重組人成纖維細胞生長因子-20的基因克隆、表達及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達和生產FGF-20的方法。通過生物信息學手段優化設計合成FGF-20核苷酸序列全長，將其與pET系列載體相連接，并將該表達載體連接導入適當的大腸桿菌宿主細胞中，通過篩選獲得表達量高且穩定遺傳的工程菌株，并建立了高密度發酵方法和包涵體表達FGF-20的純化方法及建立相應質量檢測方法，使大規模生產rhFGF-20成為可能。在此基礎上，進一步探討FGF-20在組織修復、退行性神經系統疾病中的臨床應用及其在腫瘤發生、發展及遷移中的作用。
【專利說明】重組人成纖維細胞生長因子-20的基因克隆、表達及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種優化的生產成纖維細胞生長因 子-20 (FGF-20)的方法，以及用于該方法的表達載體、宿主，表達、純化方法及可能的臨床 應用。

【背景技術】
[0002] 成纖維細胞生長因子（Fibroblast Growth Factor, FGF)是一類廣泛存在于多種 組織中的多肽細胞生長因子，目前已發現23個成員，分子量為16kD?34kD，其中心區域含 有高度同源性（30%?70% )的大約120個氨基酸序列，對來源于中胚層和神經外胚層的 多種類型細胞具有廣泛的生物學活性。FGFs在體內含量甚微但分布廣泛，其中大多數FGFs 成員與胚胎發育、組織損傷修復、神經保護和營養、腫瘤的發生、發展和轉移有密切關系，具 有廣泛的應用前景。
[0003] FGF-20是FGF家族的一個新成員，屬FGF9亞家族（FGF9、FGF16、FGF20)，是通過 內質網-高爾基體分泌途徑產生的，在組織維修和傷口愈合中發揮著重要和廣泛的作用， 近年來，研究其在神經系統的保護和治療及遺傳性耳聾疾病的發生成為研發的熱點。2000 年，日本科學家Shigeki Ohmachi首次從老鼠大腦中發現FGF-20mRNA在腦組織尤其是小 腦組織黑質致密部表達量最高，預示其是對神經元具有保護作用的一種神經營養因子。人 FGF-20基因定位于人類染色體8p21. 3-p22區域，由3個外顯子和2個內含子組成，編碼211 氨基酸殘基組成的多肽，分子質量約為25kDa，為一種堿性蛋白。人FGF-20與老鼠的氨基 酸序列具有95%的高度同源性。在結構上，FGF20與FGF9、FGF16相似，其同源性分別70% 和62%，均缺乏典型的N端信號序列，都能分泌到細胞外。體外和體內的多項研究表明， FGF-20在分化發育、血管生成、腫瘤形成和其他細胞發育過程中也發揮著重要的作用。
[0004] FGF-20在組織修復方面有良好的應用前景。與大多數FGFs成員相同，FGF-20 能與一系列FGFR特異性結合，具有促上皮和間質細胞有絲分裂的功能。與目前已上市的 FGF-UFGF-2功能相似，可開發成為治療燒燙傷及慢性潰瘍創面的外用藥物。同時，經研究 發FGF-20對組織粘膜損傷修復具有良好的功效。JefTers等研究FGF-20對潰瘍性結腸炎 和炎癥性腸病動物模型的作用，發現預防劑量的FGF-20能有效地減少黏膜損傷的范圍和 減輕黏膜損害的嚴重程度；Alvarez等研究發現，FGF-20對放化療誘發的口腔粘膜炎同樣 具有治療作用；Maclachlan等研究發現，FGF-20能夠明顯增加致命劑量電離輻射后小鼠的 生存率?？梢灶A期，FGF-20在潰瘍性結腸炎、炎癥性腸病、口腔粘膜炎及放療輻射預防等臨 床方向具有巨大的應用前景。目前，美國CuraGen公司研發的新型生長因子FGF-20,已被 FDA批準用于治療因放療引起的口腔粘膜炎（OM)的罕見病用藥，并已完成I期臨床研究。 (Jeffers M et al. Gastroenterology,2002,123(4) :1151-1162 ；Alvarez E et al.Clin Cancer Res,2003,9 (9) :3454-3461 ；Maclachlar T et al. Int J Radiat Biol,2005, 81(8) :567-579 ；Beenken A et al. Nat Rev Drug Discov. 2009Mar ；8 (3) :235-53.)
[0005] FGF-20在帕金森癥等退行性神經系統疾病治療有良好的應用前景。帕金森 癥（PD)是一種黑質多巴胺能神經元變性缺失所引起的神經系統退行性疾病，患病率在 10-405/10萬之間，是目前一種嚴重和常見的中老年人神經系統變性疾病，其發病機制中遺 傳因素的作用越來越受到人們的重視。臨床針對ro患者基因組篩查發現，FGF-20正好位 于與ro關系最密切的8號染色體短臂連鎖區域，且其編碼的蛋白在正常腦組織中具有明顯 的神經營養特性；FGF-20蛋白在正常腦組織尤其是在小腦中有表達，可能對中樞神經系統 的發育具有調節作用；在體外細胞培養中添加 FGF-20可顯著提高多巴胺能細胞的存活能 力，促進細胞分化為多巴胺能神經元。這些現象皆提示FGF-20在神經退行性病變過程中 可能發揮重要作用。Ohmachi等將重組FGF-20蛋白作用于小鼠，發現其中腦多巴胺神經元 存活率顯著提高而其他神經元的存活率無明顯變化，表明FGF-20是一種對多巴胺神經元 具有選擇性的神經營養因子；Takagi等研究表明，培養基中添加 FGF-20,可增加 Nurrl細 胞分化成酪氨酸羥化酶陽性表達的神經元的能力，并將其移植到猴子帕金森病模型，行為 學和功能學等均有顯著治療效果；有報道稱FGF20和MAOB基因的SNP多態性存在相互作 用，二者同樣參與多巴胺生物旁路，在的遺傳機制中具有重要意義?？梢灶A期，FGF-20 在治療帕金森癥、阿爾次海墨癥等退行性神經系統疾病的治療具有巨大的臨床應用前景。 (Scott WK et al. JAMA,2001,286(18) :2239-2244 ；Jeffers M et al. Cancer Res,2001, 61(7) :3131-3138 ；de Mena L et al. Neurosci Lett,2010,479(I) :22-25 ；Rideout HJ et al. Neurochem,2003,84(4) :803-813 ：Tabares-Seisdedos R et al. Mol Psychiatry, 2009,14(6) :563-589 ；Shigeki Ohmachi et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000,277 :355-360 ；Takagi Y et al. J Clin Invest, 2005,115 (I)： 102-109 ;Gao X et al. Ann Hum Genet,2008,72(pt2) :157-162.)
[0006] FGF-20在腫瘤發生、發展及遷移中的作用。FGF-20在異常表達時能與細胞表面 的酪氨酸激酶型受體 FGFR2a (Illb)、FGFR2a (IIIc)、FGFR2P (IIIb)和 FGFR3a (IIIc) 發生特異性結合，通過MPK途徑引起細胞DNA合成以及細胞增殖。值得關注的是，FGF-20 與其他家族成員相比，還具有血管生成源性，參與腫瘤新生血管的形成，在腫瘤的發生發展 中起重要作用。Jeffers等研究表明，將攜帶有FGF-20的表達載體轉入NIH 3T3細胞，發 現細胞形態發生了改變，隨后將穩定轉染的NIH3T3細胞注射裸鼠，結果均出現快速生長的 腫瘤；Chamorro等做了相反方向的實驗，即采用RNA干擾技術封閉FGF-20基因表達，發現 RK3E細胞克隆顯著減少，非錨定性生長特征消失，出現接觸抑制。進一步實驗證實FGF-20 轉錄水平受到與許多人類惡性腫瘤發生密切相關的Wm/B-鏈蛋白信號轉導通路調節，說 明FGF-20表達與腫瘤形成有密切關系。目前已證實，在絕大多數人腫瘤細胞株中均異常 表達FGF-20,其中在肺癌、結直腸癌和胃癌細胞中異常高表達，并可能是參與腫瘤病理過 程的主要因素，與腫瘤的浸潤、轉移密切相關，可作為腫瘤診斷和治療的靶分子具有廣闊的 前景。（Engstrom W et al. An ticancer Res，2006,26 (5A) :3307-3310 ;Polnaszek N et al. C ancer Res,2003,63(18) :5754-5760 ；Jeffers M et al. Cancer Res,2001,61(7)： 3131-3138 ；Chamorro MN et aI. EMBO J,2005,24(I) :73-84 ；Katoh M et al. Onco I Rep, 2005,14(1) :287-290 ；Mario N Chamorro et al. The EMBO Journal,2005,24 :73-84.)
[0007] 由于FGF-20的發現對于退行性神經系統疾病、組織修復及腫瘤方面有著重要意 義，其研究以及臨床應用的前景口益受到人們的關注。FGF-20作為新型的生長因子，目前國 內外相關報道較少。本申請專利，通過基因優化、表達載體和宿主菌的篩選，進而獲得大腸 桿菌的高效表達菌株；利用流加補料的方式建立了規?；母呙芏扰囵B技術；優化包涵體 清洗、變性及復性方法，通過陽離子交換柱層析、肝素柱層析（IIeparin Sepharose CL-6B) 或金屬離子螯合柱層析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其組合,最終獲得蛋白純度 超過95%并具有高生物學活性的？6?-20重組蛋白，為進一步開展？6?-20相關作用機制研 究和新藥開發奠定了基礎。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的是提供一種簡便并且高效的生產FGF-20的方法。
[0009] 本發明的目的還在于提供含有編碼FGF-20基因的載體或質粒。
[0010] 本發明的另一目的是提供用于該方法的表達載體和宿主細胞。
[0011] 為實現上述目的，本發明首先將FGF-20的天然序列按照大腸桿菌偏好性進行優 化，在不改變其氨基酸序列的前提下，設計合成rhFGF-20的全長序列。同時本發明提供 了篩選優化的表達載體和宿主細胞的組合，如pET3a、pET3c、pET28a表達載體及對應的 BL21 (DE3) plysS、Transetta (DE3)宿主細胞，并構建了高效穩定表達的工程菌株。
[0012] 進一步，本發明提供了一種生產重組人成纖維細胞生長因子-20的方法，通過優 化培養基、控制參數及補料流加策略，建立了規模化的高密度培養方法，最后通過柱層析分 離純化得到高純度和活性的rhFGF-20。具體包括如下步驟：
[0013] (1)通過改良種子培養基對工程菌進行活化和擴增，接種至發酵罐中通過優化控 制參數及采用流加補料的方式進行規模化的高密度培養，優化誘導時機和誘導時間高效表 達外源蛋白FGF-20 ;
[0014] (2)優化裂解溶液并通過高壓均質機進行菌體破碎，低溫高速離心棄上清收沉淀； 優化包涵體清洗、變性及復性方法與步驟，并通過中空纖維超濾裝置進行初步分離純化；
[0015] (3)通過柱層析進行精細分離純化，具體包括：陽離子交換柱層析（SP S^harose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow)、肝素柱層析（Heparin Sepharose CL-6B)或金屬 離子螯合柱層析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其組合。
[0016] 所述的高密度培養方法是：
[0017] (1)罐內培養基優化：降低底物濃度，優化培養基配伍組成，如降低底物中碳源 含量，添加無機鹽、微量元素、促生長因素等營養成分提供全面營養，并保護質粒的穩定遺 傳；
[0018] (2)控制參數優化：通過優化誘導前及誘導后關鍵控制參數，如溫度、pH值、溶解 氧、轉數及誘導時機和誘導時間等，獲得高產量及經濟指標合理的生產工藝；
[0019] (3)流加補料方法：優化流加補料的營養成分，采用不同流加補料策略，如變速補 料、DO-stat法或pH-stat法，降低底物對工程菌生長及產物合成的抑制，延長工程菌的對 數生長周期，有效提高產量及表達量，提高了設備有效利用率高、降低生產成本，并對發酵 過程實現了優化控制。
[0020] 本發明具有以下優點：
[0021] (1)通過對FGF-20核苷酸序列進行優化及適宜的表達載體和宿主細胞的組合，獲 得高效穩定表達的工程菌株；
[0022] (2)通過建立高密度培養方法，可使FGF-20的表達水平達到菌體總蛋白的25%以 上，菌體產量達70g/L發酵液以上；
[0023] (3)外源蛋白以包涵體形式表達，表達量高且破碎與純化過程中不易被降解；進 一步建立了包涵體清洗、變性復性和柱層析方法，簡化了純化步驟，提高了蛋白及活性收 率。蛋白收率達150mg/L發酵液以上，蛋白純度高于95%以上。
[0024] (4)建立了 FGF-20活性測定方法。生物學活性是反映重組蛋白質量及功效的重要 指標，本發明建立了用NIH3T3細胞株進行FGF-20促增殖作用的活性測定方法。實驗結果 呈典型的S型曲線，并在一定范圍內具有劑量依賴性，顯示出良好的重復性和可靠性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖lpET3c_FGF20重組載體圖
[0026] 圖 2pET28a_FGF20 重組載體圖
[0027] 圖3FGF-20發酵表達SDS-PAGE電泳分析
[0028] 圖4CM柱層析SDS-PAGE電泳分析
[0029] 圖5親和柱層析SDS-PAGE電泳分析
[0030] 圖6MTT法測定FGF-20蛋白對NIH3T3細胞的促增殖生物學活性

【具體實施方式】
[0031] 實施例1FGF-20蛋白高效表達工程菌的構建
[0032] 根據GenBank中公布的人FGF-20天然序列（登錄號：BC098128. 1)和氨基酸序列， 按照大腸桿菌密碼子偏好性進行優化，在不改變氨基酸序列的條件下，設計rhFGF-20的編 碼序列引物。通過PCR擴增的方法獲得rhFGF-20的全長核苷酸序列。在rhFGF-20優選序 列的5'端與3'端分別加起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點Nde I和BamH I，再用NdeI和BamHI雙酶切分別處理rhFGF-20基因和表達載體pET3a-c (或pET28a)，37°C 酶切3h?4h后回收相應的片段，用T4DNA連接酶16°C連接過夜，構建重組表達載體（見圖 1、圖2)。連接產物轉化進入大腸桿菌Transetta(DE3)(或BL21(DE3)plysS)，在含有載體 抗性的的LB平板上挑選陽性克隆并進行質粒雙酶切鑒定及菌落PCR檢定，證實表達序列已 正確插入載體中。委托基因測序公司進行正向、逆向序列分析測定，證實克隆序列與設計序 列完全一致。進行搖瓶培養，誘導后測定目的蛋白表達量占總蛋白25%左右，并進行免疫印 跡（Western Blot)檢測呈現陽性反應，證實所表達的重組外源蛋白為FGF-20。進行工程菌 穩定性試驗，連續傳代50次，檢測其質粒穩定性、結構穩定性和表達穩定性，并證實獲得了 高效表達、遺傳穩定的FGF-20工程菌株，為下一步試驗奠定了良好的基礎。本工程菌將目 的基因插入含Lac操縱子的誘導的pET系列表達載體中，再轉化與表達載體相容的大腸桿 菌宿主菌，可利用IPTG或乳糖進行誘導表達。
[0033] 實施例2FGF-20蛋白高密度培養方法的建立
[0034] 在本發明中，工程菌表達rhFGF-20的發酵條件沒有特別限制?？梢圆捎帽绢I域常 規的發酵條件。通常，工程菌在以胰蛋白胨、酵母粉、銨鹽等為氮源，葡萄糖、甘油等為碳源， 磷酸鹽為緩沖體系組成，并輔以硫酸鎂、氯化鈉及微量元素和添加維生素作為基礎培養基； 并通過控制參數（pH、溫度、溶解氧、攪拌速度等）的調節及營養物質的流加，監測發酵液中 的葡萄糖含量和尾氣分析，調節產物比生長速率，減少乙酸的積累，延長對數生長周期，顯 著提高了菌體產量及表達水平。具體為：將FGF-20工程菌株以I : 200?300接種至LB 培養基中進行活化制備一代種子，培養3h?4h，待A_達到0. 8?I. 0左右，按I : 10? 20的比例接種至含有磷酸鹽緩沖對的LB培養基中進行擴增制備二代種子，培養8h?10h， 待八_達到4?8左右，按I : 10?20的比例接種至含有罐內培養基的發酵罐中，以溫度 35°〇?371：4!1值6.8?7.0、攪拌轉數200印111?600印111、00>25%并輔以營養物質的流 加方式進行培養4h?6h。待A_達到20?25,流加加人誘導劑（IPTG)至終濃度ImM進 行誘導。調節誘導后溫度為33°C?35°C、pH值7. 0?7. 2、攪拌轉數600rpm?300rpm、D0 > 30%并輔以流加碳源、氮源及磷酸鹽緩沖溶液的流加方式進行表達4h?6h。低溫高速 離心，菌體-20°C凍存，樣品進行SDS-PAGE檢測并測定表達量（見圖3)。
[0035] 表1各階段培養基組成
[0036]

【權利要求】
1. 一種源至pET3a-C或pET28a(+)的原核表達載體，其含有編碼FGF-20的重組DNA， 其中所述編碼FGF-20的核苷酸序列見核苷酸或氨基酸序列表所示。
2. 含有權利要求1所述表達載體的大腸桿菌BL21 (DE3) plysS或Transetta (DE3)。
3. -種生產FGF-20的方法，通過培養權利要求2所述的宿主細胞，并加誘導劑誘導表 達FGF-20，并進一步通過分離純化獲得高純度的FGF-20蛋白。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 通過改良種子培養基對權利要求2所述的工程菌進行活化和擴增，接種至發酵罐 中通過優化控制參數及采用流加補料的方式進行規?；母呙芏扰囵B，優化誘導時機和誘 導時間高效表達外源蛋白FGF-20 ; (2) 優化裂解溶液并通過高壓均質機進行菌體破碎，低溫高速離心棄上清收沉淀；優 化包涵體清洗、變性及復性方法與步驟，并通過中空纖維超濾裝置進行初步分離純化； (3) 通過柱層析進行精細分離純化，具體包括：陽離子交換柱層析（SP Sepharose Fast Flow 或 CM Sepharose Fast Flow)、肝素親和柱層析（Heparin Sepharose CL-6B)或金屬 離子螯合柱層析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其組合。
5. 根據專利權要求1?4所述制備的FGF-20,其特征是，可應用于皮膚或黏膜損傷的 組織修復、治療帕金森或阿爾次海墨癥等退行性神經系統疾病。還可制備成不同制劑，應用 于生物美容及燒燙傷、難愈性潰瘍的治療。
【文檔編號】C12N15/70GK104293821SQ201410403065
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】田海山, 李校堃, 姜潮, 馬吉勝, 趙央, 鄭婕 申請人:溫州醫科大學, 浙江格魯斯特生物科技有限公司