一種家蠶蠶卵微孢子蟲的lamp檢測引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組及其應用。所述引物組包括外側引物EB1-F3/EB1-B3和內側引物EB1-FIP/EB1-BIP，序列如SEQIDNO:1～4所示。本發明利用該引物建立了家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測方法和試劑盒，所述試劑盒包括上述引物組、2×反應緩沖液、陽性對照品、陰性對照品、顯色液（或熒光染色液）、 Bst DNA聚合酶、密封液和無菌水。該方法檢測的結果可在自然光下肉眼觀察或瓊脂糖凝膠電泳觀察或實時熒光曲線觀察判定。該方法操作簡單、檢測耗時短、結果易于判定，特異性強，能夠檢測濃度為5.0×10-3ng/μL的感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵DNA。
【專利說明】—種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】。更具體地，涉及一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物及其應用。

【背景技術】
[0002]家蠶微粒子病是病原性的家蠶微孢子蟲(Ab1SeaaN.b)經食下傳染或胚卵(胎)傳染，使家蠶感染發病的一種毀滅性疫病，也是目前影響我國蠶絲業持續穩定發展的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的經濟損失十分慘重。同時，野外昆蟲微孢子蟲可交叉感染家蠶，并能在蠶體間以及不同蠶期間傳播，導致大批蠶種報廢，嚴重制約蠶種貿易和蠶業可持續發展，我國已將家蠶微粒子病列為進出口動物檢疫二類疫病的檢疫名錄。各地區蠶業主管部門和相關生產單位投入大量人力、物力和財力，采取傳統顯微鏡鏡檢母蛾，淘汰帶毒母蛾產下的蠶種的常規方法進行防治家蠶微粒子病，但效果不佳。
[0003]最初人們判別家蠶是否感染家蠶微粒子病主要根據顯微鏡下組織研磨液中的微孢子蟲的形態和大小進行的，這種方法也有效地遏制了世界各地蠶區微粒子病的流行，拯救了世界的養蠶業。而對于家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測主要是通過將產卵24h后的蠶卵浸酸處理，待蠶卵孵化收蟻后進行顯微鏡檢測，這種方法不僅耗費了大量時間，而且顯微鏡鏡檢的缺點是對操作人員的技術及經驗要求較高，且很難將其他孢子類似物與家蠶微孢子蟲孢子區別開來。隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測家蠶微孢子蟲并且達到了較高的靈敏度。目前用于家蠶微粒子病PCR檢測的引物多是針對靶基因SSUrRNA的(Terry R S， Smith JE, Bouchon D, et al.Ultrastructural characterizat1n andmolecular taxonomy of Nosema granulosis sp.n., a transovarially transmitted,feminizing (TTF) microsporidium.J.Eukaryot.Microb1l.1999, (46): 492-499 ；Huang We1-Fone , Tsai Shu-Jen , Lo Chu-Fang , et al.The novel organizat1n andcomplete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis.Fungal Geneticsand B1logy, 2004.41(5): 473-481 )。但是劉吉平等(2004)(劉吉平，曹陽，Smith J.E.等.模擬感染家蠶微粒子病的PCR分子診斷技術研究.中國農業科學，2004，37 (12):1925 - 1931)研究發現，基于16SrDNA保守區段設計的引物檢測蠶卵微孢子蟲，經常會有非目的條帶及假陽性結果出現，推測蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質干擾了對病原微孢子蟲基因組DNA有效擴增。2013年本實驗室根據家蠶微孢子蟲轉錄組測序的結果，經測序驗證發現了家蠶微孢子蟲EBl基因(登錄號:KF421134.1)(專利201410279223.6)，經實驗驗證發現以EBl基因為靶序列設計的PCR引物檢測蠶卵微孢子蟲并無非特異性條帶及假陽性結果，也達到了很好的檢測靈敏度。但是使用該基因設計的PCR引物對于家蠶微孢子蟲檢測操作步驟較多，且花費時間較長，不適于野外檢測等缺點，不利于實際生產上廣泛地推廣和使用。更大的一個問題是現有公開的檢測引物均是以微孢子蟲的DNA為模板，但是微孢子蟲的分離和收集較復雜，耗時，極不利于大量檢測或現場檢測。
[0004]另一方面，微孢子蟲寄生于蠶卵中，且蠶卵含量明顯高于要檢測的微孢子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同時存在，家蠶蠶卵DNA對檢測造成嚴重的干擾，因此，如果想要直接以蠶卵DNA為模板進行微孢子蟲的檢測，對檢測提出了更高的要求。


【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是克服現有家蠶微孢子蟲檢測技術的不足，以家蠶微孢子蟲EBl基因為靶基因設計LAMP檢測引物用于檢測蠶卵微孢子蟲，提供一種比PCR檢測方法更加簡單和快速的檢測方法。
[0006]本發明的目的是提供一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組。
[0007]本發明另一目的是提供所述LAMP檢測引物的應用。
[0008]本發明再一目的是提供一種利用上述LAMP檢測引物組建立的家蠶微孢子蟲的檢測方法和試劑盒。
[0009]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
本發明提供了一組家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組，所述引物組包括一對外側引物EB1-F3/EB1-B3和一對內側引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQID NO:1?4所示。
[0010]本發明還提供所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組在制備家蠶蠶卵微孢子蟲檢測試劑盒方面的應用。
[0011]本發明提供了一種家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP檢測試劑盒，包括上述外側引物EB1-F3/EB1-B3和內側引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQ IDNO:1?4所示。
[0012]所述試劑盒還包括2X反應緩沖液、陽性對照品、陰性對照品、顯色液(或熒光染色液)、fci DNA聚合酶、密封液和無菌水。
[0013]優選地，所述2 X反應緩沖液的組分如下:20mM Tris_HCl，pH8.8 ；10mM KCl ；2 mMMgSO4 ；20mM (NH4) 2S04 ；0.1% Triton X-100 ；2.8mM dNTPs ; IM 甜菜堿；25mM MgCl20
[0014]優選地,所述陽性對照品為EBl-DNA-pMD重組質粒；所述陰性對照品為正常家蠶DNA。
[0015]所述EBl-DNA-pMD重組質粒的制備:利用引物EBlF和EB1R，以家蠶微孢子蟲DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物克隆入PMD-19T載體得到；
所述引物EBlF和EBlR的核苷酸序列如SEQ ID N0:5?6所示。
[0016]優選地，所述顯色液為10000XSYBR Green I或熒光指示劑IXSYBR Green I。
[0017]優選地，所述密封液為甘油。
[0018]另外，當檢測結果的判定采用染色法或瓊脂糖凝膠電泳法時，所述試劑盒的反應體系為:
2X反應緩沖液12.5yL
引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
模板DNA2 μ L
ddH208.5 μ L ;
當檢測結果的判定采用實時熒光法時，所述試劑盒的反應體系為: 2X反應緩沖液12.5yL
引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
熒光指示劑0.5 μ L
模板DNA2 μ L
ddH208 μ L ;
其中，所述引物EB1F3/B3的濃度為5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的濃度為20?40pmol/μ L。
[0019]建議:使用試劑盒時，對于N個樣品，應配制(Ν+3)倍體積的反應體系(包括陰性對照、陽性對照各一個，以及分裝耗費誤差)，保證各反應管分裝均勻。
[0020]所述試劑盒的LAMP反應條件為:63°C恒溫反應40?90 min ;然后95°C，放置2min滅活。
[0021]采用本發明的方法或試劑盒檢測家蠶蠶卵微孢子蟲的方法包含以下步驟:
51.提取待測樣品的|旲板DNA;
52.配置反應體系:按照上述反應體系進行配置；
53.加樣:反應體系分裝后，分別依次向反應管加入ddH20(空白對照)、各模板DNAJH性對照品、陰性對照品；然后加入20 μ L密封液(對于染色法判定結果，要在反應管管蓋內側加入I μ L顯色液，將管蓋蓋緊，注意避免顯色液掉入反應液中)；
54.反應:對于染色法和瓊脂糖凝膠電泳法判定結果的檢測，將反應管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設備中，63°C恒溫放置60min，然后95°C，放置2min滅活；對于實時熒光法判定結果的檢測，將反應管放入DeaoU-308C恒溫熒光檢測儀或其他熒光檢測儀中，63°C恒溫放置40?90min觀察結果；
55.結果判讀:結果判讀可以有染色法(顯色法)、瓊脂糖凝膠電泳法和實時熒光法；
(O染色法:將反應管管蓋內側的顯色液彈入反應管，與反應產物混合；在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應產物顏色變為綠色，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；反應產物變為橙色，則不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(2)瓊脂糖凝膠電泳法:取2μ L反應后的產物，與I μ L 6X loading buffer和8 μ LddH20混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳；若出現大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(3)實時熒光法:若有“S”型擴增曲線且擴增值超過設定的閾值為陽性，若擴增曲線的擴增值未超過設定的閾值則為陰性。
[0022]本發明制備試劑盒的陽性對照品所采用的家蠶微孢子蟲DNA模板的制備，采用Qiagen公司植物小提試劑盒，方法參照說明書進行。具體地包括以下步驟:
51.取微孢子蟲樣品200μ L，12，OOOrpm,離心5min,棄上清；然后加50 -1OOyL ddH20
重懸；
52.吸取重懸的孢子液至預冷的研缽中，液氮充分研磨(3次以上)；
53.將研磨后孢子放入1.5mL離心管中，加入400 μ L裂解緩沖液API和4 μ LRNase Α,渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ L RNase A勿在使用前混合)； 54.混勻后的溶液，65°C，孵育10min (期間上下顛倒試管2?3次)；
55.加130μ L緩沖液Ρ3，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，離心5 min ；
56.吸取上清于過濾柱中，14，OOOrpm,離心2min；
57.將離心管中上清液移至新的回收管(勿攪動出現的殘渣)，加入1.5倍體積的緩沖液AWl，移液器混合；
58.將650μ L混合液移至娃膠吸附柱中，4，200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復此步驟；
59.將娃膠吸附柱放入新回收管中，加入500μ L緩沖液AW2,4，200 rpm,離心I min;
棄上清；
510.再加入500μ L緩沖液AW2,14, 000 rpm，離心2 min (保證收集管不接觸到底部上清)；
511.移吸附柱至1.5mL或2mL離心管中；
512.加入40μ L洗脫緩沖液AE,室溫放置5 min ;4，200 rpm, I min ；
513.重復步驟S12，-20°C冰箱保存備用。
[0023]本課題組前期研究發現(專利201410279223.6)，以家蠶微孢子蟲EBl基因(登錄號:KF421134.1)為靶序列設計的PCR引物可很好的用于檢測蠶卵微孢子蟲，無非特異性條帶及假陽性結果，也達到了很好的檢測靈敏度。但是一方面其所設計的PCR引物對于家蠶微孢子蟲檢測操作步驟較多，且花費時間較長。另一方面我們對于微孢子蟲檢測的特異性和靈敏性并不滿足。
[0024]環介導等溫擴增法(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)是日本學者Notomi等(2000)發明的一種新型體外等溫擴增特異核酸片段的技術。LAMP法具有特異性強、快速、高效、敏感性高、操作簡便、檢測方法簡單等優點，肉眼即可判斷結果，從而簡化了檢測過程，檢測時間也大大縮短。其中，對于LAMP檢測方法，引物是最關鍵的一個因素。靶基因序列的選擇、引物的設計及選擇的好壞直接影響到檢測結果的好壞。即使是針對同一種靶基因序列，如何選擇合適的六個區域，并設計出合適的四條引物序列，對檢測靈敏度具有非常至關重要的作用和很大的意義。本發明人前期就是設計了一系列的多組LAMP引物，又考慮了各種因素并結合實驗結果的判斷，篩選出3組LAMP引物。進一步地，本發明人最終確定了最優的四條特異性引物，即引物組III的四條特異性引物作為LAMP檢測用引物組。
[0025]所述引物組III四條引物序列為:
EB1-F3 (SEQ ID NO:1 所示):5’- GGTCAACAGTAGAAAAGAGT-3’
EB1-B3 (SEQ ID 吣:2所示):5’_ TGCAATTAAAAAGGCTTGAA-3’
EBl-FIP(Flc+F2) (SEQ ID N0:3 所示):
5’-AGCATTTCCTTTCCCTAAATCTTCT-TAGTGAATTGGTTTAATGATCTCGG-3’
EBl-BIP(Blc+B2) (SEQ ID N0:4 所示):
5’-TTCTCAAATCCACCATACTTTCCCT-GATACTCGTATTCATTGGAAGGTT-3’
因此，上述用于微孢子蟲檢測的LAMP檢測引物組是本發明人在前期獲得家蠶微孢子蟲EBl基因及其在檢測家蠶蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲中的應用的基礎上，通過大量的探索和研究得到的，不僅克服了普通PCR操作復雜、依靠昂貴儀器的缺陷，更重要的是，本發明最大的創新點在與:1)相對于普通PCR法，本發明耗時短，檢測結果更易判定；2)相對于現有的LAMP的方法應用于微孢子蟲的檢測所使用的引物，本方法所用引物直接以家蠶蠶卵DNA為模板，不僅很好的克服了家蠶蠶卵DNA對檢測造成的干擾，使檢測結果更加可靠，且靈敏度非常好。總之，該方法操作簡單、檢測耗時短、結果易于判定，特異性強，能夠檢測感染了家蠶微粒子病的I粒蠶卵。
[0026]本發明具有以下有益效果:
本發明公開了一組用于家蠶微孢子蟲檢測的LAMP引物組，是以EBl基因序列為靶基因設計EB1F/1R引物，使用該PCR引物驗證靶基因的特異性，結果表明該引物具有特異性，再以該引物為參考，EBl基因為靶基因設計多組LAMP引物，根據LAMP引物的設計原則以及各組引物的擴增序列位置篩選出3組LAMP引物，然后根據引物的有效性實驗進一步篩選出一組即四條特異性引物作為LAMP檢測用引物，即外側引物EB1-F3/EB1-B3和內側引物EB1-FIP/EB1-BIP ;同時在只有四條特異性引物完全識別靶基因的6個區域的情況下，才能進行擴增，從而保證了其對家蠶微孢子蟲EBl基因擴增的特異性和檢測的全面性。
[0027]本發明利用該LAMP引物組進一步建立了微孢子蟲的LAMP快速檢測方法及試劑盒，以四條LAMP引物、LAMP試劑和顯色液或熒光染色液等，構成檢測反應體系，在63 °C的恒溫條件下，快速擴增模板DNA，能夠檢測濃度為5.0X 10_3ng/ μ L的感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵DNA，能夠檢測12拷貝/ μ L的重組質粒EBl-DNA-pMD，添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵I粒時，即可檢測到。對微孢子蟲的檢測靈敏度又提高了一個數量級，這對微孢子蟲的檢測具有重要的意義。
[0028]更重要的是，微孢子蟲樣品寄生于蠶卵中，且蠶卵含量明顯高于要檢測的微孢子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同時存在，對檢測提出了更高的要求。因此，本發明最大的創新點就在與:直接以添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵DNA為模板進行微孢子蟲檢測，省去了微孢子蟲分離的復雜耗時步驟，本方法所用引物不僅很好地避免克服了家蠶蠶卵DNA對檢測造成的干擾，使檢測結果更加可靠，且檢測靈敏度非常好。
[0029]本發明采用LAMP技術，采用恒溫擴增，不需要像PCR儀一樣擴增程序復雜且價格昂貴的擴增儀器。本發明對反應體系進行優化，整個反應可在40?90min內完成，大大縮短了檢測時間。進一步降低了微孢子蟲檢測的人力物力成本。
[0030]本發明的檢測方法對檢測結果的判定有多重選擇，且均易于觀察判定:(1)顯色法:在反應產物中加入顯色液，通過直觀的顯色反應，可以在自然光下肉眼觀察判讀檢測結果；(2)瓊脂糖凝膠電泳法:根據電泳條帶可以更加直觀的觀察反應結果，且更有說服力，對于假陽性檢測結果也可以輕易地排除掉，但是電泳操作前的開蓋加樣要與配置反應體系在不同房間進行，以減少開蓋后對以后的實驗造成不必要的污染；(3)實時熒光法，可以通過擴增曲線直觀的判斷結果，且對于濃度高的樣品結果的判定可以提前結束，減少了不必要的時間浪費，但是儀器價格較為昂貴，對于經費比較充足的實驗室或者公司可以使用。
[0031]綜上所述，本發明所述的家蠶病原微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，操作簡單、耗時短、不需要復雜的儀器及復雜的擴增程序、雜質對擴增的干擾較小且反應結果易于判定，特異性強，為應用LAMP技術進行家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測和保證蠶種的質量提供重要基礎和技術儲備，不僅適合于現場或野外檢測，利于實際生產上廣泛地推廣和使用，還能較好地滿足科研院校、蠶種生產單位及蠶種質檢中心的檢毒需要，易于大范圍推廣應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為兩條PCR引物檢測健康蠶卵和添毒蠶卵的電泳圖，M:DL 2000 DNA Marker ；1:添毒家蠶蠶卵DNA ；2:家蠶微孢子蟲DNA ；3:正常家蠶蠶卵DNA ；4:ddH20。
[0033]圖2為普通PCR引物及本發明初選的三組LAMP引物組在EBl基因上的位置示意圖。
[0034]圖3為本發明的四條LAMP引物在靶基因序列上的位置示意圖。
[0035]圖4為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照(重組質粒EBl-DNA-pMD )的結果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果)。
[0036]圖5為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照(重組質粒EBl-DNA-pMD )的結果(顯色法檢測結果)。
[0037]圖6為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照(重組質粒EBl-DNA-pMD )的結果(實時熒光法檢測結果)。
[0038]圖7為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產蠶卵DNA的靈敏性結果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果)。
[0039]圖8為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產蠶卵DNA的靈敏性結果(顯色法檢測結果)。
[0040]圖9為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產蠶卵DNA的靈敏性結果(實時熒光法檢測結果)。
[0041]圖10為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同粒數添毒蠶卵的檢測結果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果)。
[0042]圖11為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同粒數添毒蠶卵的檢測結果(顯色法檢測結果)。
[0043]圖12為本發明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同粒數添毒蠶卵的檢測結果(實時熒光法檢測結果)。

【具體實施方式】
[0044]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試齊U、方法和設備。
[0045]除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0046]實施例1引物設計
1、根據實驗室通過轉錄組測序方法并通過克隆測序方法驗證的家蠶微孢子蟲EBl基因(Access1n number:KF421134.1)序列,通過BLAST軟件進行同源性分析,發現并無相似性序列，本發明以該基因為靶基因設計了一組PCR引物:引物EBIF和EBIR。
[0047]引物EBlF的序列(SEQ ID NO: 5所示)為:
5， GGTCAACAGTAGAAAAGAGTTAGTG 3，
引物EBlR的序列(SEQ ID NO:6所示)為:
5’ CTTCTTCTAAATCCTCAATTCTCTT 3’ 2、使用上述PCR引物檢測健康蠶卵和感染了家蠶微孢子蟲的蠶卵，結果顯示，該引物對于家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測具有特異性(如附圖1所示)。
[0048]因此基于該PCR引物擴增片段位置，以EBl基因為LAMP引物設計的靶基因，使用在線軟件 Primer ExplorerV4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0 /index.htmL),設計多組LAMP引物，根據LAMP引物的設計原則以及各組引物的擴增序列位置篩選出3組LAMP引物，即引物組1、引物組II和引物組III。
[0049]( I)引物組I四條引物序列為:
1F3:5’ - CTTCCAATGAATACGAGTA-3’
1B3:5’- CATCTTGTCTTCTTCTGTT-3’
IFIP:5’- CTCTACTGGAAAATACAATTCAA-AGAATATGAAGATAATTCAAGCC-3，
IBIP:5’- AGAAGTAGCTCAAAAGTTGT-ACTTTACTTTTCCCATAACTCA-3’
(2)引物組II四條引物序列為:
2F3:5’- GAGTAAATCTATCTCAGAATGT-3’
2B3:5’- CGCCTTAAATTTACAAATCTCAAGA-3’
2FIP:5’- CAAGCTTCTCGATCAAGTG-CCAAAAGAATCTCCTAAAAAACCG-3，
2BIP:5’- ATGCAAGATGAAGAAAAAAAGAG-CTTTTTCATTAATGGTCTCT-3’
(3)引物組III四條引物序列為:
EB1-F3 (SEQ ID NO:1 所示):5’- GGTCAACAGTAGAAAAGAGT-3’
EB1-B3 (SEQ ID 吣:2所示):5’_ TGCAATTAAAAAGGCTTGAA-3'
EBl-FIP(Flc+F2) (SEQ ID N0:3 所示):
5’- AGCATTTCCTTTCCCTAAATCTTCT-TAGTGAATTGGTTTAATGATCTCGG-3’
EBl-BIP(Blc+B2) (SEQ ID N0:4 所示):
5’- TTCTCAAATCCACCATACTTTCCCT-GATACTCGTATTCATTGGAAGGTT-3’
上述普通PCR引物及本發明初選的三組LAMP引物組在EBl基因上的位置示意圖如附圖2所示。
[0050]3、然后根據引物的有效性實驗，又考慮了各種因素并結合實驗結果的判斷，進一步篩選出引物組III的四條特異性引物作為LAMP檢測用引物，該引物組在靶基因序列上的位置示意圖如附圖3所示。
[0051]實施例2試劑盒制備
1、家蠶微孢子蟲DNA模板的制備，采用Qiagen公司植物小提試劑盒，方法參照說明書進行。具體地包括以下步驟:
51.取微孢子蟲樣品200μ L，12，OOOrpm，離心5min，棄上清；然后加50?100 μ L ddH20重懸；
52.吸取重懸的孢子液至預冷的研缽中，液氮充分研磨(3次以上)；
53.將研磨后孢子放入1.5mL離心管中，加入400 μ L裂解緩沖液API和4 μ LRNase Α,渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ L RNase A勿在使用前混合)；
54.混勻后的溶液，65°C，孵育10min (期間上下顛倒試管2?3次)；
55.加130μ L緩沖液Ρ3，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，離心5 min ；
56.吸取上清于過濾柱中，14，OOOrpm，離心2min； 57.將離心管中上清液移至新的回收管(勿攪動出現的殘渣)，加入1.5倍體積的緩沖液AWl，移液器混合；
58.將650μ L混合液移至娃膠吸附柱中，4，200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復此步驟；
59.將娃膠吸附柱放入新回收管中，加入500μ L緩沖液AW2,4，200 rpm,離心I min;
棄上清；
510.再加入500μ L緩沖液AW2,14, 000 rpm，離心2 min (保證收集管不接觸到底部上清)；
511.移吸附柱至1.5mL或2mL離心管中；
512.加入40μ L洗脫緩沖液AE,室溫放置5 min ;4，200 rpm, I min ；
513.重復步驟S12，-20°C冰箱保存備用。
[0052]2、制備陽性和陰性對照品
用上游引物EBlF和下游引物EBlR為反應引物，以家蠶微孢子蟲DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物克隆入PMD-19T載體獲得EBl-DNA-pMD質粒并作為檢測的陽性對照品。
[0053]提取的正常家蠶DNA作為陰性對照品。
[0054]3、其他試劑
(1)2X反應緩沖液
組分如下:20mM Tris-HCl，ρΗ8.8 ；10mM KCl ；2 mM MgSO4 ；20mM(NH4)2S04 ；0.1% TritonX-100 ；2.8mM dNTPs ;1M 甜菜堿；25mM MgCl20
[0055](2)顯色液 10000XSYBR Green I (或熒光指示劑 IXSYBR Green l\Bst DNA 聚合酶、密封液甘油和無菌水。
[0056]4、試劑盒組裝
按照一定的規格，將以下組分進行分裝:用引物組EB1F3/B3作為外部引物，EBlFIP/BIP 作為內部引物(EB1F3/B3 濃度為 5pmol/y L, EB1FIP/BIP 濃度為 20 ?40 pmol/μ L),2X反應緩沖液，陽性對照品，陰性對照品，DNA polymerase (8U/μ L)，密封液，顯色液(10000 X SYBR Green I);熒光指示劑(I X SYBR Green I);滅菌ddH20。即為家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測試劑盒的所有檢測試劑。
[0057]實施例3試劑盒檢測方法
1、所述試劑盒的LAMP反應條件為:63°C恒溫反應40?90 min ;然后95°C，放置2 min滅活。
[0058]2、當檢測結果的判定采用染色法或瓊脂糖凝膠電泳法時，所述試劑盒的反應體系為:
2X反應緩沖液12.5yL
引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
模板DNA2 μ L
ddH208.5 μ L ;
當檢測結果的判定采用實時熒光法時，所述試劑盒的反應體系為:
2X反應緩沖液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
熒光指示劑0.5 μ L
模板DNA2 μ L
ddH208 μ L ;
其中，所述引物EB1F3/B3的濃度為5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的濃度為20?40pmol/μ L。
[0059]建議:使用試劑盒時，對于N個樣品，應配制(Ν+3)倍體積的反應體系(包括陰性對照、陽性對照各一個，以及分裝耗費誤差)，保證各反應管分裝均勻。
[0060]3、檢測步驟如下:
51.提取待測樣品的|旲板DNA;
52.配置反應體系:按照上述反應體系進行配置；
53.加樣:反應體系分裝后，分別依次向反應管加入2μL的ddH20(空白對照)、各模板DNA、陽性對照品；然后加入20 μ L密封液，(對于染色法判定結果，要在反應管管蓋內側加入IuL顯色液，將管蓋蓋緊(注意避免顯色液掉入反應液中)；
54.反應:對于染色法和瓊脂糖凝膠電泳法判定結果的檢測，將反應管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設備中，63°C恒溫放置60min，然后95°C，放置2 min滅活；對于實時熒光法判定結果的檢測，將反應管放入DeaoU-308C恒溫熒光檢測儀或其他熒光檢測儀中，63°C恒溫放置40?90min觀察結果；
55.結果判讀:結果判讀可以有染色法(顯色法)、瓊脂糖凝膠電泳法和實時熒光法；
(O染色法:將反應管管蓋內側的顯色液彈入反應管，與反應產物混合；在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應產物顏色變為綠色，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；反應產物變為橙色，則不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(2)瓊脂糖凝膠電泳法:取2μ L反應后的產物，與I μ L 6X loading buffer和8μ LddH2O混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳；若出現大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(3)實時熒光法:若有“S”型擴增曲線且擴增值超過設定的閾值為陽性，若擴增曲線的擴增值未超過設定的閾值則為陰性。
[0061]其中，步驟SI所述待測樣品，家蠶蠶卵及添加家蠶微孢子蟲的家蠶所產蠶卵模板DNA的制備方法(QIAGEN公司植物小提試劑盒):
取健康家蠶蠶卵或添食家蠶微孢子蟲的家蠶所產蠶卵樣品10?50粒，液氮充分研磨(3次以上)；將研磨后孢子放入1.5 mL離心管中，加入400 UL裂解緩沖液APl和4 μ LRNase Α,渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ L RNase A勿在使用前混合);混勻后的溶液，65°C，孵育10 min (期間上下顛倒試管2?3次)；加130 μ L緩沖液Ρ3，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm,離心5 min ;吸取上清于過濾柱中，14，OOOrpm,離心2min ;將離心管中上清液移至新的回收管(勿攪動出現的殘渣)，加入1.5倍體積的緩沖液AW1，移液器混合；將65(^ L混合液移至娃膠吸附柱中，4，200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復此步驟；將硅膠吸附柱放入新回收管中，加入500 μ L緩沖液AW2，4，200 rpm，離心I min ;棄上清；再加入500 μ L緩沖液Aff2,14，000 rpm，離心2 min (保證收集管不接觸到底部上清);移吸附柱至1.5mL或2mL離心管中；加入40 μ L洗脫緩沖液AE，室溫放置5 min ；4, 200 rpm,I min;重復步驟S12，-20°C冰箱保存備用。
[0062]實施例4應用試劑盒檢測家蠶病原微孢子蟲 1、不同濃度陽性對照品檢測
利用實施例3的檢測方法，對不同濃度陽性對照(重組質粒EBl-DNA-pMD)進行檢測，結果如附圖4?6所示。圖中，M為DL2000 DNA Marker ; 1-7分別為稀釋16-1Oci拷貝/ μ L的重組質粒EBl-DNA-pMD ；8為ddH20空白對照。
[0063]結果顯示，本發明的引物及其試劑盒能夠檢測12拷貝/yL的重組質粒EBl-DNA-pMD。
[0064]2、檢測靈敏度
(I)利用實施例3的檢測方法，對不同濃度的感染微孢子蟲的家蠶所產蠶卵的DNA進行檢測，結果如附圖7?9所示。圖中，M為DL2000 DNA Marker ; 1-7分別為:5.0X 10° ng/μ L、5.0XlO-1 ng/μ L、5.0X 1(T2 ng/μ L、5.0 X l(T3ng/μ L、5.0 X 1(T4 ng/μ L、5.0 X l(T5ng/μ L,5.ΟΧΙΟ-6 ng/μ L ；8 為 ddH20 空白對照。
[0065]結果顯示，本發明的引物及其試劑盒能夠檢測濃度為5.0X 10_3 ng/μ L的感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產蠶卵DNA。
[0066](2)利用實施例3的檢測方法，對不同粒數添毒蠶卵進行檢測，結果如附圖10?12所示。圖中，M為DL2000 DNA Marker ; 1_4號管分別為添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵I粒，5粒，10粒，20粒所提的DNA ；5為添毒家蠶蠶卵DNA ；6為正常家蠶蠶卵DNA ；7為ddH20空白對照。
[0067]結果顯示，本發明的引物及其試劑盒檢測特異性和靈敏性都很優異，針對添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的一粒蠶卵所提的DNA都能夠很特異清晰的檢測出來。
[0068]綜上所述，本發明的引物及其試劑盒對家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測靈敏度較優異且耗費時間較短，這對原種生產中家蠶微粒子病的快速檢測具有重要的意義。
【權利要求】
1.一組家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組，其特征在于，所述引物組包括一對外側引物EB1-F3/EB1-B3和一對內側引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQID NO:1?4所示。
2.權利要求1所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組在制備家蠶蠶卵微孢子蟲檢測試劑盒方面的應用。
3.一種家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括一對外側引物EB1-F3/EB1-B3和一對內側引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?4所示。
4.根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2X反應緩沖液、陽性對照品、陰性對照品、顯色液或熒光染色液、Bst DNA聚合酶、密封液和無菌水。
5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述2X反應緩沖液的組分如下:20mMTris-HCl,pH8.8 ；10mM KCl ；2 mM MgSO4 ；20mM(NH4)2S04；0.1% Triton X-100 ；2.8mM dNTPs ；IM 甜菜喊；25mM MgCl20
6.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為EBl-DNA-pMD重組質粒；所述陰性對照品為正常家蠶DNA ； 所述EBl-DNA-pMD重組質粒的制備:利用引物EBlF和EB1R，以家蠶微孢子蟲DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物克隆入PMD-19T載體得到； 所述引物EBlF和EBlR的核苷酸序列分別如SEQ ID N0:5?6所示。
7.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述顯色液為10000X SYBR Green I或者熒光指示劑I X SYBR Green I。
8.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述密封液為甘油。
9.根據權利要求3?8任一所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應體系如下: 當檢測結果的判定采用染色法或瓊脂糖凝膠電泳法時，反應體系為: 2X反應緩沖液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L 模板DNA2 μ L ddH208.5 μ L ; 當檢測結果的判定采用實時熒光法時，反應體系為: 2X反應緩沖液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L 熒光指示劑0.5 μ L 模板DNA2 μ L ddH208 μ L ; 其中，所述引物EB1F3/B3的濃度為5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的濃度為20?40pmol/μ L。
10.根據權利要求3?8任一所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的LAMP反應條件為:63°C恒溫反應40?90 min ;然后95°C，放置2 min滅活。
【文檔編號】C12Q1/04GK104372082SQ201410592811
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】劉吉平, 程偉, 宋小景, 晏育偉 申請人:華南農業大學