一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其包括以下步驟：(1)待原代培養分離后的人羊膜間充質干細胞融合度達到80～90％后，吸去培養皿中的培養液，加入PBS清洗，然后吸去PBS；(2)往培養皿中加入tryplE,轉移至CO2培養箱孵育1-2min后，加入完全培養基，反復吹打，至80-90％的細胞不再貼壁；(3)離心；(4)棄去上清液，用完全培養基重懸細胞沉淀，吹打混勻，得到的細胞懸液用細胞計數儀計數；(5)細胞懸液接種培養皿中，調整細胞密度為1.3×104/cm2,然后加入含有10ng/ml EGF的完全培養基，將培養基轉至CO2細胞培養箱中進行培養。本發明能獲得大量的活力高的干細胞。
【專利說明】_種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法

【技術領域】
[0001]本發明干細胞【技術領域】，具體涉及一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法。

【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，在適宜的體內或體外環境下，可以誘導分化成多種不同的細胞，如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞、肝細胞、肌細胞、神經細胞等。間充質干細胞首先在骨髓中發現，隨后分別在脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在臍帶、臍帶血、胎盤組織中分離和制備間充質干細胞。間充質干細胞不僅能作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，還支持造血和促進造血干細胞植入、調節免疫，治療多種疾病。
[0003]目前用得最多的是骨髓來源的間充質干細胞，其不足之處在于受到年齡老化的限制，細胞增殖、分化能力降低，其次骨髓間充質干細胞在異體移植時引起免疫反應，影響間充質干細胞的研宄與應用。最新研宄顯示，從胎盤組織中可以分離、培養得到間充質干細胞，通過鑒定其生物特征，可知其具有很強的增殖分化能力，免疫原性低。
[0004]現有培養羊膜間充質干細胞采用酶方法，具體方法是:觀察培養細胞貼壁生長至80?90%匯合時，吸棄培養皿原有培養基，吸取PBS緩沖液加入培養皿洗滌，棄去洗液；加入(0.5?0.125% )胰酶-0.01% EDTA消化液，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察；加入FBS (或含FBS的DMEM/F12完全培養基)終止胰酶消化；反復吹打沖洗，在室溫下100rpm左右離心5?10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細胞，按1: (3?5)接種比例傳代培養；置37°0，5% C02，95%濕度的細胞培養箱中培養；待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行多代細胞培養擴增。
[0005]上述胎盤羊膜間充質干細胞的分離與傳代大規模培養中，在細胞傳代過程中使用胰酶進行細胞消化，傳代過程中使用0.5%?0.125%胰酶消化細胞，通常不能準確根據細胞生長活力狀態來選擇胰酶濃度及作用時間(lmin-5min)，常會超過一定程度而導致細胞傳代后不能貼壁或者死亡，對細胞損傷過大，細胞增殖力下降。當細胞連續傳代多次，則會出現細胞老化死亡現象。而接種密度按照1: (3?5)來接種細胞，在大規模培養及傳代中，這會增加工作量，無法一次收集大量均一的細胞。另外，羊膜干細胞的應用代數限制在6代以內，大大的限制了羊膜干細胞的應用。
[0006]因此急需建立一套有效的胎盤羊膜間充質干細胞大規模培養技術，滿足間充質干細胞在科學研宄與應用上的需要。該技術屬于方法類技術。


【發明內容】

[0007]本發明的目前在于建立一套有效的胎盤羊膜間充質干細胞大規模培養技術，提供了一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，該方法采用非酶消化(TrypLE)技術，克服了酶解對細胞的損傷，同時尋找最適合的傳代接種密度，設計適合的培養基，進而將羊膜間充質干細胞的傳代次數提高至15代以上仍然能保持原來的干性，從而滿足間充質干細胞在科學研宄與應用上的需求。
[0008]本發明的技術方案如下:
[0009]一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于包括以下步驟:
[0010](I)原料清洗:待原代培養分離后的人羊膜間充質干細胞融合度達到80?90%后，吸去培養皿中的培養液，加入PBS清洗，然后吸去培養皿中的PBS ；
[0011](2)消化:往培養皿中加入tryplE，轉移至CO2培養箱孵育l_2min后，加入完全培養基，用巴氏吸管反復吹打，至待80-90%的細胞不再貼壁，終止消化；
[0012](3)離心:將步驟(2)得到細胞懸液離心管中，1000rpm/min離心5min ；
[0013](4)計數:離心結束后，棄去上清液，用完全培養基重懸細胞沉淀，吹打混勻，得到的細胞懸液用細胞計數儀計數；
[0014](5)鋪板及培養:將步驟⑷的細胞懸液接種培養皿中，調整細胞密度為1.3 XlOVcm2,然后加入含有10ng/ml EGF的完全培養基，將培養基轉至CO2細胞培養箱中進行培養。
[0015]優選地，步驟(I) PBS液是沿培養皿壁加入，不直接沖洗培養皿底部。
[0016]優選地，步驟(I)PBS液加入培養皿后要前后左右晃動。
[0017]優選地，步驟(2)中tryplE的最低用量以剛好覆蓋培養皿底部為準。
[0018]優選地，步驟(2)直徑為1cm的培養皿加入的2?3ml的tryplE。
[0019]優選地，所述完全培養基為含10%牛血清的DMEM/F12培養基。
[0020]優選地，步驟(2)直徑為1cm的培養皿加入3?5ml完全培養基。
[0021]優選地，步驟(4)的細胞懸液先與臺盼藍按照1:1的比例混合染色后，在一小時內計數。
[0022]優選地，步驟(5)加入含有EGF的完全培養基后，要前后左右晃動培養皿混勻。
[0023]優選地，步驟(5)使用直接為15cm的培養皿，培養基的用量為10?15ml。使用規格大的培養皿可大規模擴增細胞，滿足應用需要。
[0024]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0025]1、本發明在羊膜間充質干細胞傳代培養過程中，細胞傳代培養中，發明了非酶消化技術(TrypLE消化)收集貼壁的脂肪間充質干細胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度減少細胞消化過程中對細胞的損傷，尋找到1.3 X 1Vcm2最佳接種密度培養細胞，使用含10%的DMEM/F12培養基，并在培養基中加入合適濃度的EGF(10ng/ml)，在Φ 15cm的培養皿中進行大規模的培養，能夠獲得大量的干細胞，且干細胞的活力高，15代培養后仍然保持完整的干性不出現衰老現象。
[0026]2、本發明采用非酶法收集貼壁的羊膜間充質干細胞，且用量低，大大減小了細胞的損傷，獲得的細胞形態良好，呈現梭形，簇團性生長趨勢，而且經細胞計數儀鑒定，細胞活力達到90%以上，符合細胞傳代及儲存條件。
[0027]3、本發明探索出最適合大規模培養的條件，選擇1.3X 1Vcm2最佳接種密度培養細胞，并使用含10%的DMEM/F12培養基，一在培養基中加入合適濃度的EGF(10ng/ml)，在Φ 15cm的培養皿中進行大規模的培養，培養的細胞增殖快，收獲細胞數量大，2.5?3.5天即可長至80?90%。Φ 1cm細胞培養皿收獲的細胞總數可達3?4X106，Φ 15cm細胞培養皿收獲細胞可達6?8X 106。羊膜干細胞能夠長期進行傳代，15代之后仍然保持完整的干性，不出現衰老跡象。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發明的非酶法與現有酶法傳代培養的細胞形態對比圖；
[0029]其中，A為現有酶法第I代MSCs細胞(X 100) ；B為現有酶法第6代MSCs細胞(X100) ;C為非酶法第I代MSCs細胞(X100) ;D為非酶法第6代MSCs細胞(X 100)，E為非酶法第15代細胞(X100) ο
[0030]圖2為本發明的非酶法與現有酶法傳代培養的細胞增殖曲線對比圖。
[0031]圖3為本發明的非酶法獲得的第I代細胞的表面標記物流式檢測結果。
[0032]圖4為本發明的非酶法獲得的第6代細胞的表面標記物流式檢測結果。
[0033]圖5為本發明的非酶法獲得的第15代細胞的表面標記物流式檢測結果。
[0034]圖6為本發明非酶法傳代培養第P15代細胞成脂分化狀態圖。
[0035]圖7為本發明非酶法傳代培養的羊膜間充質干細胞成骨誘導后細胞形態變化(X100)圖。

【具體實施方式】
[0036]下面通過具體實施例子對本發明的技術方案做進一步詳細介紹，以便清楚本發明所要保護的技術方案及能夠達到的技術效果。
[0037]在介紹具體實施例子之前，先對實施例涉及到的術語進行解釋:
[0038]胰酶:0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(是質量/體積百分數)
[0039]PBS:磷酸緩沖液
[0040]EGF:上皮生長因子
[0041]IBMX:3_異丁基-1-甲基化黃嘌呤
[0042]實施例1
[0043]一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，具體方法如下:
[0044](I)觀察選材:取出人羊膜間充質干細胞分離培養皿，培養皿的規格為Φ 10cm，置于倒置相差顯微鏡下進行觀察，拍照。當細胞匯合度至80-90%，即可進行細胞傳代操作。
[0045](2)清洗:用巴氏吸管吸去培養皿中培養液；用移液管向每個培養皿內加適量的PBS進行清洗2次后，用移液管吸去培養皿中的PBS。所述巴氏吸管量程為3ml，移液管量程為10ml。每次清洗PBS的用量為10ml，PBS沿著培養皿壁加入，不得直接沖洗培養皿底部，加入PBS清洗的培養皿要前后、左右晃動，10次左右。
[0046](3)消化:往培養皿加入tryplE，加入2?3ml的tryplE覆蓋培養皿底部，轉移培養皿至C02培養箱孵育l_2min后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，隨后加入完全培養基，輕輕吹打混勻，終止消化。所述培養基為人羊膜間充質干細胞培養基(DMEM/F12按照1:1混和，10%胎牛血清)，培養基的加入量為3ml?5ml。待80-90%細胞不再貼壁，可以進行終止消化。
[0047](4)離心:將步驟3得到細胞懸液1ml移液管轉移至15ml離心管中，1000rpm/min離心5min。
[0048](5)計數:離心結束后，棄去上清液，細胞沉淀先用0.4%臺盼藍按照1:1混合染色，再用5ml完全培養基重懸細胞沉淀。在Ih內吹打混勻，取20 μ I細胞懸液用細胞計數儀計數，測定細胞總數與細胞活力。所述細胞計數儀采用為Countstar自動細胞計數儀。
[0049](6)鋪板及培養:將細胞懸液接種到細胞培養皿中，調整細胞密度為1.3X104/cm2,加入1ml完全培養基(Φ 1cm培養皿)或者15ml完全培養基(Φ 15cm培養皿)，加入EGF至終濃度10ng/ml，前后、左右晃動培養皿混勻5_10次。轉移至5% C02、37°C、飽和濕度為95%的細胞培養箱中進行培養。
[0050](7)觀察:傳代后每隔24h在光學顯微鏡下觀察細胞形態及生長匯合度，根據細胞生長狀態，進行下一步的細胞傳代或凍存以及其他用途。
[0051]實施例2
[0052]將羊膜間充質干細胞進行分離后，獲得PO代細胞，按照本發明無酶法進行傳代，與傳統酶解消化細胞的方法作為對照。連續傳代，在光學顯微鏡下觀察第I代、第6代、第15代細胞生長形態。鏡下觀察結果見附圖2。
[0053]結果顯示:培養過程中，發現通過無酶法，細胞形態相對均一，增殖速度快，貼壁速度快，傳代至15代以上，其形態及生長特點亦無明顯改變。而傳統酶解消化細胞傳代方法，在第6代后細胞形態發生改變，增殖速率降低。并且無法傳代至15代。
[0054]實施例3
[0055]本發明的非酶法與現有酶法傳代培養的細胞增殖速度的比較。
[0056]分別取通過非酶法傳代的第3代羊膜間充質干細胞，及用現有酶法得到的第3代羊膜間充質干細胞，按照2 X 14細胞/孔接種于24孔板中，分別每隔48h消化收集3孔細胞，用0.4%的臺盼藍染色計數活細胞數量，算出平均值，繪制兩者細胞生長曲線，結果見附圖2。
[0057]結果顯示:非酶法得到的細胞倍增時間為明顯優于酶法傳代的細胞。
[0058]實施例4
[0059]本發明的非酶法傳代培養的細胞表面標記物檢測(P1、P2、P3)
[0060](I)分別取第1、6、15代細胞，用流式細胞儀檢測不同代數之間的細胞表面標志。分別消化收集細胞，計數后每個批次取4 X 106個細胞，分裝4管；染色緩沖液洗I次，200g離心5min ;棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細胞；加入⑶45、⑶59、⑶90及HLA-DRA抗體各10 μ 1，并設一管為空白對照；在4°0下，避光反應15-20min ;染色緩沖液洗一次，1500rpm離心5min ;直接標記的細胞棄上清，避光加入500ul的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網過濾細胞樣品，流式細胞儀檢測細胞表面抗原。
[0061]流式細胞儀檢測細胞的表面標志，觀察到第1、6、15代的細胞的表面標記物沒有明顯改變。造血細胞表面標志⑶45(白細胞陽性)、HLA-DR(MHC-1I類分子)為均呈現陰性，同時⑶59、⑶90均呈現陽性。第三代以后的羊膜間充質干細胞，細胞形態均一，純度在90%以上。
[0062]實施例5
[0063]本發明非酶法傳代培養第P15代細胞成脂分化實驗
[0064]細胞培養至第14代時，按照5 X 13細胞/cm 2接種于六孔板中，加入完全培養基，放置37°C、5% CO2培養箱培養。待細胞生長匯合度至80-90%左右，加入成脂誘導培養基進行培養。成脂誘導培養基包括基礎培養基DMEM、10%胎牛血清、0.5mM IBMX、IuM地塞米松、10uM吲哚美辛、5ug/ml胰島素、2mm/L谷氨酰胺等，每三天換液。三周后進行油紅O染色，鑒定脂滴形成情況。結果見圖6。
[0065]結果顯示:培養三周后，鏡下觀察羊膜間充質干細胞經過油紅O染色后，約90%的細胞富含脂肪滴，說明間充質干細胞依然可以具有誘導分化為脂肪細胞的能力。
[0066]實施例6
[0067]本發明非酶法傳代培養第P15代細胞成骨試驗
[0068]細胞培養至第14代進行傳代時，按照5X 13細胞/cm 2接種于明膠涂層的六孔板中，加入完全培養基，放置37°C、5% CO2培養箱培養。待細胞生長匯合度至90%左右，加入成骨誘導培養基進行培養。成骨誘導培養基包括:基礎培養基DMEM/F12、10%胎牛血清、50 μ M抗壞血酸、1mM β-磷酸甘油、0.1uM地塞米松。每2_3天換液，細胞在2_3周后進行固定及茜素紅染色。結果見附圖7。
[0069]結果顯示:成骨誘導培養的第15代間充質干細胞形態由梭形變成立方形，3周后出現鈣化結節(圖7-C)。染色比較明顯，細胞已向成骨細胞轉化。說明干細胞可以在體外誘導分化為成骨細胞。
[0070]結論:通過以上實施例可以得知，在人羊膜間充質干細胞的傳代培養技術中，使用傳統Trypsin胰酶存在以下缺點:
[0071]1、細胞損傷大一 Trypsin抑制劑需要將酶快速滅活，這會導致細胞損失或死亡。
[0072]2、冷凍保存一 Trypsin必須保存在一 20°C，在經過多次反復凍融或在4°C長期保存后，穩定性喪失。
[0073]3、批間差異大一 Trypsin為動物源性，批次之間差異性大。
[0074]相比之下，TrypLE在人羊膜間充質干細胞的傳代培養技術中在以下優點:
[0075]1、細胞損失小一 TrypLE為非動物源性的消化酶，更純，對細胞損失更小。由于TrypLE作用細胞溫和，不需要Trypsin酶抑制劑。
[0076]室溫保存穩定性高一 TrypLE可以穩定的保存于室溫，節省了冷凍空間，同時提供即時可用的便利。
[0077]應用范圍廣一 TrypLE是在有血清或無血清環境中培養的多種不同細胞系的理想選擇，可以直接替代現有步驟中所用的0.25% trypsin EDTA試劑。
[0078]根據上述說明書的揭示和教導，本發明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發明并不局限于上面揭示和描述的【具體實施方式】，對本發明的一些修改和變更也應當落入本發明的權利要求的保護范圍內。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發明構成任何限制。
【權利要求】
1.一種人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于包括以下步驟: (1)原料清洗:待原代培養分離后的人羊膜間充質干細胞融合度達到80?90%后，吸去培養皿中的培養液，加入PBS清洗，然后吸去培養皿中的PBS ； (2)消化:往培養皿中加入tryplE，轉移至CO2培養箱孵育l_2min后，加入完全培養基，用巴氏吸管反復吹打，至80-90 %的細胞不再貼壁，終止消化； (3)離心:將步驟⑵得到細胞懸液離心管中，1000rpm/min離心5min； (4)計數:離心結束后，棄去上清液，用完全培養基重懸細胞沉淀，吹打混勻，得到的細胞懸液用細胞計數儀計數； (5)鋪板及培養:將步驟⑷的細胞懸液接種培養皿中，調整細胞密度為1.3XlOVcm2,然后加入含有10ng/ml EGF的完全培養基，將培養基轉至CO2細胞培養箱中進行培養。
2.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(I)PBS液是沿培養皿壁加入，不直接沖洗培養皿底部。
3.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(I)PBS液加入培養皿后要前后左右晃動。
4.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(2)中tryplE的最低用量以剛好覆蓋培養皿底部為準。
5.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(2)直徑為1cm的培養皿加入的2?3ml的tryplE。
6.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:所述完全培養基為含10%牛血清的DMEM/F12培養基。
7.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(2)直徑為1cm的培養皿加入3?5ml完全培養基。
8.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(4)的細胞懸液先與臺盼藍按照1:1的比例混合染色后，在一小時內計數。
9.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(5)加入含有EGF的完全培養基后，要前后左右晃動培養皿混勻。
10.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞傳代培養方法，其特征在于:步驟(5)使用直接為15cm的培養皿，培養基的用量為10?15ml。
【文檔編號】C12N5/0775GK104450610SQ201410715000
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 馮德龍, 王小燕, 馬巖巖 申請人:廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司