一種高產沒食子酸脫羧酶(gad)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法：從9種微生物中，通過底物誘導篩選出高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的產氣腸桿菌(Enterobacer?aerogenes)菌株；經過考察發酵時間、接種量、發酵溫度、底物濃度、初始發酵液pH值等單因子以及3因素3水平的響應面分析和模型修正，確定該降解菌株的最佳發酵條件，并進行驗證；再通過溶劑萃取和中壓柱分離，得到質量分數98％以上的焦性沒食子酸，為微生物法降解沒食子酸生產焦性沒食子酸的工業化生產提供一定的實踐基礎。
【專利說明】一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及微生物降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法。

二、【背景技術】
[0002]五倍子富含沒食子單寧，由沒食子酸與不同構型的葡萄糖結合的混合物，以五倍酰葡萄糖為核心，在C2、C3、C4位以縮酚鍵連接不同數目的倍酰基結構。沒食子單寧通過化學法水解或生物法在單寧酶(tannase)的作用下發生降解生成沒食子酸；沒食子酸再經過化學法脫羧或在沒食子酸脫羧酶(gallic acid decarboxylases, GAD)的作用下發生脫羧反應生成焦性沒食子酸(如圖1所示)。焦性沒食子酸(1，2，3-三羥基苯)作為一種多元酚，在工業上具有廣泛的用途。在攝影行業中，焦性沒食子酸可以作為顯影劑使膠片成像；在燃料工業上，焦性沒食子酸與二羥代苯砜縮合產物是染制皮毛、皮革的優良染料；在醫藥工業中，焦性沒食子酸可作為輔酶-QlO的抗氧化穩定劑，是重要的醫藥中間體；分析化學中，在重量分析上用以測定鉍及銻，并用作磷鎢酸的還原劑，紅外線照相術的熱敏劑，也是煤氣、煙道氣、煉焦煤氣、水煤氣等氣體的除氧劑。
[0003]
[0004]
[0005]目前工業上主要通過化學法，將沒食子酸在在6N HCl的作用下催化脫羧生產焦性沒食子酸，但由于產生大量高濃度鹽和高色度的廢酸水，造成嚴重的環境污染問題和設備腐蝕等問題，急需開發環境友好和反應溫和的微生物制備新工藝，關鍵在于產高活性沒食子酸脫羧酶菌株及其降解工藝的優選。由于相較化學法，利用GAD來降解沒食子酸生產焦性沒食子酸的收率并不高，國內的研究基本上屬于空白，國外雖然早在上世紀60年代就有相應的研究，但目前已發現可有高效降解效果的菌株仍然很少，但目前已發現可有高效降解效果的菌株仍然很少，諸如克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等。研究發現,某些微生物菌種可以產生脫羧酶而將多羥基苯甲酸羧基脫去；某些微生物菌種可以在特定的培養基上產生高活性沒食子酸脫羧酶(GAD)，將沒食子酸降解成焦性沒食子酸。Hajim等利用檸檬菌株(C.sp.64-1)，在厭氧條件下降解沒食子酸生產焦性沒食子酸，產率達到97.4%。Kumar等采用固定檸檬酸桿菌(C.freundii)生物反應，進行連續發酵沒食子酸，焦性沒食子酸的產率達到98.5%。Soni等從印度Rfjasthan地區的土壤中利用EDAE纖維素離子交換柱和交聯葡萄糖G-50凝膠過濾色譜分離得到了一種腸桿菌(E.spp.)，該細菌可以產高活性沒食子酸脫羧酶(GAD)，焦性沒食子酸產率14.48%。Spiros等利用基因工程菌將葡萄糖生物合成沒食子酸和焦性沒食子酸，來代替生物催化生產焦性沒食子酸的方法，產率可達93~97%。Grant利用產氣桿菌研究了非氧化脫羧酶對多羥基苯甲酸的脫羧作用及部分脫羧酶的性質，主要是鄰苯二酚、間苯二酚母核結構型多羥基苯甲酸和氨基苯甲酸的脫羧，微生物為黑曲霉菌、產氣桿菌、假單胞菌、大腸桿菌等。目前已從多種細菌中分離得到沒食子酸脫羧酶，如成團泛菌(P.agglomerans T71)、檸檬酸桿菌(C.freundii TB3)、檸檬酸桿菌(C.sp.64-1)、腸桿菌屬(E.Spp),除細菌外還發現一株酵母菌(R.Glutinis)也可以產生沒食子酸脫羧酶。

三、
【發明內容】

[0006]本發明的目的在于將負壓空化和負壓微波噴霧干燥技術應用于中藥五倍子提取中，通過對負壓空
[0007]本發明的目的在于提供一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，本發明的技術方案是采用如下步驟來實現:
[0008]第一步，培養基制備
[0009](I)種子培養基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為種子培養基；
[0010](2)試管斜面保藏培養基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g,在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為試管斜面保藏培養基；
[0011](3)發酵培養基成團泛菌發酵培養基:0.3%沒食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、0.001% FeSO4.7Η20、0.I % KH2PO4^0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏檸檬酸桿菌發酵培養基:2.0%沒食子酸、0.2% (NH4)2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌發酵培養基:1.0 %沒食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、
2.0% (NH4)2SO4^0.8M 飽和 Na2B4O7.1H2 水溶液、0.5M Na2HPO4.12H20 緩沖溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2HPO4.Iffi2O 或者 4.969g Na2HPO4 與 2.340g NaH2PO4.2H20 溶于 10mL 蒸餾水制得)；氧化還原真桿菌發酵培養基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %細菌瓊脂粉、0.2%沒食子酸；植物乳桿菌、解沒食子酸鏈球菌發酵培養基:包含5.0%去纖維蛋白的馬血、20mM沒食子酸的肉湯培養基；黏紅酵母菌發酵培養基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM沒食子酸、0.5%酵母提取物；腸桿菌屬、產氣腸桿菌屬發酵培養基:0.06% MgSO4.7H20、0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%沒食子酸、0.5%麥芽糖并取30mM pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，其中沒食子酸于100°C下滅菌5min，麥芽糖于115°C下滅菌30min，其余成分在121°C下滅菌20min，制備發酵培養基。
[0012]第二步，高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種篩選
[0013]初篩的方法:將培養好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等菌液,分別放入相應的發酵培養基中培養發酵，如腸桿菌屬(E.sp.)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)的發酵培養基如第一步中所示，溫度30~37°C，每隔12h取樣一次，然后取用3倍體積的乙醚萃取發酵液3次，合并萃取液、減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，經TLC和HPLC分析沒食子酸和焦性沒食子酸，篩選出高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和黏紅酵母菌(R.glutinis)。
[0014]第三步，菌種底物誘導
[0015]配制CDM缺碳培養基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及 30mMpH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將培養好的斜面菌種以無菌操作取兩環，轉接到250mL搖瓶(裝液量10mL) CDM培養基中，在水浴溫度為25~30°C，轉速為180~200r/min的搖床中培養，每12h取樣一次，HPLC檢測培養發酵液中沒食子酸和焦性沒食子酸；
[0016]第四步，種子液制備及發酵培養
[0017]將培養好的斜面菌種以無菌操作取五環，轉接到250mL搖瓶(裝液量10mL)種子培養基中，溫度30~40°C，靜置培養6~8h，將培養好的種子液按照4~6%接種量，轉接到發酵培養基中，溫度30~35°C，180~200r/min搖床培養50~70h ；
[0018]第五步，搖瓶生理脅迫培養及響應面優化
[0019]通過考察接種量、發酵時間、磷酸鹽濃度、底物濃度、發酵溫度、發酵液起始pH值等因素對焦性沒食子酸的收率的單因素影響，采用Box-Behnken實驗設計進行3因素(底物濃度、發酵溫度、發酵液起始PH值)3水平的響應面優化，并進行驗證。
[0020]第六步，發酵液中焦性沒食子酸提取
[0021]取第五步最佳工藝條件下發酵液原液，于6000r/min條件下離心20min，取上清液用其體積3倍的有機溶劑萃取3次，合并萃取相、濃縮，得焦性沒食子酸濃縮物；
[0022]第七步，中壓柱分離制備
[0023]將焦性沒食子酸濃縮物與中壓柱填料按質量比1: 10~30吸附，洗脫劑為氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的一種或幾種的混合溶液，中壓柱柱長20~300cm，柱直徑2~30cm，柱壓為3~lOMPa，檢測波長220~360nm，流速2~100mL/min，富集焦性沒食子酸，室溫真空同收溶劑，經HPLC分析，制備得到98%以上焦性沒食子酸；
[0024]本專利采用克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、大腸桿菌(E.coli)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis) 10種菌種進行篩選,配制不同的培養基，如產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.) CDM缺碳培養基為0.06 % MgSO4.7H20、
0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及30mM pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液；弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii) CDM 缺碳培養基為 2.0 % 沒食子酸，0.2 % (NH4)2HP04,0.1 % KH2PO4,0.05%MgSO4.7Η20，0.05%酵母提取物。在培養48h后產生了焦性沒食子酸，通過初選，TLC和HPLC檢測，選出具有高產沒食子酸脫羧酶(GAD)產氣腸桿菌(E.aerogenes),腸桿菌為(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌為(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌為(S.gallolyticus)，黏紅酵母菌為(R.glutinis)。
[0025]本發明采用pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，隨著初始pH值的上升，焦性沒食子酸的收率不斷下降，當初始PH值為6.0時最大收率76.21 %，當初始pH值小于5.4和大于7.6時，均并未檢測出焦性沒食子酸，培養基pH值對菌種的影響很大。單因素實驗中，過高或者過低的初始PH值的培養基下，都不會使沒食子酸降解產生焦性沒食子酸，因此實驗的最適初始PH值選擇在5.6~6.0之間。而沒食子酸的降解率則隨著pH值的增加呈現先增加后平穩的趨勢，說明整個過程中在PH值較低時沒食子酸的主要降解產物為焦性沒食子酸，而隨著PH值的增加，沒食子酸其他的降解產物也逐漸生成，故在焦性沒食子酸的收率下降的時候沒食子酸的降解率仍然很高。
[0026]本發明發酵培養溫度25~40°C，優選25~35°C，發酵溫度達到35°C時，收率達到最大值為63.56%，隨著溫度的繼續升高，過高的溫度破壞了酶的產生的環境以及所產生的GAD的本身的穩定性，在溫度為45~50°C時收率下降，整個過程與沒食子酸的降解率呈相同的趨勢。
[0027]本發明在180~300r/min搖床培養，優選180~220r/min。在培養4~6h時，高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種處于對數生長期，將此時間段的細菌接種到發酵培養基中，細菌適應新環境所需的調整期會大大縮短，同時提高細菌在新的培養基中的成活率，本發明優選培養5h的菌種接種到發酵培養基中，在往復式水浴恒溫振蕩器中以180r/min的振蕩速度恒溫培養后，將發酵液萃取、濃縮之后HPLC檢測分析，沒食子酸的轉化率97%以上，焦性沒食子酸收率60~80%。
[0028]本發明發酵采用0.2~0.5%沒食子酸為底物濃度，隨著底物濃度的增加，沒食子酸的降解率隨著底物濃度的增加而增加，過高的底物濃度會對培養基的PH值改變較大，從而抑制細菌的生長或者其所產生的GAD的活性。因此優選底物濃度為0.4%為宜。
[0029]本發明采用搖瓶生理脅迫培養及響應面優化發酵工藝,采用Box-Behnken實驗設計進行3因素(底物濃度0.3%、0.4%、0.5% ;發酵溫度25°C、30°C、35°C ;初始pH值
5.6、6.0、6.4) 3水平的響應面優化，并進行驗證實驗。利用Design Expert軟件,進行多元線性回歸擬合，獲得焦性沒食子酸的收率對編碼自變量的二次多項回歸方程為:Y =68.63-8.68ΧΧΑ11.80ΧΧ2_18.26XX3+20.STXX1XX2-?.QeXX1XX3+^.80ΧΧ2ΧΧ3_6.46ΧΧ/-23.69ΧΧ22-10.91 XX12XXjH.SSXX12XX3-?.62 X X1X X22
[0030]對響應面結果利用軟件進行最優化分析，確定最優條件如下:發酵溫度31.58°C，發酵液初始pH值為6.07，底物濃度為0.32%，在該條件下的預測值為80.0222%。為了方便操作，將發酵溫度調整為32°C，發酵液初始pH值調整為6.0，底物濃度調整為0.32%，在此工藝條件下進行3次平行實驗，得到的焦性沒食子酸的平均得率為77.86% (RSD =1.21% )與預測值相差2.70%，說明吻合性良好，驗證所建模型的正確性。
[0031]本發明采用HPLC分析焦性沒食子酸，色譜柱Thermo 0DS-2C18 (5 μ m250X4.6mm)分離柱，流動相為甲醇-水(含0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通過0.45 μ m孔徑濾膜過濾，流速lmL/min，檢測波長263nm，檢測器PDA 二極管陣列檢測器，室溫。焦性沒食子酸收率利用焦性沒食子酸標準品(純度>99.5%)繪制標準曲線，其保留時間分別為:
3.443min，焦性沒食子酸標準曲線為y = 1318523.5x+6474.1，相關系數R = 0.99951。分析時以焦性沒食子酸的收率為指標，其計算公式為:
[0032]焦性沒食子酸收率y = (5Xc/Vl) X v0/m0X 100% ；
[0033]式中
[0034]vl:萃取體積；v0:發酵液實際體積；m0:焦性沒食子酸的理論產量；c =HPLC檢測時的焦性沒食子酸濃度，由其標準曲線算出；數字5:進行檢測的萃取液濃縮后用5mL流動相溶解的。
[0035]本發明采用有機溶劑萃取發酵液中的焦性沒食子酸，選擇乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I種或任2種混合溶劑，優選乙醚和乙酸乙酯。采用中壓柱分離純化萃取物中焦性沒食子酸。中壓柱填料選擇200~300目的硅膠和氧化鋁中的I種或2種任意比，洗脫劑為叔丁基甲醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇中的I種或幾種的混合溶液，優選氯仿:甲醇=50: 1-10 (v/v)混合溶劑。填料也可選擇孔徑為60A，40~60μπι的ODS C18、C8和SephedexLH-20材料，洗脫劑為甲醇、乙醇和水中的I種或幾種的混合溶液，優選I~20%的甲醇水溶液。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0036]附圖1為焦性沒食子酸制備路線；
附圖2為菌種篩選過程中產氣腸桿菌降解沒食子酸生產焦性沒食子酸的HPLC檢測圖；
[0037]附圖3為接種量對焦性沒食子酸收率的影響圖；
[0038]附圖4為底物濃度對焦性沒食子酸收率的影響圖；
[0039]附圖5為磷酸鹽緩沖溶液含量對焦性沒食子酸收率的影響圖；
[0040]附圖6為發酵時間對焦性沒食子酸收率的影響；
[0041]附圖7為發酵溫度對焦性沒食子酸收率的影響；
[0042]附圖8為初始pH對焦性沒食子酸收率的影響。

【具體實施方式】
[0043]以下實施例為本發明的一些舉例，不應被看做是對本發明的限定。
[0044]實施例1沒食子酸和焦性沒食子酸的HPLC分析及計算方法
[0045]準確稱取10mg的焦性沒食子酸標準品流動相溶解，于10mL容量瓶中定容。分別取2、4、6、8、10mL至1mL的容量瓶中定容，得0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mg/mL的標準溶液。然后在流動相為:甲醇:水(0.5%醋酸水)=37: 63的條件下，于高效液相分析儀中檢測。采用HPLC分析焦性沒食子酸，色譜柱Thermo 0DS-2C18 (5 μ m250X4.6mm)分離柱，流動相為甲醇-水(含0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通過0.45 μ m孔徑濾膜過濾，流速ImL/min,檢測波長263nm，檢測器PDA 二極管陣列檢測器，室溫。焦性沒食子酸收率利用焦性沒食子酸標準品(純度>99.5%)繪制標準曲線，其保留時間分別為:3.443min，焦性沒食子酸標準曲線為I = 1318523.5X+6474.1，相關系數R = 0.99951。分析時以焦性沒食子酸的收率為指標，其計算公式為:
[0046]焦性沒食子酸收率y = (5Xc/n,) X v0/m0X 100% ；
[0047]式中
[0048]vl:萃取體積；v0:發酵液實際體積；m0:焦性沒食子酸的理論產量；c =HPLC檢測時的焦性沒食子酸濃度，由其標準曲線算出；數字5:進行檢測的萃取液濃縮后用5mL流動相溶解的。
[0049]實施例2.焦性沒食子酸的制備方法
[0050]第一步，培養基制備
[0051](I)種子培養基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為種子培養基；
[0052](2)試管斜面保藏培養基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g,在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為試管斜面保藏培養基；
[0053](3)發酵培養基成團泛菌發酵培養基:0.3%沒食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、0.001% FeSO4.7Η20、0.I % KH2PO4^0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏檸檬酸桿菌發酵培養基:2.0%沒食子酸、0.2% (NH4)2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌發酵培養基:1.0 %沒食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、
2.0% (NH4)2SO4^0.8M 飽和 Na2B4O7.1H2O 水溶液、0.5M Na2HPCM.12H20 緩沖溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2HPO4.12H20 或者 4.969g Na2HPO4 與 2.340g NaH2P04.2Η20 溶于 10mL 蒸餾水制得)；氧化還原真桿菌發酵培養基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %細菌瓊脂粉、
0.2%沒食子酸；植物乳桿菌、解沒食子酸鏈球菌發酵培養基:包含5.0%去纖維蛋白的馬血、20mM沒食子酸的肉湯培養基；黏紅酵母菌發酵培養基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM沒食子酸、0.5%酵母提取物；腸桿菌屬、產氣腸桿菌屬發酵培養基:0.06% MgSO4.7H20、
0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%沒食子酸、0.5%麥芽糖并取30mM pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，其中沒食子酸于100°C下滅菌5min，麥芽糖于115°C下滅菌30min，其余成分在121°C下滅菌20min， 制備發酵培養基。
[0054]第二步，高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種篩選
[0055]初篩的方法:將培養好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等菌液,分別放入相應的發酵培養基中培養發酵，如腸桿菌屬(E.sp.)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)的發酵培養基如第一步中所示，溫度30~37°C，每隔12h取樣一次，然后取用3倍體積的乙酸乙酯萃取發酵液3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，經TLC和HPLC分析沒食子酸和焦性沒食子酸，篩選出高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和黏紅酵母菌(R.glutinis)。
[0056]第三步，菌種底物誘導
[0057]配制CDM缺碳培養基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及 30mMpH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將培養好的斜面菌種以無菌操作取兩環，轉接到250mL搖瓶(裝液量10mL) CDM培養基中，在水浴溫度為25~30°C，轉速為180~200r/min的搖床中培養，每12h取樣一次，HPLC檢測培養發酵液中沒食子酸和焦性沒食子酸；
[0058]第四步，種子液制備及發酵培養
[0059]將培養好的斜面菌種以無菌操作取五環，轉接到250mL搖瓶(裝液量10mL)種子培養基中，溫度30~40°C，靜置培養6~8h，將培養好的種子液按照4~6%接種量，轉接到發酵培養基中，溫度30~35°C，180~200r/min搖床培養50~70h ；
[0060]第五步，搖瓶生理脅迫培養及響應面優化
[0061]通過考察接種量、發酵時間、磷酸鹽濃度、底物濃度、發酵溫度、發酵液起始pH值等因素對焦性沒食子酸的收率的單因素影響，采用Box-Behnken實驗設計進行3因素(底物濃度、發酵溫度、發酵液起始PH值)3水平的響應面優化，并進行驗證。
[0062]第六步，發酵液中焦性沒食子酸提取
[0063]取第五步最佳工藝條件下發酵液原液，于6000r/min條件下離心20min，取上清液用其體積3倍的有機溶劑萃取3次，合并萃取相、濃縮，得焦性沒食子酸濃縮物；
[0064]第七步，中壓柱分離制備
[0065]將焦性沒食子酸濃縮物與中壓柱填料按質量比1: 10~30吸附，洗脫劑為甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的I種或幾種的混合溶液，中壓柱柱長20~300cm,柱直徑2~30cm,柱壓為3~1MPa,檢測波長220~360nm,流速2~lOOmL/min,富集焦性沒食子酸，室溫真空回收溶劑，經HPLC分析，制備得到98%以上焦性沒食子酸；
[0066]本實施配制不同的培養基，如產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)CDM缺碳培養基為 0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4'0.2%沒食子酸及 30mM pH 值為 6.6 的磷酸鹽緩沖溶液；弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii) CDM缺碳培養基為2.0 %沒食子酸，0.2%(NH4)2HPO4,0.1 % KH2PO470.05 % MgSO4.7H20，0.05 % 酵母提取物。在進行培養 48h 后產生了焦性沒食子酸，通過初選，TLC(條件為:展開劑為乙醚:乙醇=7: 3 ;顯色劑:碘蒸氣)和HPLC檢測，選出具有高產沒食子酸脫羧酶(GAD)產氣腸桿菌(E.aerogenes)，腸桿菌(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus),黏紅酵母菌(R.glutinis)。
[0067]本實施采用pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，優選5.6~6.0，發酵培養溫度25~40°C，優選25~35°C，發酵溫度達到35°C時，在180~300rpm搖床培養，優選180~220rpm。在培養4~6h時，高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的菌種處于對數生長期，將此時間段的細菌接種到發酵培養基中，細菌適應新環境所需的調整期會大大縮短，同時提高細菌在新的培養基中的成活率，本發明優選培養5h的菌種接種到發酵培養基中，在往復式水浴恒溫振蕩器中以180r/min的振蕩速度恒溫培養后，將發酵液萃取、濃縮之后HPLC檢測分析，沒食子酸的轉化率97%以上，焦性沒食子酸收率60~80%。
[0068]本實例發酵采用0.2~0.5%沒食子酸為底物濃度，優選0.4%。采用搖瓶生理脅迫培養及響應面優化發酵工藝，采用Box-Behnken實驗設計進行3因素(底物濃度0.3%,
0.4%,0.5% ;發酵溫度25°C、30°C、35°C ;初始pH值5.6、6.0、6.4) 3水平的響應面優化，并進行驗證實驗。
[0069] 本實例采用有機溶劑萃取發酵液中的焦性沒食子酸，選擇乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I種或任2種混合溶劑，優選乙醚和乙醇。采用中壓柱分離純化萃取物中焦性沒食子酸。中壓柱填料選擇200~300目的硅膠和氧化鋁中的I種或2種任意比，洗脫劑為甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇和乙醇中的一種或幾種的混合溶液，優選甲基叔丁基醚:甲醇=50:1~30 (v/v)混合溶劑。填料也可選擇孔徑為60A, 40~60 μ m的ODS C18、C8和S^hedex LH-20材料，洗脫劑為乙酸乙酯、乙醚和乙醇中的一種或幾種的混合溶液，優選I~20%的乙醇水溶液。
[0070]實施例3.發酵單因素工藝
[0071](I)接種量對于焦性沒食子酸收率的影響
[0072]配制CDM培養基，組成為0.2%沒食子酸，0.5 %麥芽糖，0.06 % Mg (SO4) 2，0.4 %(NH4)2S04，30mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.6)，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，分別混合裝到11瓶250mL的三角燒瓶里，在雙人單面凈化工作臺中用移液槍分別接入
0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL菌液，然后放入轉速180r/min、溫度30V的往復式水浴恒溫搖床中發酵60h。將上述發酵好的11瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL。將取樣后的菌液放入離心機中，在轉速為6000r/min的條件下分離20min。分離好的菌液用乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL。再用旋轉蒸發器進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后進樣HPLC檢測分析。結果見附圖3，可以發現:隨著接種量的增加，焦性沒食子酸的收率在不斷的增加，當接種量達到5%時焦性沒食子酸收率為48.97%，此后焦性沒食子酸的收率趨于穩定；當接種量為8%時收率達到最大為49.99%，但從經濟效益考慮選擇5%接種量為宜。
[0073](2)底物濃度對于焦性沒食子酸收率的影響
[0074]配制CDM 培養基，組成為 0.5%麥芽糖，0.06% Mg(SO4)2,0.4% (NH4)2S04，30mM 磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.6)，沒食子酸含量分為0,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%,
0.7%,0.8%,0.9%Λ.0%,2.0%,2.5%等13種不同含量，將沒食子酸分別放入250mL的三角燒瓶里。分開滅菌后，分別接入5mL菌液于13瓶三角燒瓶中，然后放入轉速180r/min、溫度30°C的往復式水浴恒溫搖床中發酵60h,分別取樣20mL,在轉速為6000r/min的條件下離心20min ;然后，乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結果見附圖4，可以發現:隨著底物濃度的增加焦性沒食子酸的收率不斷上升，當底物濃度為0.4%時，焦性沒食子酸的收率達到57.98%，此后趨于平穩；當底物濃度為0.7%時，收率達到最大為65.27%，但從經濟效益考慮選擇底物濃度為0.4%為宜；當底物濃度為0.8、0.9、1.0%時未檢測出焦性沒食子酸，原因是因為沒食子酸本身作為一種酸對培養基的PH的存在影響，過高的底物濃度會對培養基的pH改變較大，從而抑制了產氣腸桿菌產生GAD，這樣就無法降解沒食子酸產生焦性沒食子酸。
[0075](3)磷酸鹽緩沖溶液的含量對于焦性沒食子酸收率的影響
[0076]配制CDM培養基，組成為0.4%沒食子酸，0.5 %麥芽糖，0.06 % Mg (SO4) 2，0.4 %(NH4)2S04，10、30、50、70、90、110mM磷酸鹽緩沖溶液各兩個，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，分別混合裝到12瓶250mL的三角燒瓶里，分別接入5mL菌液于12瓶三角燒瓶中，然后放入轉速180r/min、溫度30°C的往復式水浴恒溫搖床中發酵60h。取樣20mL,在轉速為6000r/min的條件下離心20min,然后用乙醚萃取兩次,每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結果見附圖5，可以發現:隨著磷酸鹽緩沖溶液體積的上升，焦性沒食子酸的收率呈先上升后下降的趨勢，當磷酸鹽緩沖溶液含量為70mM時收率達到最大為56.39%。當磷酸鹽緩沖溶液含量為10、30mM時未檢測出焦性沒食子酸，可能是由于磷酸鹽緩沖溶液主要作用是調節平衡培養基的PH，所以過少的磷酸鹽無法發揮作用，在培養基滅菌和在后續的培養過程中由于菌種本身的發酵使得培養基的PH改變較大卻無法平衡，故導致較少的磷酸鹽緩沖溶液沒有焦性沒食子酸的產生。當磷酸鹽溶液含量大于70mM時，由于高濃度磷酸鹽對培養基溶液的鹽濃度的改變，使得菌種細胞膜的通透性發生了相應的改變，從而導致了整體上菌種活性的下降，如細胞產生GAD的減少，故隨著磷酸鹽含量的增加，焦性沒食子酸的收率逐漸下降。因此，綜合考慮，在實際的后續試驗中選擇50mM的磷酸鹽緩沖溶液的含量作為最佳選擇。
[0077](4)發酵時間對于焦性沒食子酸收率的影響
[0078]配制CDM培養基，組成為0.4%沒食子酸，0.5%麥芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4) 2S04，70mM磷酸鹽緩沖溶液，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，混合裝到13瓶250mL的三角燒瓶里，分別接入5mL菌液，然后放入轉速180r/min、溫度30°C的往復式水浴恒溫搖床中分別發酵0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132h。將上述發酵好的13瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL，在轉速為6000r/min的條件下離心20min ;然后，用乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結果見附圖6，可以發現:隨著發酵時間的增加，焦性沒食子酸的收率呈先上升后下降的趨勢，并且在24~48h和72~120h趨于穩定，當發酵時間達到60h時焦性沒食子酸收率達到最大為63.41%。當發酵時間小于60h時由于菌種本身接種到一個新的培養基上需要一定的時間進行調整，因此在發酵開始的時候隨著時間的延長，焦性沒食子酸的收率越來越大；當發酵時間大于72~120h時由于菌種經歷了調整期、增長期開始進入穩定期，因此這個過程中，菌種數量上基本上變化不大，因此這個過程中的焦性沒食子酸的收率基本上趨于穩定；120h之后菌種逐步進入到衰亡期，培養基的內部環境也由于發酵等原因，如PH和營養物質開始大量減少，因此這個過程中的焦性沒食子酸的收率是逐漸下降的。
[0079](5)發酵溫度對于焦性沒食子酸收率的影響
[0080]配制CDM培養基，組成為0.4%沒食子酸，0.5%麥芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4) 2S04，35mL磷酸鹽緩沖溶液，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后，混合裝到21瓶250mL的三角燒瓶里，分別接入5mL菌液。每3瓶三角燒瓶為一組，放入轉速180r/min往復式水浴恒溫搖床中在溫度分別為20、25、30、35、40、45、50°C的條件下發酵60h。將上述發酵好的14瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL，，在轉速為6000r/min的條件下離心20min ;然后,用乙醚萃取兩次,每次乙醚用量30mL ;再進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。結果見附圖7，可以發現:剛開始隨著溫度的上升焦性沒食子酸的收率變化并不大，當溫度達到35°C時，收率達到最大值為63.56%,隨著溫度的繼續升高，收率在下降，在溫度為45、50°C時未檢測出焦性沒食子酸。原因是過高的溫度破壞了酶的產生的環境以及所產生的GAD的本身的穩定性，因此后續試驗中45、50°C時菌種無法降解沒食子酸產生焦性沒食子酸。
[0081](6)初始pH值對于焦性沒食子酸收率的影響
[0082]配制CDM培養基，組成為0.4%沒食子酸，0.5%麥芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4)2S04，35mL磷酸鹽緩沖溶液，將沒食子酸、麥芽糖以及剩余鹽溶液分開滅菌后(滅菌條件參考2.3.3)，混合裝到12瓶250mL的三角燒瓶里。每3瓶為一組，分別調pH為5.6、6.0、6.4、6.8。在雙人單面凈化工作臺中用移液槍分別接入5mL備用菌液于12瓶三角燒瓶中。然后放入轉速180r/min、溫度30°C的往復式水浴恒溫搖床中分別發酵60h。將上述發酵好的12瓶三角燒瓶取出至雙人單面凈化工作臺中，每瓶取樣20mL。將取樣后的菌液放入離心機中，在轉速為6000r/min的條件下分離20min。分離好的菌液用乙醚萃取兩次，每次乙醚用量30mL。再用旋轉蒸發器進行濃縮，得到焦性沒食子酸樣品。結果見附圖8，可以發現:樣品用5mL流動相溶解，然后用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾至1mL的一次性離心管中，最后HPLC檢測分析。隨著初始pH的上升，焦性沒食子酸的收率不斷下降，最大值為初始pH5.6時的70.79%，最小值為pH6.8時的29.27%，當初始pH為5.2和7.2時，并未檢測出焦性沒食子酸。由上述表圖可以看出，培養基PH對菌種的影響是很大的，因此在此單因素實驗中，過高或者過低的初始pH的培養基下，都不會使沒食子酸降解產生焦性沒食子酸，因此實驗的最適初始pH可以選擇在5.6~6.0。
[0083]實施例4.響應面優化工藝
[0084]在上述單因素結果中，可以發現微生物降解過程中底物濃度、pH值、溫度三個因素，各個因素之間有較大的相互影響，另外底物沒食子酸，本身作為一種酸，對發酵液的PH值的也有一定的影響。因此，為了更進一步的了解各個因素對焦性沒食子酸收率的影響，該實驗部分利用Box-Behnken實驗設計進行3因素3水平的響應面分析，建立分析模型，找到收率最大的區域。
[0085]表1響應面分析實驗因素水平
[0086]

【權利要求】
1.一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于由以下步驟組成: 第一步，培養基制備 (1)種子培養基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為種子培養基; (2)試管斜面保藏培養基稱取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、瓊脂15.0g，在IL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，用lmol/L鹽酸將pH值調至6.5~7.0，在121°C下滅菌20min，冷卻后為試管斜面保藏培養基； (3)發酵培養基成團泛菌發酵培養基:0.3%沒食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、.0.001% FeSO4.7Η20、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏檸檬酸桿菌發酵培養基:2.0 % 沒食子酸、0.2% (NH4) 2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌發酵培養基:1.0 %沒食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、.2.0% (NH4)2SO4^0.8M 飽和 Na2B4O7.1H2 水溶液、0.5M Na2HPO4.12H20 緩沖溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2H PO4.Iffi2O 或者 4.969g Na2HPO4 與 2.340g NaH2PO4.2H20 溶于 10mL 蒸餾水制得)；氧化還原真桿菌發酵培養基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %細菌瓊脂粉、.0.2%沒食子酸；植物乳桿菌、解沒食子酸鏈球菌發酵培養基:包含5.0%去纖維蛋白的馬血、20mM沒食子酸的肉湯培養基；黏紅酵母菌發酵培養基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM沒食子酸、0.5%酵母提取物；腸桿菌屬、產氣腸桿菌屬發酵培養基:0.06% MgSO4.7H20、.0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%沒食子酸、0.5%麥芽糖并取30mM pH值為6.0~7.0的磷酸鹽緩沖溶液，其中沒食子酸于100°C下滅菌5min，麥芽糖于115°C下滅菌30min，其余成分在121°C下滅菌20min，制備發酵培養基； 第二步，沒食子酸脫羧酶(GAD)的高產菌種篩選 初篩的方法:將培養好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬Φ.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、成團泛菌(P.agglomerans)、氧化還原真桿菌(E.0xidoreducens)、植物乳桿菌(L.planetarium)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、黏紅酵母菌(R.glutinis)等菌液,分別放入相應的發酵培養基中培養發酵，如腸桿菌屬(E.sp.)、產氣腸桿菌(E.aerogenes)的發酵培養基如第一步中所示,溫度30~37°C，每隔12h取樣一次，然后取用3倍體積的乙醚萃取發酵液3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，經TLC和HPLC分析沒食子酸和焦性沒食子酸，篩選出高產沒食子酸脫羧酶(GAD)的產氣腸桿菌(E.aerogenes)、腸桿菌屬(E.sp.)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和黏紅酵母菌(R.glutinis)； 第三步，菌種底物誘導 配制 CDM 缺碳培養基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%沒食子酸及 30mM pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液，將培養好的斜面菌種以無菌操作取兩環，轉接到10mL CDM培養基的250mL搖瓶中，在水浴溫度為25~30°C，轉速為180~200r/min的搖床中培養，每12h取樣一次，HPLC檢測發酵液中沒食子酸和焦性沒食子酸； 第四步，種子液制備及發酵培養 將培養好的斜面菌種以無菌操作取五環，轉接到10mL發酵培養基的250mL搖瓶中，溫度30~40°C，靜置培養6~8h，將培養好的菌液按照4~6%接種量，轉接到發酵培養基中，溫度30~35°C，180~200r/min搖床培養50~70h ； 第五步，搖瓶生理脅迫培養及響應面優化 通過考察接種量、發酵時間、磷酸鹽濃度、底物濃度、發酵溫度、發酵液起始PH值等因素對焦性沒食子酸的收率的單因素影響，采用Box-Behnken實驗設計進行3因素(底物濃度、發酵溫度、發酵液起始PH值)3水平的響應面優化，并進行驗證； 第六步，發酵液中焦性沒食子酸提取 取第五步最佳工藝條件下發酵液原液，于6000r/min條件下離心20min,取上清液用其體積3倍的有機溶劑萃取3次，合并萃取相、濃縮，得焦性沒食子酸濃縮物； 第七步，中壓柱分離制備 將焦性沒食子酸濃縮物與中壓柱填料按質量比1: 10~30吸附，洗脫劑為甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的I種或幾種的混合溶液，中壓柱柱長20~300cm,柱直徑2~30cm,柱壓為3~1MPa,檢測波長220~360nm,流速2~lOOmL/min,富集焦性沒食子酸，室溫真空回收溶劑，經HPLC分析，制備得到98%以上焦性沒食子酸。
2.根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于步驟2中產氣腸桿菌(E.aerogenes)等菌種具有降解沒食子酸生產焦性沒食子 酸的能力。
3.根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于權利I中沒食子酸和焦性沒食子酸TLC條件為:展開劑為乙醚:乙醇=7: 3 ;顯色劑:碘蒸氣。
4.根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于權利I中焦性沒食子酸HPLC條件為:色譜柱Thermo0DS-2C18(5ym250X4.6mm)分離柱，流動相為甲醇-水(含 0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通過0.45 μ m孔徑濾膜過濾,流速:lmL/min,檢測波長:263nm,檢測器:PDA 二極管陣列檢測器，檢測溫度:室溫。焦性沒食子酸標準曲線為y= 1318523.5X+6474.1，相關系數R =0.99951。
5.根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于第五步焦性沒食子酸收率測定計算公式為: 焦性沒食子酸收率y = (5 XcA1) Xv0Ai0X 100% ； 式中 V1:有機溶劑萃取體積；V(1:菌種發酵液實際體積噸:焦性沒食子酸的理論產量；c:HPLC檢測時菌種發酵液中焦性沒食子酸濃度；數字5:進行檢測的萃取液濃縮后用5mL流動相溶解的。
6.根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于步驟中第六步萃取用的有機溶劑，選自乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I種或任2種混合溶劑。
7.根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于第七步中壓柱填料，選擇200~300目的硅膠和氧化鋁中的I種或2種任意比，洗脫劑為甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇和乙醇中的I種或幾種的混合溶液，優選乙醚:乙醇=50:1~30 (v/v)混合溶劑。
8. 根據權利要求1所述的一種高產沒食子酸脫羧酶(GAD)菌種篩選及降解沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于第七步中壓柱填料，選擇孔徑為60A，40~60μπι的ODS C18、C8和S^hedex LH-20材料中任一種，洗脫劑為乙酸乙酯、乙醚和乙醇的I種或者幾種的混合溶液，優選1~20% (v/v)的乙醇水溶液。
【文檔編號】C12Q1/14GK104178552SQ201410366064
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】王成章, 李文君, 閔凡芹 申請人:中國林業科學研究院林產化學工業研究所