檢測cyp2c19*2突變位點的方法和寡核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發明提供利用熒光實時PCR技術高靈敏度檢測CYP2C19*2突變位點的方法和寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一對擴增引物SEQNO1和SEQNO2，以及檢測探針SEQNO3和SEQNO4，且將MGB基團修飾于兩條探針的3端，以增加特異性。本發明具有檢測周期短，特異性高，準確度高，靈敏度高，條件依賴少，污染風險低等優點。
【專利說明】檢測CYP2G19*2突變位點的方法和寡核苷酸

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因突變檢測領域，具體涉及利用熒光實時PCR技術高靈敏度檢測 CYP2C1W2突變位點的方法和寡核苷酸。

【背景技術】
[0002] 氯吡格雷（clopidogrel)是心血管疾病中廣泛用于抗血小板的藥物。血 小板激活和聚集是急性冠狀動脈綜合征和冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention, PCI)術后引發動脈血栓形成的關鍵因素。將兩種藥物氯吡格雷和阿司匹林 聯用的抗血小板療法對于急性冠狀動脈綜合征和PCI術后患者至關重要，可以有效預防缺 血事件的發生。然而，接受這種抗血小板療法的治療后，仍有約10%的患者發生支架內血 栓、死亡、卒中等心血管事件，主要由于不同患者個體對于氯吡格雷的反應存在差異，其影 響因素是多方面的，其中基因多態性起著決定性作用。
[0003] 研究發現氯吡格雷在體內通過氧化、水解兩步連鎖反應后形成一種硫醇衍生物， 此衍生物與位于血小板上的二磷酸腺苷（ADP)受體P2Y12不可逆結合，從而阻止ADP對腺 苷酸環化酶的抑制作用，促進血管擴張劑刺激磷蛋白（VASP)的磷酸化，從而起到抑制血小 板聚集的作用。這一過程受細胞色素 P450同工酶系統的調控，包括同工酶CYP1A2、CYP3A 4、CYP2C19等，而CYP2C19在這一過程中起主要作用。同時目前的研究也證實了 CYP2C19存 在基因多態性，并直接影響該酶的活性，因此CYP2C19的基因多態性被認為是氯吡格雷反 應個體差異性的重要決定因素，也是氯吡格雷耐藥性產生的可能機制之一。
[0004] CYP2C19基因位于人類10號染色體上（10q24. 1?10q24. 3)，編碼含450個氨基 酸殘基的CYP2C19同工酶。現已發現CYP2C19至少含有25個等位基因，其中CYP2C19*1為 編碼正常活性酶的基因，編碼的酶缺失活性的等位基因被稱為失功能（loss-of-function) 等位基因。作為最為常見的失功能等位基因，CYP2C19*2是由于CYP2C19基因的5號外顯 子第681位點上的堿基G突變為A而產生的，這一突變導致所編碼酶發生剪接缺陷，喪失活 性。CYP2C19*2在白種人群的基因頻率約為0. 13,非洲人群0. 18,亞洲人群0. 30。
[0005] 目前，按氯吡格雷的藥效差異可將患者分為超速代謝（UM)型、廣泛代謝（EM)型、 中間代謝（IM)型以及低代謝（PM)型4種。IM及PM類型的患者接受氯吡格雷治療后獲得的 療效最差，因而一般而言，這兩類類患者均應該接其它藥物替代的治療方案，例如普拉格 雷，替卡格雷等，而產生這種現象的主要原因就是由于這些患者自身攜帶了 CYP2C19*2突 變基因，從而導致CYP2C19酶活性喪失，影響藥效。
[0006] 因此，了解患者的CYP2C19*2突變位點情況，將有助于臨床醫生判斷是否使用氯 吡格雷進行相關后續治療。
[0007] 目前，臨床對于檢測CYP2C19*2突變位點的方法一般為傳統的DNA測序、熒光實時 PCR和等位基因特異性擴增（ARMS-PCR)。但是傳統的DNA測序方法如Sanger測序和焦磷 酸測序，檢測周期較長，通常需要1?2天，操作復雜，容易污染，而且測序設備昂貴，一般實 驗室難以配置。ARMS-PCR雖然提高了檢測特異性，但是檢測條件要求嚴格，在實際操作中， 容易容易出現引物錯配而產生假陽性。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供檢測CYP2C19*2突變位點的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括 一對擴增引物SEQ NO 1和SEQ N0 2,以及檢測探針SEQ N0 3和SEQ N0 4,其堿基序列如 下所示：
[0009] SEQ NO 1 :5, -GTATMTCAGAGMTTACTACACATG-3' ；
[0010] SEQ N0 2 :5' -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3' ；
[0011] SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ；
[0012] SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
[0013] 進一步地，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用濃度之比為 2:2:l:l〇
[0014] 進一步地，所述一對擴增引物的擴增條件為：95 °C 5min預變性；95 °C 15s， 62°C 30s，40 個循環。
[0015] 本發明的目的還在于提供一種檢測CYP2C19*2突變位點的方法，包括：
[0016] (1)提取樣本中的DNA ;
[0017] ⑵熒光實時PCR擴增反應：在同一個反應管中加入⑴中提取的樣本DNA、一對 擴增引物SEQ NO 1和SEQ N0 2,以及檢測探針SEQ N0 3和SEQ N0 4,進行擴增；
[0018] (3)結果分析：根據擴增反應結果，判斷樣本是否存在CYP2C19*2突變位點，其中，
[0019] SEQ NO 1 :5, -GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3,；
[0020] SEQ N0 2 :5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3' ；
[0021] SEQ NO 3 :FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ;
[0022] SEQ NO 4:HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
[0023] 進一步地，步驟（2)中的擴增反應條件為：95°C 5min預變性；95°C 15s，62°C 30s， 40個循環。
[0024] 進一步地，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用濃度之比為 2:2:1: l〇
[0025] 進一步地，在步驟（3)結果分析中，若樣本只產生一條擴增曲線，則根據相對應的 探針判斷其基因型；若樣本產生兩條擴增曲線，則判定樣本為雜合突變型。
[0026]本發明的目的還在于提供一種檢測CYP2C19*2突變位點的試劑盒，所述試劑盒包 括樣本DNA抽提試劑、檢測體系PCR反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，所述檢 測體系PCR反應液包括一對擴增引物SEQ NO 1和SEQ Ν0 2,以及檢測探針SEQ Ν0 3和SEQ N0 4,其中，
[0027] SEQ NO 1 :5' -GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3,；
[0028] SEQ N0 2 :5' -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,；
[0029] SEQ NO 3 :FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ;
[0030] SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
[0031] 本發明的有益效果：本發明通過設計一對特異性擴增引物及兩條MGB探針， 利用熒光實時PCR(Real-time PCR)技術進行CYP2C19*2突變類型的檢測，并直接根據 Real-time PCR結果圖譜分析該位點基因型，可在同一 PCR反應管中檢測純合突變型，雜合 型，野生型，避免了臨床漏檢，同時將本發明檢測結果與DNA測序結果對比，發現兩者結果 一致，說明本發明具有較高的準確性。
[0032] 此外，MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團（Non-Fluorescent Quencher)，本 身不產生熒光，這使得本底信號產生的熒光干擾大大降低，同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高l〇°C左右，所以在Tm值相同的條件下， MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了合成成本，也使得探針特異性及與 模板的結合成功率大為提高。同時依據3'端末位堿基必須與其模板DNA互補時才能有效 擴增的原理，將MGB探針的3'端設計在CYP2C19*2突變位點上，進一步增強了探針的特異 性和準確性。
[0033] 因此，本發明具有檢測周期短，特異性高，準確度高，條件依賴少，污染風險低等優 點。檢測結果將有助于臨床醫生更好地根據個體差異判斷是否使用氯吡格雷進行相關后續 治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1是樣本A的Real-time PCR檢測結果。
[0035] 圖2是樣本B的Real-time PCR檢測結果。
[0036] 圖3是樣本C的Real-time PCR檢測結果。
[0037] 圖4是樣本A的Sanger測序圖譜。
[0038] 圖5是樣本B的Sanger測序圖譜。
[0039] 圖6是樣本C的Sanger測序圖譜。
[0040] 圖7是MGB探針和常規探針（TAMARA探針）的檢測對比結果。

【具體實施方式】
[0041] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規 條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精 編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0042] 實施例1 :檢測CYP2C19*2突變位點的寡核苷酸和試劑盒
[0043] 檢測CYP2C19*2突變位點的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一對擴增 引物SEQ NO 1和SEQ N0 2,以及檢測探針SEQ N0 3和SEQ N0 4,其堿基序列如下所示：
[0044] SEQ NO 1 :5, -GTATMTCAGAGMTTACTACACATG-3,；
[0045] SEQ N0 2 :5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,；
[0046] SEQ NO 3 :FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ;
[0047] SEQ NO 4 ：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB〇
[0048] 其中SEQ NO 3只能結合野生型CYP2C19*2樣本的DNA模板，SEQ NO 4只能結合 突變型CYP2C19*2樣本的DNA模板。
[0049] 一種檢測CYP2C19*2突變位點的試劑盒，包括樣本DNA抽提試劑、檢測體系PCR反 應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0050] 樣本DNA抽提試劑：可以選擇業內技術人員熟知的提取試劑進行DNA抽提,也可使 用生物技術公司開發的試劑盒（如天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒）來 進打DNA抽提。
[0051] 檢測體系PCR反應液包括2*qPCR MIX(購自τ〇γ〇Β〇生物科技有限公司）、 5〇*ROX(購自ΤΟΥΟΒΟ生物科技有限公司）、ddH2〇、一對擴增引物SEq NO 1 (1〇禮）和SEQ N〇2(10mM)以及兩條檢測探針 SEQ NO 3(10mM)和 SEQ NO 4a〇mMh
[0052] 陽性對照品：含有CYP2C19*2突變位點的DNA序列溶液。
[0053]陰性對照品：不含有CYP2C19*2突變位點的DNA序列溶液。
[0054] 空白對照品：2 μ 1生理鹽水或不加任何物質。
[0055] 檢測體系PCR反應液試劑配制如下：
[0056]
[0057]

【權利要求】
1. 檢測CYP2C19*2突變位點的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一對擴增引 物SEQ NO 1和SEQ NO 2,以及檢測探針SEQ NO 3和SEQ NO 4,其堿基序列如下所示： SEQ NO 1 ：5, - GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3,； SEQ NO 2 ：5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,； SEQ NO 3 ：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ； SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
2. 如權利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用濃度之比為2:2:1:1。
3. 如權利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述一對擴增引物的擴增條件為：95°C 5min 預變性；95°C 15s，62°C 30s，40 個循環。
4. 一種檢測CYP2C19*2突變位點的方法，包括： (1) 提取樣本中的DNA ; (2) 熒光實時PCR擴增反應：在同一個反應管中加入（1)中提取的樣本DNA、一對擴增 引物SEQ NO 1和SEQ NO 2,以及檢測探針SEQ NO 3和SEQ NO 4,進行擴增； (3) 結果分析：根據擴增反應結果，判斷樣本是否存在CYP2C19*2突變位點，其特征在 于： SEQ NO 1 ：5, - GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3,； SEQ NO 2 ：5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,； SEQ NO 3 ：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ； SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（2)中的擴增反應條件為：95°C 5min 預變性；95°C 15s，62°C 30s，40 個循環。
6. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用濃度之比為2:2:1:1。
7. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟（3)結果分析中，若樣本只產生一條 擴增曲線，則根據相對應的探針判斷其基因型；若樣本產生兩條擴增曲線，則判定樣本為雜 合突變型。
8. -種檢測CYP2C19*2突變位點的試劑盒，所述試劑盒包括樣本DNA抽提試劑、檢測體 系PCR反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，所述檢測體系PCR反應液包括一對 擴增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2,以及檢測探針SEQ NO 3和SEQ NO 4,其特征在于， SEQ NO 1：5, - GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3,； SEQ NO 2 ：5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,； SEQ NO 3 ：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ； SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
【文檔編號】C12N15/11GK104232757SQ201410366181
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】陳奕磊, 周曉犢 申請人:杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司