本發明涉及方格星蟲抗氧化提取物的制備方法和用途，屬于海洋活性物質提取技術領域。
背景技術：
方格星蟲是海洋漁業資源中具有重要經濟價值的生物資源。目前，國外主要對方格星蟲進行代謝生理、生態特征等的研究，對方格星蟲藥用價值的研究較少。國內主要對其進行繁殖生物學及食用功效的研究，對其藥用價值的研究主要以粗提物、多糖及多肽的研究為主，藥理活性主要集中在抗疲勞、抗氧化、提高免疫力、抗輻射、延緩衰老、抗病毒活性、護肝作用、提高記憶力等方面。在方格星蟲中含有清除自由基的抗氧化成份，自由基是一類能與生物膜脂質、蛋白質、酶、DNA等生物大分子相互作用，并引起機體氧化損傷的物質，機體過量的自由基與衰老、腫瘤、心血管疾病、免疫功能低下等很多退行性疾病的發生關系密切，因此，尋找天然、無毒、高效的抗氧化活性成分，對維持健康、延緩衰老具有重要作用，現已成為多個學科領域的研究重點。但遺憾的是在現有技術中，未有針對方格星蟲水層中的抗氧化成份的提取方法披露，也沒有方格星蟲水層中抗氧化成份的應用報道，本發明的意義就在于尋找一種方格星蟲抗氧化水層的提取方法及提取物的應用。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供方格星蟲抗氧化提取物的制備方法，本發明的另一目的在于提供方格星蟲抗氧化提取物的用途，克服目前對方格星蟲抗氧化成份研究中所存在的不足。
為實現上述目的，本發明采取了下述技術方案：方格星蟲抗氧化提取物的制備方法，主要技術步驟是：
(1)方格星蟲初加工：取鮮活成熟方格星蟲個體，翻轉其體壁后，于烘箱中60-80℃烘干至含水量15-20％，粉碎為粒徑是0.3-0.5厘米的粗粒，按照1:2-1:4的重量比加入90％-99％的乙醇浸泡，備用；另取加工廢棄的鮮方格星蟲體腔液，按照1:1-1:4的重量比，加入90％-99％乙醇浸泡，并混合均勻備用。
(2)從方格星蟲中提取醇溶性提取物：室溫條件下，采用40KHz超聲提取的方法，對方格星蟲粗粒和體腔液浸泡提取，每次0.5-1h，共提取3-6次；收集合并方格星蟲乙醇提取液，用極速濾紙過濾2-4次，然后用旋轉蒸發儀和蒸發工作站減壓濃縮，將濾液在45-55℃、100–300hPa大氣壓下，減壓濃縮至40℃熱測時相對密度是1.2-1.3，得到方格星蟲乙醇浸膏。
(3)制備方格星蟲水相萃取物：以1：6.8-7.2的重量比，于方格星蟲乙醇浸膏中加入蒸餾水并充分混懸，然后用等體積的乙酸乙酯萃取，常溫萃取3-6次，得到乙酸乙酯和水相萃取液；水相萃取液經旋轉蒸發儀和蒸發工作站減壓濃縮，45-55℃、100–300hPa大氣壓減壓濃縮至40℃熱測時相對密度是1.2-1.3，得到方格星蟲抗氧化提取物。
(4)抗氧化活性檢測：通過模擬化學體系產生自由基，取所述方格星蟲抗氧化提取物利用各種方法檢測對自由基的清除率，結果是除了還原力略弱于VC，清除DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的效果是VC的兩倍，清除·OH的作用是VC的三倍，其抗氧化活性顯著。
采取上述措施的本發明，具有以下突出優點和效果：(1)本發明應用方格星蟲體壁的同時，采用方格星蟲加工產業的副產品——方格星蟲體腔液為原料制備抗氧化的活性物質，變廢為寶，是一種綠色產業：且工藝較為簡單，無需較大設備投資，非常適合于大規模產業化生產，為下一步開發出系列方格星蟲功能性食品打下基礎；(2)本發明所制備的方格星蟲抗氧化提取物，經各種自由基清除作用檢測，抗氧化作用如下表所示：
表1 方格星蟲抗氧化提取物的抗氧化作用
提示本發明的方格星蟲抗化提取物具有較強的抗氧化作用，能用于清除人體自由基，能作為制備抗氧化藥品或食品的應用。
具體實施方式
本發明通過以下實施例進一步詳述，但本實施例所敘述的技術內容是說明性的，而不是限定性的，不應該以此來局限本發明的保護范圍。
實施例1
方格星蟲抗氧化提取物制備：
(1)方格星蟲初加工
取鮮活方格星蟲S.nudus 29斤，洗凈，翻轉其體壁后，將體壁于烘箱中70℃烘干得到含水量為20％的干燥方格星蟲，粉碎為粒徑0.5厘米的粗粒，加入3公斤95％乙醇浸泡，備用；另收集方格星蟲體腔液2公斤，加入3公斤95％乙醇浸泡，并混合均勻備用；
(2)方格星蟲乙醇浸膏的制備
室溫條件下，采用40KHz超聲提取的方法，對方格星蟲粗粒和體腔液進行提取，每次0.5-1h，共提取3-6次；取方格星蟲乙醇提取液用極速濾紙過濾兩次，然后用旋轉蒸發儀和蒸發工作站減壓濃縮濾液，將濾液在45-55℃、100–300hPa大氣壓下，減壓濃縮至40℃熱測時相對密度是1.2-1.3，得到方格星蟲乙醇浸膏；
(3)方格星蟲抗氧化提取物的制備
取方格星蟲乙醇浸膏323.4g，用500毫升水分散后，用600毫升乙酸乙酯萃取，常溫震蕩萃取4次；在45-55℃、100–300hPa大氣壓下，萃取液經旋轉蒸發儀和蒸發工作站減壓濃縮，至40℃熱測時相對密度是1.2-1.3，得到方格星蟲抗氧化提取物(234.9g)。
實施例2
(1)方格星蟲抗氧化提取物還原力檢測：
取不同濃度的樣品0.5mL，分別加入1.25mL PBS(0.2mol/L，PH＝6.6)和K3Fe(CN)6(1％，g/mL)，混勻，于50℃反應20min后快速冷卻，加入1.25mL 10％的三氯乙酸，混勻，于3000r/min離心10min，取上清液5.0mL，加蒸餾水4.0mL，及FeCl3(0.1％，m/v)溶液1mL，混勻，10min后于1cm比色皿中700nm處測定吸光度。以VC為陽性對照，每個測定對象平行測定3次，取平均值。
(2)方格星蟲水層對DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的清除作用：
取不同濃度的樣品2mL，加入2mL DPPH乙醇溶液(0.14mmol/L)，混勻后在室溫下避光反應20min，于517nm處測定吸光度A1；以無水乙醇代替樣品為空白體系，其吸光度為A0；以無水乙醇代替DPPH自由基作為對照體系，其吸光度為A2。同時以VC為對照，按以下公式計算清除率
(3)方格星蟲水層對·OH的清除作用
向25mL容量瓶中依次加入7.5mmol/mL鄰二氮菲溶液1.0mL，PBS(pH7.4)5.0mL，7.5mmol/mL FeSO4溶液1.0mL，一定量的抗氧化劑溶液(損傷管及未損傷不加提取液)，體積分數為0.1％H2O2 1.0mL(未損傷管不加)，以蒸餾水定容，暗處放置60min，在536nm處測吸光度。以上每加一次試劑均需混勻。同時以VC為對照。羥自由基清除率計算按下列公式