本發明屬于食品加工技術領域，特別涉及一種基于葡聚糖與大豆蛋白耦聯的糖接枝蛋白的制備方法。
背景技術：
糖接枝蛋白是基于maillard反應機理的一種綠色高效的蛋白改性方法，該方法不需外加化學試劑，僅加熱即可自發形成糖-蛋白復合物，安全性高、快速、穩定，在食品工業中應用廣泛。蛋白質多肽鏈中糖鏈的引入，使蛋白質的功能性質，如溶解性、熱穩定性、乳化性、起泡性、凝膠性等得到顯著改善，甚至增加某些蛋白質的抗氧化性、抑菌性和降低免疫原性，可作為天然防腐劑。糖接枝蛋白為具有球狀形貌的兩親性接枝共聚物，較強兩親性使其能夠在水中自組裝為膠束，該膠束可包埋β-胡蘿卜素、姜黃素、布洛芬等疏水性物質，且負載效率高，可作為靶向藥物載體或營養遞送載體，或作為天然表面活性劑應用于乳液體系。糖接枝蛋白技術為研究和開發新型食品添加劑提供了一條新的途徑，目前該研究在國內外食品功能性添加劑、醫藥等領域有良好的發展前景。
cn105669825a公開了“一種基于可溶性大豆多糖的糖基化及其制備方法”。將蛋白和大豆多糖分別溶解混合后凍干為粉末，在溫度為60℃、濕度為79％的干燥器中反應7-14天，將反應物復溶離心后取上清干燥得到糖基化蛋白。此法反應時間很長，所得物質褐變程度大、副產物多，不能完全保證得到maillard反應初期產物；反應條件要求濕度為79％、需凍干兩次等條件苛刻，工業化大規模生產難以實現，因此限制了此方法的實際應用。
cn101429226a公開了“一種蛋白質-多糖接枝耦聯技術改善大米蛋白功能性質的方法”。將大米蛋白在ph為12條件下溶解后與糖基混合，在ph為11、90℃條件下反應20min，將混合液冷凍干燥得到產物。此法條件為高溫強堿，條件極端，所得產品副產物多，褐變程度大，不能完全保證得到maillard反應初期產物；工業化生產中污水處理成本高，因此限制了此方法的實際應用。
葡聚糖(dextran)是由蔗糖經腸膜狀明串珠菌發酵后形成的高分子葡聚糖聚合物，具有綠色、安全的特點。其分子主鏈由α(1→6)糖苷鍵連接的葡萄糖單位聚合而成，形成簡單的直鏈結構，其中每個葡聚糖分子都含一個還原末端，可發生接枝耦聯反應。作為中性多糖的葡聚糖具有優良的水溶性、穩定性，具有在體內不被胃液消化而可被腸道內葡聚糖酶降解的特點，是一種潛在的優良人體結腸靶向藥物載體。其也具有良好的生理功能：清除游離自由基、抗輻射、溶解膽固醇、預防高脂血癥及調整體內消化道的微生態，促進有益菌增值等。葡聚糖是一種良好的蛋白質糖基化修飾反應物，能夠明顯改善蛋白的各種功能特性，是具有特殊功能性質的蛋白配料。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種反應時間短，接枝度高，安全、穩定，可有效降低產品褐變度的一種基于葡聚糖與大豆蛋白耦聯的糖接枝蛋白的制備方法，可用于蛋白改性或對功能性營養因子/藥物進行包埋，用于營養/藥物遞送體系。
本發明的技術解決方案是：
一種基于葡聚糖與大豆蛋白耦聯的糖接枝蛋白的制備方法，其具體步驟如下：
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
將葡聚糖和大豆蛋白按照質量比1∶1～1.5∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質量體積比為14.0mg/ml～21.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質量體積比為14.0mg/ml，所述混合液調節ph至6.8～7.2，勻速攪拌1～2h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液低溫溫浴
將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調節溫度為50～60℃，溫浴50～60min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續接枝反應
將經恒溫水浴搖床預反應的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應，溫度為80～85℃，反應時間為10～15min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續溫浴，溫度為50～60℃，時間30～40min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環反應，經過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應1次，共計反應6～8次后結束，然后將反應物冰浴3～5min；
(4)接枝物的提取與提純
將(3)制備的反應產物調節ph值至4.0～5.0，在0～4℃下以8000～10000g離心力離心15～20min；取上清液后進行超濾離心，轉速為2000～2500rpm，時間為10～15min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
進一步的，步驟(1)所述葡聚糖的分子量為40～50kda。
進一步的，步驟(1)所述大豆蛋白的蛋白純度≥95％。
進一步的，步驟(1)和步驟(4)調ph值采用濃度為0.1mol/l的hcl溶液或濃度為0.1mol/l的naoh溶液。
進一步的，步驟(1)勻速攪拌時，攪拌速度為100～150r/min，低速攪拌能夠使多糖和蛋白分子進行重排而不發生變性，未反應分子間能夠更充分地相互結合參與下一步反應。
進一步的，步驟(2)和步驟(3)的恒溫水浴搖床的轉速為100～150r/min，搖床轉動攪拌能夠降低蛋白的變性熱聚集效應，使蛋白重新分散增大接枝度。
進一步的，步驟(1)所述混合液調節ph至7，以提高產品溶解性。
進一步的，所述溶液均是用滅菌雙蒸水配制。
本發明的有益效果：
(1)選擇將混合溶液放入溫度為50～60℃的恒溫水浴搖床中初步溫浴，其中7s形式的球蛋白開始變性溫度在60～70℃，β-伴大豆球蛋白在60～75℃開始變性，因此在低于其變性范圍進行溫浴既提高溫度，又使蛋白在未變性范圍慢慢溫浴以備進一步反應。采用分級連續反應的方式使大豆蛋白與多糖進行反應，反應條件溫和，反應效率高，短時間內即可得到高接枝度產物；接枝物為美拉德反應初級產物，安全穩定，沒有褐變。
(2)葡聚糖具有良好的溶解分散穩定性，使產物具有很好的溶解性，有效提高蛋白在等電點的溶解能力，同時得到功能性優越的糖基化蛋白，有效提高蛋白的溶解性、乳化性、熱穩定性、起泡性等各種性能。所得糖接枝蛋白為兩親性接枝共聚物，可以用于蛋白改性或對功能性營養因子/藥物進行包埋，用于營養/藥物遞送體系，具有良好的市場前景。
具體實施方式
實施例1
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
將0.7g葡聚糖和0.7g大豆蛋白加入50ml水配制混合液，用0.1mhcl/naoh調節使ph為7.0，用磁力攪拌器以100r/min勻速攪拌1h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量為40kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液預反應
將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調節溫度為50℃、轉速為100r/min，溫浴50min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續接枝反應
將經恒溫水浴搖床預反應的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應，溫度為80℃，反應時間為15min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續溫浴，溫度為50℃、轉速為100r/min，時間30min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環反應，經過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應1次，共計反應8次后結束，然后將反應物冰浴5min。
(4)接枝物的提取與提純
將(2)制備的反應產物所述混合液以0.1mhcl調節使ph值為4.0，在4℃下以8000g離心力離心15min；取上清液后進行超濾離心，轉速為2000rpm，時間為10min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
實施例2
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
將葡聚糖和大豆蛋白按照質量比1.25∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質量體積比為17.5mg/ml，所述大豆蛋白與水的質量體積比為14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調節使ph為7.0，用磁力攪拌器以125r/min勻速攪拌1.5h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量為50kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液預反應
將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調節溫度為55℃、轉速為125r/min，溫浴55min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續接枝反應
將經恒溫水浴搖床預反應的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應，溫度為83℃，反應時間為13min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續溫浴，溫度為55℃、轉速為125r/min，時間35min；再次于恒溫水浴鍋中進行接枝反應，溫度83℃，反應時間為13min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環反應，經過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應1次，共計反應7次后結束，然后將反應物冰浴5min。
(4)接枝物的提取與提純
將(2)制備的反應產物所述混合液以0.1mhcl調節使ph值為4.5，在4℃下以9000g離心力離心18min；取上清液后進行超濾離心，轉速為2300rpm，時間為13min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
實施例3
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
將葡聚糖和大豆蛋白按照質量比1.5∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質量體積比為21.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質量體積比為14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調節使ph為7.0，用磁力攪拌器以150r/min勻速攪拌2h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量為50kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液預反應
將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調節溫度為50℃、轉速為150r/min，溫浴60min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續接枝反應
將經恒溫水浴搖床預反應的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應，溫度為85℃，反應時間為10min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續溫浴，溫度為50℃、轉速為150r/min，時間40min；再次于恒溫水浴鍋中進行接枝反應，溫度85℃，反應時間為10min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環反應，經過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應1次，共計反應6次后結束，然后將反應物冰浴3min。
(4)接枝物的提取與提純
將(2)制備的反應產物所述混合液以0.1mhcl調節使ph值為5.0，在4℃下以10000g離心力離心20min；取上清液后進行超濾離心，轉速為2000rpm，時間為15min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
對比例1
將0.7g葡聚糖和0.7g大豆蛋白加入50ml水配制混合液，葡聚糖的分子量為40kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；以0.1mhcl/naoh調節使ph為7.0，用磁力攪拌器以100r/min勻速攪拌1h；將混合液置于恒溫水浴鍋中以溫度為80℃，反應時間為380min進行接枝反應，然后放入冰浴中冷卻5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
對比例2
將葡聚糖和大豆蛋白按照質量比1.3∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質量體積比為14.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質量體積比為17.5mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調節使ph為7.0，用磁力攪拌器以125r/min勻速攪拌1.5h；將混合液置于恒溫水浴鍋中以溫度為83℃，反應時間為365min進行接枝反應，然后放入冰浴中冷卻5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
對比例3
將葡聚糖和大豆蛋白按照質量比1∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質量體積比為14.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質量體積比為14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調節使ph為7.0，用磁力攪拌器以100r/min勻速攪拌2h；將混合液置于恒溫水浴鍋中以溫度為85℃，反應時間為320min進行接枝反應，然后放入冰浴中冷卻5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
表1接枝度與褐變指數
由表1可看出目標產物的接枝度與褐變程度與對照相比，接枝度顯著高，褐變程度顯著低。
分別采用實施例1～實施例3的方法制備葡聚糖-大豆蛋白接枝物，只改變步驟(1)混合液的ph值，其它內容不變，測試最終產物的溶解度，結果如表1所示。
表2產物溶解度(％)隨ph的變化
由表2可知，目標產物的溶解度與對照相比，目標產物的溶解度受等電點的影響顯著減小，在ph＝7處有很好的溶解性。
表3乳化活性與乳化穩定性
由表3可得到，目標接枝物乳化活性和乳化穩定性較強。
表4熱穩定性
由表4可得到，目標接枝物的熱穩定性很好。
表5起泡能力與泡沫穩定性
由表5可得到目標接枝物的起泡能力和泡沫穩定性很好。
以上僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。