培養液中，結果表明，膠質細胞生長狀態不好，顯微鏡下觀察到膠質細胞不夠透明，細胞質內容物較多，趨于凋亡。
[0104]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置，其特征在于，包括基底和聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章可移除地復合在所述基底上； 所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽； 所述第一通孔和第二通孔的距離為500 μ m~2000 μ m。
2.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述微孔單元還包括與第一通孔和第二通孔依次排列的至少一個垂直于所述基底的第三通孔。
3.根據權利要求2所述的裝置，其特征在于，所述第三通孔與所述第二通孔的距離為500 μ m ~2000 μ mD
4.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述第一通孔和第二通孔的橫截面為長方形。
5.根據權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述第一通孔橫截面的長為1.0cm~2.0cm,寬為 0.5cm ~2.0cm ； 所述第二通孔橫截面的長為1.0cm~2.0cm,寬為0.5cm~2.0cm。
6.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述基底表面孵育有細胞外基質。
7.一種用于神經元與神經膠質細胞有序共培養的裝置的制備方法，包括: 制備聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔的距離為500 μ m~2000 μ m ； 將所述聚二甲基硅氧烷印章貼附于基底表面，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷印章按照以下方法制備: 采用微機械加工技術在模板上制備至少一個凹形線型微結構單元，所述凹形線型微結構單元包含依次排列的、至少一個第一凹形條和至少一個第二凹型條，所述第一凹型條和第二凹型條的距離為500 μ m~2000 μ m ； 用聚二甲基硅氧烷對所述模板上的凹形線型微結構單元進行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板； 去除所述聚二甲基硅氧烷模板上第一凹型條和第二凹型條的底面，得到聚二甲基硅氧烷印章。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述第一凹型條的橫截面為長方形，長為1.0~2.0cm,寬為0.5~2.0cm ;所述第二凹型條的橫截面為長方形,長為1.0~2.0cm,寬為 0.5 ~2.0cm。
10.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述微孔單元還包括與第一通孔和第二通孔依次排列的至少一個垂直于所述基底的第三通孔。
11.一種神經元細胞與膠質細胞有序共培養的方法，其特征在于，包括: 在基底上孵育細胞外基質； 將聚二甲基硅氧烷印章連接在孵育有細胞外基質的基底上，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一個微孔單元，所述微孔單元包含依次排列的、至少一個垂直于所述基底的第一通孔和至少一個垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分別與基底表面形成一端開口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距離為500 μ m-2000 μ m ； 分別向所述第二通孔中加入神經膠質細胞懸浮溶液和第一通孔中加入神經元原代細胞懸浮液，進行培養； 培養完畢后，去除聚二甲基硅氧烷印章，將表面粘附有神經膠質細胞和神經元細胞的基底進行共培養。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述微孔單元還包括與第一通孔和第二通孔依次排列的至少一個垂直于所述基底的第三通孔； 向所述第二通孔 中加入神經膠質細胞懸浮溶液和向所述第一通孔和第三通孔中加入神經元原代細胞懸浮液，進行培養。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其特征在于，首先加入神經膠質細胞懸浮溶液，進行第一步培養至神經膠質細胞粘附在基底表面； 然后加入神經元原代細胞懸浮液，進行第二步培養至神經元細胞粘附在基底表面。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述神經膠質細胞懸浮溶液的細胞密度為15~17個/mL ;所述神經元原代細胞懸浮液細胞密度為14~16個/mL。
15.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一步培養的時間為0.5h~.1.5h ;所述第二步培養的時間為0.5h~1.5h。
【文檔編號】C12M3/04GK104130943SQ201410363029
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】陳振玲, 劉永鎖, 王妍, 王偉, 于紅燕 申請人:民航總醫院, 中國民用航空局民用航空醫學中心