一種青霉素酰化酶的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種青霉素酰化酶的制備方法，該方法為微生物發酵法，采用大腸桿菌逐級制備一級種子和二級種子，然后使用二級種子在發酵培養基中進行發酵制備得到青霉素酰化酶，制備得到的青霉素酰化酶的活性在40000U/L以上，顯著提高了生產效率。
【專利說明】一種青霉素酰化酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥【技術領域】，具體涉及一種微生物發酵制備青霉素酰化酶的方法。
【背景技術】
[0002] 青霉素酰化酶（penicillin acylase，簡稱PA)又稱為青霉素酰基轉移酶，是 β_內酰胺類抗生素工業生產中較為關鍵的酶，用量很大。
[0003] 青霉素酰化酶既是胞內酶又是胞外酶，可以通過產酶微生物的營養控制代謝及基 因型改變，進行大規模的生產。青霉素酰化酶主要從大腸埃希菌胞內酶和巨大芽孢桿菌胞 外酶獲得，報道最多的是關于埃希氏菌屬大腸桿菌發酵生產青霉素 G酰化酶。近年來的研 究傾向于3個方面：利用物理或化學誘變方法、基因工程方法對產青霉素酰化酶的菌株進 行改造，突變菌種的分離以及酶在不同的產酶宿主細胞中的克隆和表達。如利用紫外光誘 變巨大芽孢桿菌可以獲得酶產量增加4倍的突變菌株，利用重組DNA技術將編碼青霉素酰 化酶的基因導入宿主細胞中，構建了高產分泌型工程菌，但酶的應用性能還有待提升。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種青霉素酰化酶的制備方法，該方法制備得到的青霉素酰 化酶的活性在40000U/L以上。
[0005] 為了實現本發明所述目的，發明人提供了以下技術方案。
[0006] -種青霉素酰化酶的制備方法，包括以下步驟：
[0007] a.取大腸桿菌，在35-40°C條件下制備一級種子和二級種子，所用種子培養基含 有蛋白胨，酵母浸膏，NaCl ;
[0008] b.將步驟a制備的二級種子接種至發酵培養基中，在35_40°C培養15_30h，得到發 酵液，所述發酵培養基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液；
[0009] c.將步驟b制備的發酵液進行離心，棄去上清液，收集下層的菌體濃縮液，即得到 青霉素酰化酶的粗品溶液；
[0010] d.將步驟c所得青霉素酰化酶的粗品溶液進行均質，絮凝，超濾濃縮，沉淀除去雜 蛋白，最后進行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
[0011] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟a中，在37-38°C條件下制備一級種子和 二級種子。
[0012] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟a中，種子培養基含蛋白胨5-10重量份， 酵母浸骨2-5重量份，NaCl 5-10重量份，去尚子水1000重量份。
[0013] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，二級種子的接種量為發酵培養基 體積的3-9%。
[0014] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，二級種子的接種量為發酵培養基 體積的6%。
[0015] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，培養的溫度為37_38°C。
[0016] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，培養的時間為26h。
[0017] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，發酵培養基為每150mL微量元素水 溶液中加入甘油10_20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、NaC15-10g。
[0018] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，所述微量元素水溶液的配比為：每 升去離子水中含有FeCl 3.6 H20 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2.6H20 0.24g，NaMo04.2H200.24g， CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，Η3Β031· 0g，MgS040. 74g。
[0019] 本發明所述方法，步驟a中制備一級種子和二級種子選擇在35_40°C條件下進行， 符合大腸桿菌的生長特性，在此范圍內，菌體的密度會隨著溫度的升高而升高，在37-38°C 是增長的速度最快，隨后增長趨緩。
[0020] 步驟b中選擇的接種比例為3-9%，在此比例范圍內發酵產量與接種量的比較高， 尤其是當二級種子的接種量為發酵培養基體積的6%時，產出接種比最高。
[0021] 步驟b中，二級種子在35-40°C條件下培養種子發酵速度較快，在37-38°C條件下 發酵速度最快，發酵時間在15_30h內，時間太短發酵不充分，時間太長會產生菌體自溶，發 酵時間在26h時發酵效果最好。
[0022] 步驟a中，種子培養基的組成中酵母粉為微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提 供碳源，而NaCl提供無機鹽。這種培養基適于培養細菌。
[0023] 同樣的，步驟b中發酵培養基的組分中酵母粉為微生物提供碳源和能源，蛋白胨 和甘油主要提供碳源，而NaCl提供無機鹽。選取這種培養基有利于菌體生長、代謝產酶。
[0024] 步驟b中微量元素水溶液的加入是為了補充細菌生長所需的無機鹽。
[0025] 本發明所述青霉素酰化酶的制備方法，選擇合適的培養基及培養條件，能夠制備 得到活性在40000U/L以上的青霉素酰化酶，提高了發酵產量，明顯提高了生產效率。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發明所述內容做進一步詳細的說明。
[0027] 實施例1
[0028] 種子培養基的制備：蛋白胨5g，酵母粉2g，NaC15g，去離子水1000g，混合均勻，用 Imol/LNaOH調節pH值至6. 5,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0029] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
[0030] 發酵培養基的配置：甘油l〇g，酵母粉20g，蛋白胨10g，NaCl 5g，150mL微量元素水 溶液，混合均勻，用lmol/L的鹽酸調節pH值至6. 5，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0031] 將購買的大腸桿菌菌種進行活化，在35°C培養6h而后按0. 3%的接種量接種至種 子培養基上進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；將制備的二級種子，按發 酵培養基體積的3%接種量接入發酵培養基中，在35°C培養15h，得到發酵液，即微生物發 酵生產青霉素酰化酶結束；將發酵液離心，收集下層濃縮液（即含菌體部分），即為青霉素 酰化酶粗品溶液，活性為45000u/l。
[0032] 將青霉素酰化酶按照常規操作進行均質，之后加入聚四胺進行絮凝，取上清液進 行超濾濃縮，加入硫酸銨沉淀雜蛋白，最后進行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
[0033] 根據需要，可以將其制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0034] 實施例2
[0035] 種子培養基的制備：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，去離子水1000g，混合均 勻，用lmol/L NaOH調節pH值至7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0036] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
[0037] 發酵培養基的配置：甘油20g，酵母粉30g，蛋白胨20g，NaCl 10g，150mL微量元素 水溶液，混合均勻，用lmol/L鹽酸調節pH值至6.5,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0038] 將購買的大腸桿菌菌種進行活化，在40°C培養12h而后按0. 3%的接種量接種至 種子培養基上進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；將制備的二級種子，按 發酵培養基體積的9%接種量接入發酵培養基中，在40°C培養30h，得到發酵液，即微生物 發酵生產青霉素酰化酶結束；將發酵液離心，收集下層濃縮液（即含菌體部分），即為青霉 素酰化酶粗品溶液，活性為53000U/1。
[0039] 將青霉素酰化酶按照常規操作進行均質，之后加入聚四胺進行絮凝，取上清液進 行超濾濃縮，加入硫酸銨沉淀雜蛋白，最后進行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
[0040] 根據需要，可以將其制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0041] 實施例3
[0042] 種子培養基的制備：蛋白胨8g，酵母浸膏3g，NaC17g，去離子水1000g，混合均勻， 用lmol/L鹽酸調節pH值至7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0043] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
[0044] 發酵培養基的配置：甘油15g，酵母粉25g，蛋白胨15g，NaCl 8g，150mL微量元素水 溶液，混合均勻，用Imol/LNaOH調節pH值至7.0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0045] 將購買的大腸桿菌菌種進行活化，在37°C培養8h而后按0. 3%的接種量接種至種 子培養基上進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；將制備的二級種子，按發 酵培養基體積的6%接種量接入發酵培養基中，在37°C培養26h，得到發酵液，即微生物發 酵生產青霉素酰化酶結束；將發酵液離心，收集下層濃縮液（即含菌體部分），即為青霉素 酰化酶粗品溶液，活性為61000u/l。
[0046] 將青霉素酰化酶按照常規操作進行均質，之后加入聚四胺進行絮凝，取上清液進 行超濾濃縮，加入硫酸銨沉淀雜蛋白，最后進行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
[0047] 根據需要，可以將其制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0048] 實施例4
[0049] 種子培養基的制備：蛋白胨6g，酵母浸膏4g，NaC16g，去離子水1000g，混合均勻， 用Imol/LNaOH調節pH值至6. 5,121 °C高壓蒸汽滅菌30min。
[0050] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
【權利要求】
1. 一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： a. 取大腸桿菌，在35-40°C條件下制備一級種子和二級種子，所用種子培養基含有蛋 白胨，酵母浸膏，NaCl ; b. 將步驟a制備的二級種子接種至發酵培養基中，在35-40°C培養15-30h，得到發酵 液，所述發酵培養基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液； c. 將步驟b制備的發酵液進行離心，棄去上清液，收集下層的菌體濃縮液，即得到青霉 素酰化酶的粗品溶液； d. 將步驟c所得青霉素酰化酶的粗品溶液進行均質，絮凝，超濾濃縮，沉淀除去雜蛋 白，最后進行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
2. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟a中， 在37-38°C條件下制備一級種子和二級種子。
3. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟a中， 種子培養基含蛋白胨5-10重量份，酵母浸膏2-5重量份，NaC15-10重量份，去離子水1000 重量份。
4. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟b中， 二級種子的接種量為發酵培養基體積的3-9%。
5. 根據權利要求4所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟b中， 二級種子的接種量為發酵培養基體積的6%。
6. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟b中， 培養的溫度為37-38°C。
7. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟b中， 培養的時間為26h。
8. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟b中， 發酵培養基為每150mL微量元素水溶液中加入甘油10-20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、 NaCl 5-10g〇
9. 根據權利要求1所述的一種青霉素酰化酶的制備方法，其特征在于，所述步驟b中， 所述微量元素水溶液的配比為：每升去離子水中含有FeCl 3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g〇
【文檔編號】C12N9/10GK104087565SQ201410365989
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】李紅飛, 劉健, 陳英新, 徐永龍, 梅玉龍, 郝金恒, 李銀, 袁國強 申請人:石藥集團中諾藥業（石家莊）有限公司