專利名稱：硫辛酸與抗壞血酸組合在治療癌癥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明一般性涉及癌癥治療方法，特別是硫辛酸作為治療藥物與抗壞血酸組合給藥。已知抗壞血酸鹽對腫瘤細胞具有選擇性毒性，但其由于劑量太高，臨床難以達到。硫辛酸及其水溶性鈉鹽能提高抗壞血酸鈉對三維體外腫瘤、小鼠腫瘤的療效。這些藥物可以對患者安全給藥，初步試驗表明其能穩定或消退病癥。
背景技術：
目前治療癌癥的最常用方法包括手術治療、放療和化療。盡管這些治療對一些癌癥有效，但離對所有癌癥都普遍有效還相差很遠。并且，常規的治療方案通常會產生副作用，如惡心、嘔吐、心臟毒性、骨髓抑制、和二次致癌。已提出維生素C(抗壞血酸，抗壞血酸鹽)作為可選擇的化學療法或者作為減少與之相關的副作用的輔助用藥。(對于本申請，提到的抗壞血酸包括陰離子成分，抗壞血酸鹽，無論其作為酸或其一種藥物可接受的鹽，最典型地包括抗壞血酸鈉和抗壞血酸鈣，它們中的任何一個包括在提到的“抗壞血酸”或“抗壞血酸鹽”中。)一些觀點認為抗壞血酸能改善免疫反應，通過加強細胞外基質防止腫瘤擴散，但這些理論還未得到最終證實。按10g/天劑量進行的抗壞血酸鹽臨床實驗對一些病例有效，但對其它一些無效。在非常高的劑量下，抗壞血酸對腫瘤細胞優先產生毒性。該優先產生的毒性被認為與抗壞血酸鹽介導的過氧化氫產生有關，其對腫瘤細胞毒性更大，因為與正常細胞相比腫瘤細胞中存在的過氧化氫酶的量通常較低。已建議高劑量靜脈給藥抗壞血酸鹽以用于治療癌癥，如美國專利5,639,787所描述。
高劑量靜脈給藥作為抗癌藥物的抗壞血酸鹽的應用關鍵是臨床能否達到足以殺死腫瘤細胞的血漿抗壞血酸鹽水平。以前在靜脈輸注后測定的抗壞血酸鹽血漿水平，表明其濃度大于殺死在體外單層培養物中生長的腫瘤細胞所需的濃度。但是殺死體外腫瘤三維生長的腫瘤細胞需要更高的抗壞血酸鹽水平。應用中空纖維“實體”腫瘤模型，觀察到有效治療腫瘤可能需要超過500mg/dL的抗壞血酸鹽濃度。目前，通過靜脈輸注通常可獲得的人體最大血漿抗壞血酸濃度大約為500mg/dL，在很短的時間內，峰水平迅速下降。盡管抗壞血酸鹽對病人而言是相對無毒性的，對更高血漿濃度的需求表明，需要安全提高抗壞血酸鹽的有效血漿水平或增加抗壞血酸鹽對癌細胞的細胞毒性效力以降低所需劑量。

發明內容
本發明的另一個目的是提供一種治療癌癥的方法，其中硫辛酸或組合治療與另外一種治療方法組合使用。優選硫辛酸與抗壞血酸(維生素C)組合應用。優選抗壞血酸靜脈給藥劑量為15-700g/周，更優選50-200 g/周。抗壞血酸與硫辛酸的優選比例為大約1∶1至大約3500∶1，更優選大約10∶1至大約100∶1。
本發明的另一個目的是提供一種用于治療人或其它動物癌癥的藥物組合物，它包括有效劑量的硫辛酸和抗壞血酸。抗壞血酸與硫辛酸的優選比例為大約1∶1至大約3500∶1，更優選大約10∶1至大約100∶1。優選抗壞血酸的劑量為每日輸注2-250g。優選硫辛酸的濃度為100-1000mg。
附圖概述

圖1圖示了對于作為中空纖維腫瘤生長9天并應用抗壞血酸鈉單獨治療或與硫辛酸組合治療48小時的SW620結腸腫瘤細胞的劑量-響應曲線。測試的硫辛酸濃度為5mg/dl或20mg/dl。得出用SFo表示的未使用抗壞血酸鹽的存活碎片，以及用LC50表示的將存活碎片減少至一半SFo值時所需要的抗壞血酸鹽的劑量。通過曲線擬合程序KaleidaGraph(SynergySoftware)計算SFo和LC50的標準偏差。
圖2圖示了對于作為中空纖維腫瘤生長9天并應用抗壞血酸鈉單獨治療或與硫辛酸的鈉鹽組合治療48小時的SW620結腸腫瘤細胞劑量依賴曲線。在組合治療中，硫辛酸與抗壞血酸鹽的比例為1∶10。匯總三次重復實驗數據。獲得需要將存活碎片減少至控制值一半的抗壞血酸鹽的劑量，用LC50表示。通過曲線擬合程序KaleidaGraph(Synergy Software)計算LC50的標準偏差。
圖3圖示了前列腺癌患者在80分鐘內靜脈輸注60克抗壞血酸鈉的抗壞血酸鹽血漿濃度。在24小時內測定的抗壞血酸鹽血漿濃度符合兩隔室四參數藥動模型。在該圖中給出了該模型的示意圖。得到下列參數KX＝0.124mm-1，K1＝0.124min-1，K2＝0.038mm-1。血漿容積VP固定在30dl。
圖4圖示了從抗壞血酸鹽在血液中轉運和清除的兩隔室四參數藥動模型得到的預測的血漿抗壞血酸鹽水平。得到了5個不同輸注劑量(每天25、50、75、100和125克)的血漿/時間曲線。輸注速率G(t)被設定為不同值，如圖所示。模擬連續輸注。隔室模型的參數值如下所示KX＝0.124mm-1，K1＝0.124mm-1，K2＝0.038mm-1。血漿容積VP固定在30dl。
圖5圖示了在用抗壞血酸鹽與硫辛酸治療過程中胰腺癌標記物CA-19-9的下降水平，用單元/mL血清表示。時間以開始治療的天數表示。硫辛酸以300mg劑量每天口服給藥兩次。開始以15克/周的劑量靜脈內給藥抗壞血酸鹽。治療開始一月后，該劑量增加至25克，每周兩次，此后增加至30克、50克，最后增加至75克，每周兩次。
發明詳述本發明的方法包括治療癌癥的方法，它是通過給入足夠量的與硫辛酸組合的抗壞血酸，以達到對癌細胞產生毒性的患者血漿濃度，其中該癌細胞應用模擬體內實體腫瘤的體外培養物模型進行實驗論證。本發明的基礎是通過實驗發現了當與硫辛酸組合給藥抗壞血酸鹽，明顯減少了在體外實體腫瘤模型中誘導細胞毒性所需的抗壞血酸鹽濃度。具體地，發現10∶1的抗壞血酸鹽與硫辛酸能將殺死50％處理過的腫瘤細胞所需的抗壞血酸鹽濃度減少大約5倍(與達到殺死同樣量細胞的單獨應用的抗壞血酸鹽相比)。這是令人驚訝的結果，因為硫辛酸是已表明能抑制抗壞血酸鹽介導的通過紅細胞產生過氧化氫的自由基清除劑。與抗壞血酸鹽組合應用硫辛酸的重要性在于需要對腫瘤產生有效毒性的抗壞血酸鹽水平被減少至這樣一個水平，即在通過靜脈輸注組合給藥的患者體內(即在血漿中)已被成功重復的水平。
應用在類似細胞系中細胞毒性的體外研究，按照患者所患癌癥的類型，可以設定抗壞血酸和硫辛酸的目標水平。如果可能，通過從患者獲取的惡性細胞的體外實驗，可以獲得更準確的目標水平。本發明不具體限定抗壞血酸鹽劑量和靜脈給藥方案。可以指出的方案有用1-8小時輸注或借助輸液泵連續輸注。本發明也不具體限定抗壞血酸給藥的載體。
當與附圖和權利要求一同考慮時，參照后面的本發明優選實施方案的詳細描述，本發明進一步的特征和優點對本領域普通技術人員將是顯而易見的。
DL-α-硫辛酸(DL-6，8-硫辛酸)是親脂性抗氧劑，可以很容易地商購到臨床或研究試劑級的DL-α-硫辛酸。盡管在體內應用中優選親脂型，但一些體外實驗也應用從硫辛酸制備的水溶性鹽，它是通過將硫辛酸在水溶液中與碳酸氫鈉混合、然后通過凍干干燥制備的。對于該應用而言，涉及的硫辛酸包括親脂性酸及其水溶性鈉鹽。
盡管在實踐或本發明的測試中，可以使用類似于或等同于本發明所描述的其它材料和方法，但現在描述的是優選的方法和材料。實施例1描述了對單層細胞的毒性研究，以確定組合應用抗壞血酸和硫辛酸治療癌癥的可行性。
為了測試是否組合給藥對實體腫瘤有作用，在實施例2中進行了體外測試。實施例2中空纖維實體體外腫瘤的組合治療測試應用SW620中空纖維實體腫瘤模型進行抗壞血酸鹽與硫辛酸組合實驗。在該體外腫瘤模型中，SW620細胞在三維生長，形成直徑約500μm圓柱腫瘤體，其按照微環境和增殖異質類似于體內腫瘤實體的微區(micro-region)。對于實體腫瘤，藥物必須通過擴散滲透進入中空纖維腫瘤的內區。該模型因此提供了比單層細胞更困難的藥效測試。
SW620中空纖維實體腫瘤如前所述生長。簡要地，細胞培養用途的PVDF中空纖維(500KD分子量截塊，內徑500mm，壁厚大約100mm，Spectrum Medical Co.)的制備是通過將其在甲醇中浸泡一周，然后在細胞培養介質(用抗氧劑、谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI介質)中儲存。SW620結腸腫瘤細胞在濃度為107細胞/ml的細胞培養介質中制備，然后將其注入到中空纖維中。然后以大約2cm的間隔將該纖維熱密封，以使該細胞在其內部生長。然后將SW620中空纖維在皮氏培養皿中培養3天。3天后，將中空纖維轉移至攪拌介質中，該過程或是通過將其轉移至含有50ml細胞培養介質通過磁力攪拌器以150rpm攪拌的旋轉燒瓶中，或是通過將其轉移至放置在150rpm軌道振蕩器上的六孔平板上來完成的。在3日和6日補充細胞培養介質。在第8或9日，將SW620中空纖維腫瘤轉移至含有細胞培養介質的24孔平板上，其中該細胞培養介質是用各種劑量的抗壞血酸鹽和硫辛酸或硫辛酸鈉補充的。在軌道振蕩器上培養1或2天后，將中空纖維腫瘤漂洗，應用胰島素將細胞擠出纖維。將柱狀腫瘤細胞體暴露于胰島素中，同時上下吸取以形成單一細胞懸浮液。然后將細胞培養介質加入，以終止胰島素的作用。如上所述測定存活片斷。簡要地，將細胞以5000細胞/孔的濃度轉移至96孔平板上，培養6天。然后應用SRB比色定量測定存活細胞數。存活片斷表示為在給定劑量下的SRB染色與未處理中空纖維腫瘤細胞的SRB染色的比例。
硫辛酸對SW620中空纖維的作用如圖1所示。在該實驗中，硫辛酸濃度保持恒定，而改變抗壞血酸鹽的劑量。這些數據清楚地表明，在兩種測試濃度下硫辛酸本身對三維生長的腫瘤細胞顯示出毒性作用；并且，硫辛酸放大了抗壞血酸鹽的毒性作用，在比單獨使用抗壞血酸鹽低很多的劑量下引起存活片斷的減少。在20mg/dL硫辛酸存在下抗壞血酸鹽的LC50值大約是抗壞血酸鹽不存在時的一半，該差異在統計學上是顯著的。抗壞血酸鹽的的該療效與預期的不一樣。硫辛酸清除通過抗壞血酸鹽被另外轉化成過氧化氫的游離基的性能可能表明它是保護作用，而不是毒性作用。如同其它親脂性抗氧劑如維生素E，硫辛酸可以從還原的脫氫抗壞血酸鹽形式再循環成抗壞血酸鹽。但是，該再循環的效果是不確定的盡管由于生成的過氧化氫增加，再循環的抗壞血酸鹽可以增加細胞毒性，但是任何由于抗壞血酸鹽氧化產物作用產生的細胞毒性會減少。因此，還未知硫辛酸提高抗壞血酸鹽毒性的機理，盡管該機理可能是硫辛酸能殺死耐受抗壞血酸鹽的休眠細胞，如上述單層細胞數據所示。
通過改變硫辛酸的濃度和抗壞血酸鹽的濃度，而保持抗壞血酸鹽與硫辛酸100∶1的比例(以在LC50下獲得硫辛酸5-10mg/dL的濃度)，進行另外的測試。在一系列實驗中硫辛酸的作用再次使對SW620中空纖維腫瘤的抗壞血酸鹽LC50減少約2倍。由于在體外實驗中硫辛酸由于其疏水性質效果受到限制，我們使用了硫辛酸的親水性鈉鹽，以提供抗壞血酸鹽與硫辛酸更高的比例。具體地，對SW620中空纖維腫瘤細胞，測試了抗壞血酸鹽與硫辛酸的鈉鹽10∶1的比例。結果如圖2所示，表明在該比例下硫辛酸鈉可以降低抗壞血酸鹽LC50大約5倍，從不存在硫辛酸下的490mg/dL降低至存在硫辛酸下的90mg/dL。通過比較中空纖維腫瘤中所需細胞毒性的抗壞血酸鹽濃度和在靜脈輸注中血漿中可以獲得的劑量，顯示出該結果的重要性。與90mg/dL的濃度相比，血漿抗壞血酸鹽490mg/dL的濃度更難于獲得和維持。
為了確定組合治療體內給藥的適用性，在實施例3中測定了靜脈給藥后的血清水平。
因此，中空纖維體外腫瘤的劑量-響應數據與藥動學數據和模型相結合，表明當與硫辛酸組合使用時在臨床可獲得的劑量下抗壞血酸鹽對腫瘤細胞是有毒性作用的。因此在體內腫瘤模型中進行測試。
盡管組合時動物存活率較高，但組合或不組合抗壞血酸鹽的硫辛酸對小鼠腫瘤都有毒性。盡管單獨使用硫辛酸的結果是令人驚訝的，該實驗完全能證明硫辛酸作為抗癌藥與抗壞血酸鹽組合應用的可行性。因此，在下列病例研究中，應用組合治療。
權利要求
1.硫辛酸在制備用于延緩或阻止癌瘤生長的醫藥中的應用。
2.按照權利要求1的應用，其中所述醫藥的給藥劑量為100-25,000mg/天。
3.按照權利要求1的應用，其中所述醫藥的給藥劑量為300-600mg/天。
4.按照權利要求1的應用，其中所述硫辛酸與其它治療組合應用。
5.按照權利要求4的應用，其中所述其它治療是在能延緩或阻止所述癌瘤生長的有效濃度下的抗壞血酸(維生素C)與所述硫辛酸組合應用。
6.按照權利要求5的應用，其中所述抗壞血酸的有效量為15g/周至700g/周。
7.按照權利要求6的應用，其中所述有效量的抗壞血酸為15g/周至200g/周。
8.按照權利要求7的應用，其中所述有效量的抗壞血酸為50g/周至500g/周。
9.按照權利要求5的應用，其中所述抗壞血酸與硫辛酸的重量比為大約1∶1至大約3500∶1。
10.按照權利要求9的應用，其中所述抗壞血酸與硫辛酸的重量比為大約10∶1至大約100∶1。
11.用于治療哺乳動物癌癥的藥物組合物，其中所述組合物包括有效劑量的抗壞血酸(維生素C)濃度組合以有效劑量的硫辛酸濃度；以及藥物可接受的載體。
12.按照權利要求11的藥物組合物，其中所述抗壞血酸與硫辛酸的重量比為大約1∶1至大約3500∶1。
13.按照權利要求12的藥物組合物，其中所述抗壞血酸與硫辛酸的重量比為大約10∶1至大約100∶1。
14.按照權利要求11的藥物組合物，其中所述抗壞血酸的濃度為2-250g。
15.按照權利要求11的藥物組合物，其中所述硫辛酸的濃度為100-25,000mg。
全文摘要
硫辛酸和/或其水溶性鹽單獨使用或與抗壞血酸(維生素C)組合使用,用于治療癌癥。單獨使用或組合使用均表明對體外腫瘤和小鼠腫瘤有效。該制劑可以安全給藥,并已有效用于臨床病例研究中。
文檔編號A61K31/381GK1338932SQ00803525
公開日2002年3月6日 申請日期2000年2月11日 優先權日1999年2月16日
發明者約瑟夫·卡夏里, 尼爾·H·賴爾登 申請人:人機能改善中心國際有限公司