一種棉花葉片dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種棉花葉片DNA提取方法，包括在棉花子葉或成株倒葉片中加入預處理緩沖液，研磨后，離心棄上清，加入TPS提取緩沖液90-97攝氏度水浴或金屬浴，離心，即得到含有葉片DNA的上清液。本發(fā)明DNA提取材料選用棉花出苗之后到打頂之前任何時期的葉片，與其他快速DNA提取方法相比，DNA質(zhì)量好，適于PCR分析；與現(xiàn)有的棉花葉片DNA提取的CTAB法方法相比，簡化了步驟，節(jié)省了取樣時間和DNA提取時間，時間縮短了80-90%左右，成本降低90%左右。本方法可適用于分子標記輔助育種過程中大量、快速、低成本DNA樣品的提取。
【專利說明】-種棉花葉片DNA提取方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種高通量、快速、低成本提取棉花葉片DNA 的方法。

【背景技術】
[0002] 近年來，隨著作物數(shù)量性狀基因位點定位研究的深入開展，分子標記技術越來越 廣泛地被科研和育種單位應用于作物標記輔助育種。在作物標記輔助育種程序中，高通量、 快速、低成本提取作物單株的DNA -直是科研和育種者的理想目標。在棉花分子標記輔助 選擇工作中，一般是從棉株葉片中提取DNA樣品。與其他植物的DNA提出不同的是，棉花葉 片中除富含蛋白外，還含有棉酚、多糖、單寧等次生代謝物，這些代謝物在細胞破裂時容易 氧化，氧化后與蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生不可逆反應，形成棕色膠狀復合物，影響后續(xù)的實驗工 作。因此棉花葉片DNA提取的步驟較其他作物更為復雜。目前棉花葉片DNA提取方法是 CTAB法。這種方法包括田間取樣、組織破碎、提取緩沖液預處理、裂解緩沖液裂解細胞、去除 蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等環(huán)節(jié)。CTAB法提取棉花DNA的程序較為 復雜，過程繁瑣耗時，從田間取樣到提取出DNA，需要3-5小時。一個熟練工每天8小時只能 處理50-80個樣品，并且消耗較多的試劑和耗材。勞動成本按120?150元/天計算的話， 提取每個DNA樣品的勞動成本達1. 5?3. 0元。但CTAB法通過復雜的程序保證了所提取 的棉花DNA的質(zhì)量可以長期保存，并能用于多種分子生物學的實驗分析。對于棉花分子標 記輔助育種來說，主要使用SSR標記和其他普通PCR標記，需要高通量、快速、低成本地從大 量的個體葉片中提取DNA樣品。
[0003] 為了適應標記輔助選擇快速提取大量個體DNA的需要，近來在其他作物上出現(xiàn)了 各種DNA快速提取方法。其中具有代表性的為TPS法（穆春華，玉米葉片基因組快速提取方 法研究。玉米科學，2010,18⑶：170 - 172):葉片剪成Icm2大小于滅菌的1.5mL離心管中 并加入適量液氮，用組織研磨棒磨成粉狀，加入90(^1^1?5緩沖液（100111111 〇1/11^8-!1(：1， pH 值 8.0 ;10mmol/LEDTA，pH 值 8.0 ;lmol/L KC1)，75°C水浴 30min，每隔 IOmin 輕輕混勻 1 次，室溫ll〇〇〇r/min離心IOmin,取上清液約500μ L加入預冷的（等體積）無水乙醇，4°C 放置20min，待DNA析出，室溫11000r/min離心IOmin,棄上清液，倒置流盡殘余液體，加入 120 μ L滅菌蒸餾水，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｔ摲椒ㄅcCTAB法相比，簡化了操作步驟，提高了速 度。但仍用液氮研磨、乙醇沉淀并采用1.5mL離心管盛裝，難以大批量進行。且只適用于含 酚類、單寧等物質(zhì)較少的物種，適合棉花葉片DNA快速提取的方法目前還未見報道。
[0004] TPS法在棉花種子DNA提取上已有應用（郎需勇，棉花學報，2014, 26(1) :87-94)。 具體DNA提取步驟為：使用前配制DNA提取緩沖液（100mmol/LTris-Base，pH8. 0 ;10mmol/ L Na2-EDTA, pH 8· 0 ;lmol/L KC1)。①取棉花干種子胚于200 μ L96孔PCR板中；②向棉花 干種子胚中（每孔）加入50 μ L DNA提取緩沖液，用PCR板硅膠蓋封好，再將混合體系置于 PCR擴增儀上94°C 15?20min ;③室溫3000r/min離心2min，用12道移液器將上清液吸出 去掉，重復步驟②一遍；④向棉花干種子胚中（每孔）加入150 μ L ddH20稀釋備用。該方 法將TPS用于棉花種子DNA的提取，對最終DNA質(zhì)量難以控制，PCR擴增時對模板DNA的量 要求極嚴格（模板量只能在1. 0-1. 5μ L之間，超出此范圍就擴增效果差），存在穩(wěn)定性不 佳的問題。而且種子一經(jīng)破壞，就不能用于繁殖，因此在標記輔助選擇工作中不能使用。我 們將此TPS法用于棉花子葉期對子葉進行取樣時，只有部分引物能擴增出部分條帶，且效 果不穩(wěn)定。用于成株期葉片DNA提取時，DNA質(zhì)量較差（見表I-TPS法），不符合PCR要求， PCR擴增無條帶。
[0005] 另一種改良的TPS法被應用到花生葉片DNA快速提取（王蕾，山東農(nóng)業(yè)科學2014， 46 (7) : 11?14)，其步驟如下：①取新鮮幼葉約0. 05g，剪為0. 1?0. 8cm的碎片，放入I. 5mL 的EP管中，研磨棒研磨。②加入600 μ L TPS緩沖液，漩渦混勻5s，95°C水浴10min(TPS緩 沖液包含 100mm〇l/L Tris-HCl，lmol/L KCl, 10mmol/L EDTA)。③ 12000r/min 離心 10min， 取上清液加入等體積預冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，置_20°C冰箱中10min，待析出沉淀， 12000r/min離心2min，棄去上清液，將DNA沉淀風干，加入200 μ L TE溶解DNA。4°C保存 或-20°C長期保存。但仍用乙醇沉淀并采用1.5mL離心管盛裝，難以大批量進行。我們將 次改良的TPS法用于棉花子葉期對子葉進行取樣時，只有部分引物能擴增出條帶，表現(xiàn)出 對引物具有較強的選擇性。用于成株期葉片DNA提取時，DNA質(zhì)量較差（見表I-TPS法研 磨），大多數(shù)出現(xiàn)褐色沉淀，不符合PCR要求，PCR擴增無條帶。原因是棉花葉片中酚類物質(zhì) 的含量遠高于花生葉片。即使是幼嫩的棉花葉片，甚至是子葉，也含有較高的酚類物質(zhì)，影 響了 DNA的提取質(zhì)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于解決傳統(tǒng)方法中棉花葉片DNA提取過程繁瑣、耗時較長、試劑 耗材成本較高以及目前各種TPS方法在棉花葉片DNA提取上效果不佳等問題，提供了一種 棉花葉片DNA提取方法，該方法快速，簡單，成本低，可大批量提取不同時期棉花葉片DNA。
[0007] -種棉花葉片DNA提取方法，包括以下步驟：
[0008] 本發(fā)明提供一種棉花葉片DNA提取的方法，包括在棉花葉片中加入預處理緩沖 液，研磨后，離心棄上清，加入TPS提取緩沖液90-97攝氏度水浴或金屬浴，離心，即得到含 有葉片DNA的上清液。
[0009] 所述的葉片為棉花出苗之后到打頂之前任何時期的葉片；
[0010] 所述的預處理緩沖液的配方為：5%葡萄糖，0. 05M Tris-HCL，0. 005M EDTA，2% PVP40,2% β-巰基乙醇。
[0011] 所述的 TPS 提取緩沖液配方為：0· IM Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2% PVP30。
[0012] 進一步的，若樣品為子葉，可直接在樣品中加入TPS提取緩沖液，研磨后，90-97攝 氏度水浴或金屬浴，取上清即可。
[0013] 以上所述的方案中，優(yōu)選的，在采樣時，用96孔PCR板取棉花子葉或成株倒2-3葉 1/4?1/2平方厘米的葉片，用硅膠密封軟墊蓋好，置于冰盒中。
[0014] 以上所述的方案中，優(yōu)選的，預處理時，在每個樣品孔中加入60-80 μ 1預處理緩 沖液。用帶有改裝鉆頭的微型手電鉆（市售）研磨葉片至充分破碎。將裝有研磨后葉片樣 品的PCR板在室溫下以3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心2-5分鐘。
[0015] 所述的改裝鉆頭的改裝方法為：200 μ 1的黃色移液槍頭尖端用酒精燈加熱熔成 直徑2-3_的圓球狀，然后套在微型手電鉆2-3_直徑的鉆頭上即可。
[0016] 以上所述的方案中，優(yōu)選的，棉花葉片中加入預處理緩沖液，研磨，PCR板離心后， 取出PCR板，用多層吸水紙覆蓋PCR板，倒掉上清液。向PCR板的樣品孔中加入60-80 μ 1 TPS提取緩沖液，蓋上密封軟墊，90-97攝氏度水浴鍋中水浴或PCR儀上金屬浴15?20分 鐘。取出PCR板，在室溫下以3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速再次離心2-5分鐘，得到含有葉片DNA 的上清液。
[0017] 一種棉花葉片DNA提取方法獲得的DNA在棉花分子標記輔助選擇中的應用，應用 過程如下：
[0018] 1.取提取的DNA上清液20-30 μ 1，用滅菌的TE緩沖液稀釋5-10倍，得到 100-300 μ I DNA工作液，蓋上密封軟墊，置于4°C備用。
[0019] 2.將目標DNA用12道微量移液器轉(zhuǎn)到滅菌的干凈PCR板中。選取輔助選擇用的 標記引物，以樣品DNA為底物進行PCR擴增。
[0020] 3.對擴增后的樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0021] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0022] 利用一體化的96孔PCR板代替單個離心管，并簡化操作步驟，適用于大批量的DNA 提取；
[0023] 本發(fā)明DNA提取材料選用棉花出苗之后到打頂之前任何時期的葉片。使用96孔 PCR板盛放葉片樣品，不需要單獨用小管存放每個樣品，大大節(jié)省了取樣時標記取樣管的時 間。用微型手電鉆直接在PCR板孔中對葉片樣品進行研磨，研磨過程中不需要轉(zhuǎn)移樣品，簡 化了程序。而且因樣品組織量少，微型手電鉆方便操作，每個樣品只需3-5秒即可研磨完 畢。比液氮研磨或其他研磨方式節(jié)省了大量時間。葉片研磨過程中，用預處理液對樣品進 行處理，保證DNA樣品的質(zhì)量。用提取液進行加熱處理后，直接得到DNA樣品，不需要異丙 醇沉淀DNA、苯酚+氯仿+異戊醇除去蛋白質(zhì)、乙醇洗滌、風干溶解等步驟。本發(fā)明方法提取 棉花葉片DNA，操作步驟簡單，所用時間短。從CTAB法的9-15個步驟簡化為3-4個步驟；每 個樣品的提取時間從CTAB法的3-5個小時縮短到25-30分鐘；從CTAB法的每人每天8小 時提取50-80個DNA樣品提高到每人每天8小時提取600-800個DNA樣品。人工成本從原 來的1. 5-3. 0元/樣品到0. 15-0. 25元/樣品；試劑耗材成本也從原來的0. 3-0. 5元/樣 品下降為0.03-0. 05元/樣品。本方法與CTAB法相比，時間縮短了 80%-90%左右，成本 降低90 %左右。同時也克服了現(xiàn)有其他DNA快速提取的各種改良TPS法得到DNA質(zhì)量低的 不足，所得DNA樣品量可以滿足100-300次PCR反應。本發(fā)明既簡化了操作過程，又降低了 操作成本，大大提高了 DNA提取速度，可提取不同時期的棉花葉片DNA，能滿足分子標記輔 助育種過程中大量、快速、低成本提取DNA樣品的需要，可促進棉花分子標記輔助育種和相 關研究。
[0024] 通過用含有葡萄糖、PVP和β -巰基乙醇的緩沖液對成株葉片進行預處理，以及在 原TPS提取液中添加 PVP30,對兩種緩沖液的成分進行一些調(diào)整之后，提高了提取DNA的質(zhì) 量，保證了該方法在棉花葉片DNA提取上效果的穩(wěn)定性。該方法直接得到DNA溶液，省去了 蛋白抽提、DNA沉淀、洗滌、風干、溶解等一系列步驟，提供一種高通量、快速、低成本地提取 棉花葉片DNA的方法，可滿足棉花分子標記輔助育種工作中大量樣本DNA高通量、快速、低 成本提取的需要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為利用SSR引物BNL3535,組合DES-HAF16X魯棉研28的F2群體單株成株期 葉片預處理后提取DNA進行PCR擴增檢測結果。
[0026] 圖2為利用SSR引物BNL3535擴增魯棉研28單株檢測結果。
[0027] 1-12泳道：子葉預處理后提取DNA ;13-24泳道：成株期葉片預處理后提取DNA ; 25-36泳道：子葉未預處理提取DNA。
[0028] 圖3為利用CrylAc基因引物擴增魯棉研28單株檢測結果。
[0029] 1-12泳道：子葉預處理后提取DNA ;13_24泳道：成株期葉片預處理后提取DNA ; 25-36泳道：子葉未預處理提取DNA。

【具體實施方式】
[0030] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。若未特別 指明，實施例中所用的生化試劑均為市售。
[0031] 以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花品種魯棉研28、哈克尼西棉胞質(zhì)雄性不育系的恢復系 DES-HAF16及組合DES-HAF16 X魯棉研28的F2群體單株為實驗材料，通過具體實例對本發(fā) 明做進一步的描述。具體實例統(tǒng)一采用1〇μ1 PCR擴增體系。取Ι.ΟμΙ PCR擴增后產(chǎn)物， 用濃度為9 %的非變性PAGE (聚丙烯酰胺凝膠）電泳檢測。具體組分及程序如下：
[0032] PCR 擴增反應體系：10XPCR Buffer 1·0μ 1 (含Mg2+)，10mM dNTP Mix 0·2μ 1， SSR正、反向引物（5 μ mol/L)各1.0 μ 1，5U申能博彩DNA聚合酶0. I μ 1，待測樣品DNA I. 0 μ 1 (含 50-200ng DNA)，滅菌去離子水 5. 7 μ 1。
[0033] PCR反應程序：95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，53或57 °C退火45s，72 °C延伸 60s，循環(huán)35次；72°C延伸5分鐘；4°C保存。
[0034] 本發(fā)明實施例用到的SSR引物或基因擴增引物序列如下：
[0035] 育性恢復基因連鎖標記BNL3535 :
[0036] 正向引物序列：CTGGGATACATACCGTGGCT
[0037] 反向引物序列：ACTTTGCTGAATAAAGGTGAGTG
[0038] Bt 基因 CrylAc 引物：
[0039] 正向引物序列：GTTCCAGCTACAGCTACCTCC
[0040] 反向引物序列：CCACTAAAGTTTCTAACACCCAC
[0041] 本發(fā)明實施例使用的微型手電鉆為帶有改裝鉆頭的微型手電鉆。
[0042] 所述的改裝鉆頭的改裝方法為：200 μ 1的黃色移液槍頭尖端用酒精燈加熱熔成 直徑2-3_的圓球狀，然后套在微型手電鉆2-3_直徑的鉆頭上即可。
[0043] 本發(fā)明方法提取的DNA用于SSR標記輔助棉花育種的效果。
[0044] 實施例1 :
[0045] 一種棉花葉片DNA提取方法，包括以下步驟：
[0046] 棉花子葉DNA提取
[0047] 將待檢測單株掛牌編號后，用96孔PCR板進行取樣。1/4-1/2平方厘米子葉，按順 序放入96孔PCR板中，取完后用硅膠密封軟墊蓋嚴，置于冰盒中存放。
[0048] 向PCR板孔中加入70 μ ITPS提取緩沖液，用微型手電鉆研磨子葉至充分破碎，蓋 上硅膠密封軟墊，95 °C水浴20分鐘，然后以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心盛有樣品的PCR板2 分鐘。取20 μ 1上清液，加入180 μ 1滅菌TE緩沖液，用槍頭上下吸打使DNA溶液混勻，即 得到可以直接使用的DNA樣品。
[0049] 所述的 TPS 提取緩沖液配方為：0· IM Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2% PVP30。將提取的DNA用于棉花分子標記輔助選擇，具體如下：
[0050] PCR 擴增
[0051] 選用SSR引物BNL3535,取Ι.Ομ 1上述DNA樣品進行PCR擴增（PCR反應程序： 95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸60s，循環(huán)35次；72°C延伸5分 鐘；4°C保存），用9%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0052] 選用抗蟲基因 CrylAc引物，取Ι.Ομ 1上述DNA樣品進行PCR擴增（PCR反應程序： 95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸60s，循環(huán)35次；72°C延伸5分 鐘；4°C保存），用9%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0053] (3)結果檢測
[0054] 通過微量分光光度計（NAN0100)檢測，DNA在260nm和280nm處的吸收值比例為 1. 72,濃度為285. 4ng/uL。由圖2、3可知，子葉簡化方法提取DNA的PCR擴增產(chǎn)物樣品的目 標帶清晰（圖3)。
[0055] 實施例2 :
[0056] -種棉花葉片DNA提取方法，包括以下步驟：
[0057] (1)子葉預處理后DNA提取
[0058] 將待檢測單株掛牌編號后，用96孔PCR板進行取樣。取1/4-1/2平方厘米的子葉， 按順序放入96孔PCR板中，取完后用硅膠密封軟墊蓋嚴，置于冰盒中存放。
[0059] 向PCR板孔中加入70 μ 1預處理緩沖液，用微型手電鉆研磨子葉至充分破碎。蓋 上硅膠密封軟墊，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心盛有樣品的PCR板2分鐘。取出PCR板，揭 掉密封軟墊，用多層吸水紙覆蓋PCR板，倒置PCR板，讓吸水紙吸收上清液。向PCR板孔中 加入70 μ ITPS提取緩沖液，蓋上硅膠密封軟墊，95°C水浴或金屬浴20分鐘，然后以3000轉(zhuǎn) /分鐘的速度離心盛有樣品的PCR板2分鐘。取20 μ 1上清液，加入180 μ 1滅菌TE，上下 吸打使DNA溶液混勻，即得到可以直接使用的DNA樣品。
[0060] 所述的預處理緩沖液的配方為：5%葡萄糖，0. 05Μ Tris-HCL，0. 005Μ EDTA，2% PVP40,2% β-巰基乙醇。
[0061] 所述的 TPS 提取緩沖液配方為：0· IM Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2% PVP30。
[0062] (2) PCR 擴增
[0063] 選用SSR引物BNL3535,取Ι.Ομ 1上述DNA樣品進行PCR擴增（PCR反應程序： 95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸60s，循環(huán)35次；72°C延伸5分 鐘；4°C保存），用9%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0064] 選用抗蟲基因 CrylAc引物，取Ι.Ομ 1上述DNA樣品進行PCR擴增（PCR反應程序： 95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸45s，循環(huán)35次；72 °C延伸5分 鐘；4°C保存），用9%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0065] (3)結果檢測
[0066] 通過微量分光光度計（NAN0100)檢測，DNA在260nm和280nm處的吸收值比例為 1. 87,濃度為253. 3ng/uL。圖2、圖3可知，子葉預處理后提取DNA的PCR擴增產(chǎn)物目標條 帶清晰。
[0067] 實施例3 :
[0068] 一種棉花葉片DNA提取方法，包括以下步驟：
[0069] (1)成株期葉片預處理后DNA提取
[0070] 將田間待檢測單株掛牌編號后，用96孔PCR板進行田間取樣。取打頂前的棉花植 株倒2-倒3葉1/4平方厘米的葉片，按順序放入96孔PCR板中，取完后用硅膠密封軟墊蓋 嚴，置于冰盒中存放。
[0071] 向PCR板孔中加入70 μ 1預處理緩沖液，用微型手電鉆研磨葉片至充分破碎，蓋上 硅膠密封軟墊，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心盛有樣品的PCR板2分鐘。取出PCR板，揭掉 密封軟墊，用多層吸水紙覆蓋PCR板，倒置PCR板，讓吸水紙吸收上清液。向PCR板孔中加 入70 μ 1提TPS提取緩沖液，蓋上硅膠密封軟墊，95°C水浴或金屬浴20分鐘，然后以3000 轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心盛有樣品的PCR板2分鐘。取20 μ 1上清液，加入180 μ 1滅菌TE，上 下吸打使DNA溶液混勻，即得到可以直接使用的DNA樣品。
[0072] 所述的預處理緩沖液的配方為：5%葡萄糖，0. 05Μ Tris-HCL，0. 005Μ EDTA，2% PVP40,2% β-巰基乙醇。
[0073] 所述的 TPS 提取緩沖液配方為：0· IM Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2% PVP30。
[0074] (2) PCR 擴增
[0075] 選用SSR引物BNL3535,取Ι.Ομ 1上述DNA樣品進行PCR擴增（PCR反應程序： 95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸60s，循環(huán)35次；72°C延伸5分 鐘；4°C保存），用9%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0076] 選用抗蟲基因 CrylAc引物，取Ι.Ομ 1上述DNA樣品進行PCR擴增（PCR反應程序： 95°C預變性5分鐘；94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸45s，循環(huán)35次；72 °C延伸5分 鐘；4°C保存），用9%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0077] (3)結果檢測
[0078] 通過微量分光光度計（NAN0100)檢測，DNA在260nm和280nm處的吸收值比例為 1. 92,濃度為201. 2ng/uL。由圖1、圖2、圖3可知，成株葉片預處理后提取的DNA樣品經(jīng)PCR 擴增后，目標帶清晰。
[0079] 實施例4 :
[0080] 本發(fā)明方法與常規(guī)提取方法比較
[0081] 將以上郎需勇提出了 TPS法、王蕾提出的改良TPS法、本發(fā)明方法以及目前廣為使 用的CTAB法用于棉花葉片DNA提取，具體程序同前面所述。將4種方法提取的DNA進行質(zhì) 量、濃度、耗時和成本等進行了比較，結果見表1。從表1中可以看出，用TPS法（郎需勇， 棉花學報，2014, 26(1) :87-94)和改良TPS法（王蕾，山東農(nóng)業(yè)科學2014,46(7) : 11?14) 提取棉花葉片DNA的260/280吸收值在1. 4-1. 6之間，蛋白質(zhì)含量較高，不適合后續(xù)PCR分 析。本方法提取的DNA樣品的260/280吸收值在I. 8-2. O之間，與CTAB法提取的樣品吸收 值接近，樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)較少，符合PCR擴增要求。TPS法因缺少研磨環(huán)節(jié)，DNA濃度較 低。改良TPS法和本發(fā)明方法因為組織充分破碎，樣品DNA含量較高。CTAB法因為有風干 再溶解環(huán)節(jié)，DNA含量最高。從樣品提取所用時間來看，本發(fā)明與TPS法相同，遠低于改良 TPS法和CTAB法。試劑耗材成本的比較結果與所用時間的比較結果相同。
[0082] 表1.不同方法提取的DNA樣品質(zhì)量與濃度的比較
[0083]

【權利要求】
1. 一種棉花葉片DNA提取的方法，包括在棉花葉片中加入預處理緩沖液，研磨后，離心 棄上清，加入TPS提取緩沖液90-97攝氏度水浴或金屬浴，離心，即得到含有葉片DNA的上 清液； 所述的葉片為棉花出苗之后到打頂之前任何時期的葉片； 所述的預處理緩沖液的配方為：5%葡萄糖，0. 05 M Tris-HCL，0. 005 M EDTA，2% PVP40,2% 巰基乙醇； 所述的TPS提取緩沖液配方為：0. 1 M Tris-HCL，0. 01 M EDTA，1.2M/L KCL，2% PVP30。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：樣品為子葉時，直接在樣品中加入TPS提 取緩沖液，研磨后，90-97攝氏度水浴或金屬浴，取上清即可。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：在采樣時，用96孔PCR板取棉花子葉或 成株倒2-3葉1/4?1/2平方厘米的葉片，用硅膠密封軟墊蓋好，置于冰盒中。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：預處理時，在每個樣品孔中加入60-80 yl 預處理緩沖液，用帶有改裝鉆頭的微型手電鉆研磨葉片至充分破碎，將裝有研磨后葉片樣 品的PCR板在室溫下以3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心2-5分鐘； 所述的改裝鉆頭的改裝方法為：200yl的黃色移液槍頭尖端用酒精燈加熱熔成直徑 2-3_的圓球狀，然后套在微型手電鉆2-3_直徑的鉆頭上即可。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：樣品中加入預處理緩沖液，研磨，PCR板 離心后，取出PCR板，用多層吸水紙覆蓋PCR板，倒掉上清液；向PCR板的樣品孔中加入 60-80 yl TPS提取緩沖液，蓋上密封軟墊，90-97攝氏度水浴鍋中水浴或PCR儀上金屬浴 15?20分鐘；取出PCR板，在室溫下以3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速再次離心2-5分鐘，得到含有 葉片DNA的上清液。
【文檔編號】C12N15/10GK104371999SQ201410794949
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權日:2014年12月18日
【發(fā)明者】秦鴻德, 易先達, 張 成, 王小嬌, 焦春海, 陳敏 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所