小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體涉及小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用，該引物包括分別對應4個待檢變異位點的4對共8條引物，4個待檢變異位點分別為基因片段rs7095891、rs16476、rs1801133和rs1042714，8條引物分別簡寫為：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F和G4R；引物G1F和G1R擴增位點為rs7095891，G2F和G2R擴增位點為rs16476，G3F和G3R擴增位點為rs1801133，G4F和G4R擴增位點為rs1042714。本發明的引物能滿足4個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
【專利說明】小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體涉及小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用。

【背景技術】
[0002]小兒腦性癱瘓(cerebral palsy，CP，簡稱腦癱)是指出生前至出生后I個月各種原因所引起的非進行性腦損傷或發育缺陷所致的運動障礙及姿勢異常，癥狀在嬰兒期出現，有時合并智力障礙、癲癇、感知覺障礙及其他異常。腦癱是引起兒童殘疾最常見的疾病，發病率為1.0-2.5/1000個活產兒或兒童。在我國，腦癱患兒的發病率為1.5%。飛％。，其中男性發病率高于女性，農村發病率高于城市。我國現有31萬學齡前腦癱患兒，有200萬以上腦癱患兒需要康復治療，且每年以4.6萬人左右的速度增長，給個人、家庭和社會帶來了巨大的心理和經濟負擔，同時也嚴重影響我國人口素質的提高和計劃生育這一基本國策的貫徹實施。
[0003]遺傳因素被證實是影響小兒腦癱的重要因素，但目前臨床上還沒有試劑盒檢測腦癱的相關基因應用。


【發明內容】

[0004]為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在于提供一種小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物，該引物能滿足4個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
[0005]本發明的另一目的在于提供一種小兒腦性癱瘓基因變異檢測試劑盒，該檢測試劑盒針對中國人群小兒腦癱相關基因4個變異位點而開發，對4個風險變異位點(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)進行檢測分析，以達到從分子水平上對腦癱的發生進行預報、預警，降低腦癱發病率、提高出生缺陷救治水平。
[0006]本發明的另一目的在于提供一種小兒腦性癱瘓基因變異檢測試劑盒的檢測方法，該檢測方法快速、準確性高、特異性強，可以對腦癱患兒早發現、早預防、早治療，以減少腦癱兒的發病率、改善腦癱患兒預后。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種小兒腦性癱瘓基因變異檢測試劑盒在檢測小兒腦性癱瘓基因變異的應用，可以對腦癱患兒早發現、早預防、早治療，以減少腦癱兒的發病率、改善腦癱患兒預后。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物，包括分別對應4個待檢變異位點的4對共8條引物，4個待檢變異位點分別為基因片段rs709589U rsl6476、rsl801133 和 rsl042714，8 條引物分別簡寫為:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F和G4R ;其中，引物GlF和GlR擴增位點為rs7095891, G2F和G2R擴增位點為rsl6476，G3F和G3R擴增位點為rsl801133，G4F和G4R擴增位點為rsl042714。4個待檢變異位點分別位于基因 MBL+4 (rs7095891)、MTHFR 677 (rsl801133)、NPY A6411C (rsl6476)和 ADRB2 Q27E (rsl042714)。
[0009]優選的，所述8條引物的序列分別為:
GlF:5，- GCTCTGAAGAACAAATGAAAGG -3，
GlR:5’ - AAATAGGACATCAGTCTCCTCA -3’
G2F:5’ - ATCTTCATAACCTCCTGACTCTT -3’
G2R:5’ - TGTTTCCCTTGCATTTGCTATT -3’
G3F:5’ - GCTCAAGGCAGGACAGTGT -3’
G3R:5， - GGAAGAACTCAGCGAACTCAG -3，
G4F:5’ - CCGCTGAATGAGGCTTCCA -3’
G4R:5’ - AGCAGGCTCTGGTACTTGAA -3’。
[0010]本發明的另一目的通過下述技術方案實現:一種用于檢測小兒腦性癱瘓基因變異的試劑盒，該試劑盒包括權利要求廣2任一項所述的引物。
[0011]本發明的另一目的通過下述技術方案實現:一種使用上述的試劑盒檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，依次包括如下步驟:
A、提取模板DNA:從待檢者的血液中提取基因組DNA，作為PCR擴增的模板DNA ；
B、PCR擴增:以上述提取的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，得到DNA擴增產物；
C、PCR產物純化:采用純化板對上述DNA擴增產物進行純化，得到純化DNA；
D、測序反應:采用Sanger方法對純化DNA進行測序；
E、結果分析:采用測序峰圖分析軟件對測序結果進行分析。
[0012]優選的，所述步驟B中，PCR擴增的反應體系以30.Ομ?計為:
2Χ GC buffer I12.5μ?
2.5 mM dNTP4.Ομ?
1mM 引物 F1.Ομ?
1mM 引物 R1.Ομ?
10?30ng/^L 模板 DNA3.Ομ?
LA Taq 聚合酶0.3μ?
ddH203.2μ?。
[0013]優選的，所述步驟B中，PCR擴增的反應條件為:1) 95°C預變性2min ；2) 95°C變性30s，60。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏；
另一優選的，PCR擴增的反應條件為:1) 95°C預變性2min ；2) 95°C變性30s，57°C退火30s、72°C延伸 lmin，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏；
另一優選的，PCR擴增的反應條件為:1) 95°C預變性2min ；2) 95°C變性30s，53°C退火30s、72°C延伸 lmin，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏。
[0014]優選的，所述步驟C中，PCR產物純化的步驟具體為:向96孔純化板孔中加入100μ? ddH20,將上述DNA擴增產物加入96孔純化板中室溫靜置lOmin，真空抽濾1min至抽干；向96孔純化板中加入40μ? ddH20，室溫溶解lOmin，取出對應的孔中的純化產物至另一個96孔PCR板中，回收純化產物，得到純化DNA。
[0015]優選的，所述步驟D中，測序的反應體系以6.0μ?計為:
30?50ng /μ? 純化 DNA2.Ομ?
3ρΜ測序引物Ι.Ομ?
Bigdye2.0M-L
DMSO1.Ομ?。
[0016]Bigdye包含Taq聚合酶以及標記了大熒光染料的ddNTP等，在DNA聚合酶催化的測序反應中需要測序引物，不論是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過使用克隆位點兩側的載體序列互補的通用引物，本發明的測序引物采用Bigdye的通用引物。
[0017]優選的，所述步驟D中，測序的反應條件為:1)95°C預變性2min ;2)95°C變性30s，55°C退火30s、60°C延伸90s，共30個循環；3) 12°C保藏。
[0018]所述步驟E中，結果分析的步驟具體為:使用測序峰圖分析軟件，對測序結果進行分析，得到每個測試樣本相應位點的堿基信息，從而分析待檢者生育小兒腦性癱瘓的風險性以及預測小兒腦性癱瘓后期引發的相關疾病的風險性。
[0019]本發明的另一目的通過下述技術方案實現:一種上述的試劑盒在檢測小兒腦性癱瘓基因變異的應用。
[0020]本發明的有益效果在于:本發明首次根據4個待檢變異位點設計了 8條引物，引物能滿足4個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
[0021]本發明的檢測試劑盒針對中國人群小兒腦癱相關基因4個變異位點而開發，對4個風險變異位點(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)進行檢測分析，以達到從分子水平上對腦癱的發生進行預報、預警，降低腦癱發病率、提高出生缺陷救治水平。
[0022]本發明的檢測方法快速、準確性高、特異性強，可以對腦癱患兒早發現、早預防、早治療，以減少腦癱兒的發病率、改善腦癱患兒預后。
[0023]本發明的小兒腦性癱瘓基因變異檢測試劑盒在檢測小兒腦性癱瘓基因變異的應用，可以對腦癱患兒早發現、早預防、早治療，以減少腦癱兒的發病率、改善腦癱患兒預后。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rs7095891變異位點的測序比對圖。
[0025]圖2是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rsl6476變異位點的測序比對圖。
[0026]圖3是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rsl801133變異位點的測序比對圖。
[0027]圖4是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rsl042714變異位點的測序比對圖。
[0028]【具體實施方式】:
為了便于本領域技術人員的理解，下面結合實施例及附圖Γ4對本發明作進一步的說明，實施方式提及的內容并非對本發明的限定。
[0029]小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物，包括分別對應4個待檢變異位點的4對共8條引物，4個待檢變異位點分別為基因片段rs7095891、rsl6476、rsl801133和rsl042714，8條引物分別簡寫為:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F和G4R ;其中，引物GlF和GlR擴增位點為rs7095891，G2F和G2R擴增位點為rs 16476，G3F和G3R擴增位點為rsl801133，G4F和G4R擴增位點為rsl042714。4個待檢變異位點分別位于基因MBL+4(rs7095891 )、MTHFR677 (rsl801133)、NPY A6411C (rsl6476)和 ADRB2 Q27E (rsl042714)。
[0030]其中，所述8條引物的序列分別為:
GlF:5，- GCTCTGAAGAACAAATGAAAGG -3，
GlR:5’ - AAATAGGACATCAGTCTCCTCA -3’
G2F:5’ - ATCTTCATAACCTCCTGACTCTT -3’
G2R:5’ - TGTTTCCCTTGCATTTGCTATT -3’
G3F:5’ - GCTCAAGGCAGGACAGTGT -3’
G3R:5， - GGAAGAACTCAGCGAACTCAG -3，
G4F:5’ - CCGCTGAATGAGGCTTCCA -3’
G4R:5’ - AGCAGGCTCTGGTACTTGAA -3’。
[0031]本發明首次根據4個待檢變異位點設計了 8條引物，引物能滿足4個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
[0032]一種用于檢測小兒腦性癱瘓基因變異的試劑盒，該試劑盒包括權利要求f 2任一項所述的引物。
[0033]本發明的檢測試劑盒針對中國人群小兒腦癱相關基因4個變異位點而開發，對4個風險變異位點(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)進行檢測分析，以達到從分子水平上對腦癱的發生進行預報、預警，降低腦癱發病率、提高出生缺陷救治水平。
[0034]一種使用上述的試劑盒檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，依次包括如下步驟:
A、提取模板DNA:從待檢者的血液中提取基因組DNA，作為PCR擴增的模板DNA ；
B、PCR擴增:以上述提取的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，得到DNA擴增產物；
C、PCR產物純化:采用純化板對上述DNA擴增產物進行純化，得到純化DNA；
D、測序反應:采用Sanger方法對純化DNA進行測序；
E、結果分析:采用測序峰圖分析軟件對測序結果進行分析。
[0035]其中，所述步驟B中，PCR擴增的反應體系以30.Ομ?計為:
2Χ GC buffer I12.5μ?
2.5 mM dNTP4.Ομ?
1mM 引物 F1.Ομ?
1mM 引物 R1.Ομ?
10?30ng/^L 模板 DNA3.Ομ?
LA Taq 聚合酶0.3μ?
ddH203.2μ?。
[0036]其中，所述步驟B中，PCR擴增的反應條件為:1)95°C預變性2min;2)95°C變性30s，60。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏；
本發明的另一種較佳的實施方式為=PCR擴增的反應條件為:1) 95°C預變性2min ；2)95°C變性 30s，57。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12。。保藏；
本發明的另一種較佳的實施方式為=PCR擴增的反應條件為:1) 95°C預變性2min ；2)95°C變性 30s，53。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12。。保藏。
[0037]其中，所述步驟C中，PCR產物純化的步驟具體為:向96孔純化板孔中加入ΙΟΟμ?ddH20,將上述DNA擴增產物加入96孔純化板中室溫靜置lOmin，真空抽濾1min至抽干；向96孔純化板中加入40μ? ddH20,室溫溶解lOmin，取出對應的孔中的純化產物至另一個96孔PCR板中，回收純化產物，得到純化DNA。
[0038]其中，所述步驟D中，測序的反應體系以6.Ομ?計為:
30?50ng /μ? 純化 DNA2.Ομ?
3ρΜ測序引物Ι.Ομ?
Bigdye2.0M-L
DMSO1.Ομ?。
[0039]Bigdye包含Taq聚合酶以及標記了大熒光染料的ddNTP等，在DNA聚合酶催化的測序反應中需要測序引物，不論是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過使用克隆位點兩側的載體序列互補的通用引物，本發明的測序引物采用Bigdye的通用引物。
[0040]其中，所述步驟D中，測序的反應條件為:I) 95 °C預變性2min ;2 ) 95 °C變性30s，55°C退火30s、60°C延伸90s，共30個循環；3) 12°C保藏。
[0041]所述步驟E中，結果分析的步驟具體為:使用測序峰圖分析軟件，對測序結果進行分析，得到每個測試樣本相應位點的堿基信息，從而分析待檢者生育小兒腦性癱瘓的風險性以及預測小兒腦性癱瘓后期引發的相關疾病的風險性。
[0042]如圖1?4所示，如果測試樣本的基因在4個風險變異位點(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)中的任意一個變異位點的堿基發生突變，即可判斷待檢者為生育小兒腦性癱瘓的高危人群。
[0043]本發明的檢測方法快速、準確性高、特異性強，可以對腦癱患兒早發現、早預防、早治療，以減少腦癱兒的發病率、改善腦癱患兒預后。
[0044]—種上述的試劑盒在檢測小兒腦性癱瘓基因變異的應用。本發明的小兒腦性癱瘓基因變異檢測試劑盒在檢測小兒腦性癱瘓基因變異的應用，可以對腦癱患兒早發現、早預防、早治療，以減少腦癱兒的發病率、改善腦癱患兒預后。
[0045]上述實施例為本發明較佳的實現方案，除此之外，本發明還可以其它方式實現，在不脫離本發明構思的前提下任何顯而易見的替換均在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物，其特征在于:包括分別對應4個待檢變異位點的4對共8條引物，4個待檢變異位點分別為基因片段rs7095891、rsl6476、rsl801133和rsl042714，8 條引物分別簡寫為:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F 和 G4R ;其中，引物 GlF和GlR擴增位點為rs7095891, G2F和G2R擴增位點為rs 16476，G3F和G3R擴增位點為rsl801133, G4F 和 G4R 擴增位點為 rsl042714。
2.根據權利要求1所述的小兒腦性癱瘓基因變異檢測用引物，其特征在于:所述8條引物的序列分別為:
GlF:5，- GCTCTGAAGAACAAATGAAAGG -3，
GlR:5’ - AAATAGGACATCAGTCTCCTCA -3’
G2F:5’ - ATCTTCATAACCTCCTGACTCTT -3’
G2R:5’ - TGTTTCCCTTGCATTTGCTATT -3’
G3F:5’ - GCTCAAGGCAGGACAGTGT -3’
G3R:5， - GGAAGAACTCAGCGAACTCAG -3，
G4F:5’ - CCGCTGAATGAGGCTTCCA -3’
G4R:5’ - AGCAGGCTCTGGTACTTGAA -3’。
3.一種用于檢測小兒腦性癱瘓基因變異的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括權利要求廣2任一項所述的引物。
4.一種使用權利要求3所述的試劑盒檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，其特征在于:依次包括如下步驟: A、提取模板DNA:從待檢者的血液中提取基因組DNA，作為PCR擴增的模板DNA ； B、PCR擴增:以上述提取的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，得到DNA擴增產物； C、PCR產物純化:采用純化板對上述DNA擴增產物進行純化，得到純化DNA； D、測序反應:采用Sanger方法對純化DNA進行測序； E、結果分析:采用測序峰圖分析軟件對測序結果進行分析。
5.根據權利要求4所述的一種檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟B中，PCR擴增的反應體系以30.Ομ?計為: 2Χ GC buffer I12.5μ? 2.5 mM dNTP4.Ομ? 1mM 引物 F1.Ομ? 1mM 引物 R1.Ομ? 10?30ng/^L 模板 DNA3.Ομ? LA Taq 聚合酶0.3μ? ddH203.2μ?。
6.根據權利要求4所述的一種檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟B中，PCR擴增的反應條件為:1)95°C預變性2min ;2)95°C變性30s，60°C退火30s、72°C延伸lmin，共35個循環；3) 72°C后延伸5min ；4) 12°C保藏； 或者，PCR擴增的反應條件為:1)95°C預變性2min ;2)95°C變性30s，57°C退火30s、72°C延伸lmin，共35個循環；3) 72°C后延伸5min ；4) 12°C保藏； 或者，PCR擴增的反應條件為:1)95°C預變性2min ;2)95°C變性30s，53°C退火30s、72°C延伸lmin，共35個循環；3) 72°C后延伸5min ；4) 12°C保藏。
7.根據權利要求4所述的一種檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟C中，PCR產物純化的步驟具體為:向96孔純化板孔中加入10PL ddH20，將上述DNA擴增產物加入96孔純化板中室溫靜置lOmin，真空抽濾1min至抽干；向96孔純化板中加入40μ? ddH20，室溫溶解lOmin，取出對應的孔中的純化產物至另一個96孔PCR板中，回收純化產物，得到純化DNA。
8.根據權利要求4所述的一種檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟D中，測序的反應體系以6.Ομ?計為: 30?50ng /μ? 純化 DNA2.Ομ? 3ρΜ測序引物Ι.Ομ? Bigdye2.0M-L DMSO1.Ομ?。
9.根據權利要求4所述的一種檢測小兒腦性癱瘓基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟D中，測序的反應條件為:1)95°C預變性2min ;2) 95°C變性30s，55°C退火30s、60°C延伸90s，共30個循環；3) 12°C保藏。
10.一種權利要求3所述的試劑盒在檢測小兒腦性癱瘓基因變異的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104278104SQ201410592802
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】何曉光, 馬可澤, 陸小梅, 彭琪, 何婷, 黎四平, 李文瑞 申請人:東莞市石龍博愛醫院