一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌及其培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌，該菌的保藏號為CGMCCNO.9532，其是從健康日本海馬腸道內分離獲得，能夠拮抗日本海馬腸炎病病原菌；該菌有芽孢，最適生長溫度為28℃～37℃，鹽度（NaCl）為0.5%～2%；該菌在優化的發酵培養基中培養5d后，其發酵液具有較強的抑菌效果，該芽孢桿菌能應用于液體發酵生產抑菌活性物質；經單因素試驗優化了該菌產生抑菌活性物質的條件。該菌發酵產生的抑菌活性物質可以耐受高溫，這有利于活性物質的保存和運輸。該菌是從海馬腸道內分離的芽孢桿菌，屬于益生菌，該菌既可以改善海馬養殖水體環境，也可以改善海馬腸道有益菌的種群數量，從而大大提高了海馬腸炎病的防治效果。
CGMCC NO.9532
2014.08.20
【專利說明】一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌及其培養方法
[0001]

【技術領域】： 本發明涉及一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌及其培養方法，屬于微生物【技術領域】。
[0002]

【背景技術】： 海馬是名貴的海洋中藥材，在我國海馬作為藥材的使用已有悠久歷史。世界上至少有 46種海馬，但據世界自然保護聯盟（IUCN)于2013年2月關于瀕危海馬物種的最新統計，世 界上有39種海馬屬于瀕危物種。雖然我國自1957年以來已經開始養殖海馬，但是養殖規 模一直無法成功擴大化，其主要原因之一就是海馬養殖過程中常見的細菌性疾病問題。據 2013年對深圳某一海馬養殖場的調查表明：該海馬養殖場購進的一批日本海馬在短短的 幾個月期間，因患有腸炎病死亡了近2000余尾，給該廠造成了巨大的經濟損失。
[0003] 目前，針對海馬的細菌性疾病治療方法還是以使用抗生素類藥物為主，長期使用 抗生素類藥物不但會使細菌產生抗藥性、影響海馬健康和抗病害能力，而且效果不理想。我 國是亞洲出口海馬的主要國家之一，若是長時間使用抗生素，會使海馬體內的抗生素含量 超標，從而影響我國海馬的外出口貿易。
[0004] 益生菌是一類能夠與病原菌互相抵制、互相排斥、甚至互相殘殺的微生物種群， 因為具有存在范圍廣、數量種類多、繁殖速度快、作用方式廣等優點，被廣泛應用于生物 防治領域中。益生菌既可以避免抗生素的副作用，也可以促進動物生長。近年來，益生 菌已經開始在水產養殖業應用，如Moriarty利用芽孢桿菌來控制養殖池內弧菌的數量； Newaj-Fyzul等人利用枯草芽孢桿菌來抵御氣單胞桿菌對虹鱒魚的感染。
[0005] 芽孢桿菌可以產生多種抗菌物質，如表面活性素、伊枯草菌素、豐原素等脂肽類抗 菌素和抗菌蛋白等；并已有相關報道證明芽孢桿菌是一種益生菌。目前關于海馬細菌性疾 病的報道不少，但是還沒有用微生生物拮抗來防治海馬細菌性疾病的相關報道。
[0006]


【發明內容】
： 本發明的目的在于克服上述已有技術的不足而從健康日本海馬腸道內分離篩選一株 芽孢桿菌，它可以拮抗日本海馬腸炎病病原菌，從而起到生物防治的作用。
[0007] 本發明的可以通過如下措施來達到：一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌，其特征 在于其保藏名稱為sp. )HS17,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏日期：2014年8月20日，保藏號：CGMCC N0. 9532,分類命名：解淀粉芽 抱桿菌 Bacillus amyloliquefaciens。
[0008] -種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌的培養方法，其包括如下步驟： (1)芽孢桿菌的分離純化： 清洗健康日本海馬體表，取出日本海馬腸道組織消毒并研磨后，再用無菌生理鹽水梯 度稀釋，之后涂布于2216E培養基上，28°C培養12-24h后，挑選大小、顏色不同的菌落進行 分離純化，將分離純化后的菌株于4-10°C保存備用；其中1000mL的2216E培養基的配方 組分為：蛋白胨10,酵母粉5,瓊脂20,海水700mL，蒸餾水300mL ; (2)將上述分離純化后的 日本海馬腸道菌菌株劃線于2216E培養基上，28°C培養12-24h后，采用點種法，用接種環挑 取步驟（1)中分離純化的單菌落點種于涂布有供試菌株HC2的2216E培養基上，28°C培養 24-48h，觀察有無抑菌圈，將出現抑菌圈的菌株進行再次點種，確認其抑菌性，最終獲得一 株抑菌效果較好的拮抗菌，命名為HS17。
[0009] 所述的芽孢桿菌的分離純化中采用無菌生理鹽水清洗健康日本海馬體表3-5次， 取出日本海馬腸道組織放入含有0. 5-2mL無菌生理鹽水的研磨器中，充分研磨之后，再用 無菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為1 X 103cfu/mL。
[0010] 為了進一步實現本發明的目的，將上述HS17在最佳培養基中，在25-37 °C、 140-200r/min發酵條件下，發酵培養72-120h ;所述的最佳培養基的配方組分為：蛋白胨 10. 0-20. Og/L、麥芽糖 5. 0-10. Og/L、ΚΗ2Ρ04 0· 5-1. 5g/L、NaCL 5-20. Og/L 和 MgS047H20 0· 1-0. 5g/L，蒸餾水 1000mL。
[0011] 為了進一步實現本發明的目的，所述的HS17在最佳培養基中裝瓶量為30%、初始 pH值7.0、接種量為3%。
[0012] 本發明同已有技術相比可產生如下積極效果： 1、本發明的拮抗菌HS17是從健康日本海馬腸道內分離得到，拮抗海馬腸炎病病原菌 的芽孢桿菌，對其病原菌有顯著拮抗作用，可以代替防治腸炎病的抗生素類藥物。
[0013] 2、該芽孢桿菌為有益菌，可以改善養殖水體環境以及海馬腸道有益菌的種群數 量，從而可以使防治效果更加突出。
[0014] 3、以該芽孢桿菌為主進行海馬腸炎病微生物的防治可以重復多次使用，不會產生 藥物殘留和耐藥性問題；該拮抗海馬腸炎病病原菌的芽孢桿菌的發明為海馬腸炎病的生物 防治技術提供切實可行的技術支持和理論依據。
[0015] 4、本發明的芽孢桿菌的抑菌活性物可以耐受高溫，這為應用中的運輸和保存提供 了便利。
[0016]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為芽孢桿菌HS17革蘭氏染色圖片； 圖2為芽孢桿菌HS17芽孢染色圖片； 圖3為芽孢桿菌HS17發酵液抑菌圖片。

【具體實施方式】
[0017] 以下結合實施例對本發明進行進一步說明，本發明的保護范圍不受實施例的限 制。
[0018] 實施例1 :芽孢桿菌HS17的分離純化： 用無菌生理鹽水清洗健康日本海馬體表3-5次，取出日本海馬腸道組織放入含有 0. 5-2mL無菌生理鹽水的研磨器中，充分研磨之后，再用無菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為 1 X 103cfu/mL，之后涂布于2216E培養基（1000mL培養基：蛋白胨10g，酵母粉5g，瓊脂20g， 海水700mL，蒸餾水300mL)上，28°C培養12-24h后，挑選大小、顏色不同的菌落進行分離純 化，將分離純化后的菌株于4-KTC保存備用。
[0019] 將上述分離純化后的日本海馬腸道菌菌株劃線于2216E培養基上，28°C培養 12-24h后，采用點種法，用接種環挑取單菌落點種于涂布有供試菌株HC2 (日本海馬腸炎病 病原菌）的2216E培養基上，28°C培養24-48h，觀察有無抑菌圈，將出現抑菌圈的菌株進行 再次點種，確認其抑菌性，最終獲得一株抑菌效果較好的拮抗菌，命名為HS17。
[0020] 實施例2 :拮抗菌HS17的鑒定： 所述菌株HS17經革蘭氏染色，可知該菌株為革蘭氏陽性桿菌，見圖1 ;經芽孢染色可 知該菌株有芽孢，見圖2 ;該菌株在2216E平板上28°C恒溫培養24h，菌落呈白色，表面不光 滑，邊緣呈波浪狀，直徑約為1?2mm。
[0021] 對菌株HS17進行生長溫度和耐鹽度（NaCL)測定，結果顯示該菌的最適生長溫度 為28°C?37°C，鹽度（NaCl)為0. 5%?2%，其詳細結果見表1 ;按照《常見細菌系統鑒定手 冊》（東秀珠等，2001)進行生理生化特性檢測，其測定結果詳情見表1。 K 1 2 ft HS I Μ ± Μ I：,f t :：^ ? φ

【權利要求】
1. 一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌，其特征在于其保藏名稱為sp.) HS17,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年8月 20 日，保藏號：CGMCC NO. 9532。
2. 權利要求1所述的一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌的培養方法，其包括如下步 驟： (1)芽孢桿菌的分離純化： 清洗健康日本海馬體表，取出日本海馬腸道組織消毒并研磨后，再用無菌生理鹽水梯 度稀釋，之后涂布于2216E培養基上，28°C培養12-24h后，挑選大小、顏色不同的菌落進行 分離純化，將分離純化后的菌株于4-10°C保存備用；其中1000mL的2216E培養基的配方 組分為：蛋白胨10,酵母粉5,瓊脂20,海水700mL，蒸餾水300mL ; (2)將上述分離純化后的 日本海馬腸道菌菌株劃線于2216E培養基上，28°C培養12-24h后，采用點種法，用接種環挑 取步驟（1)中分離純化的單菌落點種于涂布有供試菌株HC2的2216E培養基上，28°C培養 24-48h，觀察有無抑菌圈，將出現抑菌圈的菌株進行再次點種，確認其抑菌性，最終獲得一 株抑菌效果較好的拮抗菌，命名為HS17。
3. 根據權利要求2所述的所述的一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌的培養方法，其特 征在于所述的芽孢桿菌的分離純化中采用無菌生理鹽水清洗健康日本海馬體表3-5次，取 出日本海馬腸道組織放入含有〇. 5-2mL無菌生理鹽水的研磨器中，充分研磨之后，再用無 菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為1 X 103cfu/mL。
4. 根據權利要求2所述的所述的一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌的培養方法，其 特征在于將上述HS17在最佳培養基中，在25-37°C、140-200r/min發酵條件下，發酵培養 72-120h ;所述的最佳培養基的配方組分為：蛋白胨10. 0-20. Og/L、麥芽糖5. 0-10. Og/L、 ΚΗ2Ρ04 0· 5-1. 5g/L、NaCL 5-20. 0g/L 和 MgS047H20 0· 1-0. 5g/L，蒸餾水 1000mL。
5. 根據權利要求4所述的所述的一種促進海馬健康養殖的芽孢桿菌的培養方法，其特 征在于所述的HS17在最佳培養基中裝瓶量為30%、初始pH值7. 0、接種量為3%。
【文檔編號】C12R1/07GK104232541SQ201410472316
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】孫虎山, 李海東 申請人:魯東大學