專利名稱：穩定的非水性單相粘性載體及采用該載體的制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及穩定的非水性單相粘性生物相容載體，該載體可混懸有益物質并可以低流速均勻分散所述物質，具體地說，涉及有益物質處于穩定的非水性單相生物相容粘性載體中的穩定的均勻混合制劑。
參考文獻本說明書的相關部分方括號([])中的數字引用的是下列文獻。1.Wang，等.J.Parenteral Sci.Tech.，42S4-S26頁(1988年)。2.Desai，等.J.Am.Chem.Soc.，1169420-9422頁(1994年)。3.Chang，等.Pharm.Tech.，80-84頁(1996年，6月)。4.Manning，等.Pharm.Res.，6903-918頁(1989年)。5.Hageman，Drug Dev.Ind.Pharm，142047-2070頁(1988年)。6.Bell，.Biopolymers，35201-209頁(1995年)7.Zhang，等.Pharm.Res.，121447-1452頁(1995年)。8.PCT公開號98/001589.PCT公開號981625010. Knepp，等.Pharm.Res.，15(7)1090-1095頁(1998年)。11. PCT公開號98/0015712. PCT公開號98/0015213. US554091214. US557152515. US551229316. PCT公開號96/4004917. Yu，等.J.Pharm.Sci.，85396-401頁(1996年)18. Mitchell，US5411951(1995年)19. Brooks，等.US5352662(1994年)20. Geller，L.，US3869549(1975年)21. Larsen，等.WO95/34285(1995年)22. Knepp，等.J.Pharm.Sci.Tech，50163-171頁(1996年)23. US561422124. US459410825. US530030226. US458861427. US431051628. US563521329. EP379147
由于蛋白質易于降解，因此用于此類化合物的標準給藥方法是每日注射。蛋白質存在多種降解機理，包括天冬酰胺和谷酰胺的脫酰胺；蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和組氨酸的氧化；肽鍵的水解；二硫化物交換；手性氨基酸殘基的外消旋[1-7]。水是幾乎所有降解途徑的反應物。作為成形劑(Plasticizer)，水可促進蛋白質的伸展和不可逆聚集。由于水參與幾乎所有蛋白質的降解途徑，因此減少水性溶液而將蛋白質制成干粉，為提高蛋白質藥品穩定性提供了另一制劑方法學。
一種穩定蛋白質的方法是用各種技術將其干燥，例如采用冷凍干燥、噴霧干燥、凍干和干燥。干燥的蛋白質在使用前以干粉形式貯存。
蛋白質干燥的一個嚴重缺陷是人們喜歡使用可流動形式的蛋白質。非腸道注射和緩釋給藥裝置是受人喜歡可流動形式蛋白質的兩個實施例。對于注射來說，干燥的蛋白質必需重建，這就增加了耗時步驟并且有可能產生污染，也可能將蛋白質暴露于不利穩定的環境下[7]。對于使用給藥裝置而言，蛋白質制劑必須在體溫下持久穩定并且在裝置的預定使用期內保持流動性。
用于蛋白質/肽溶液制劑的非水性極性非質子傳遞溶劑如二甲亞砜(DMSO)二甲基甲酰胺(DMF)，已被證實可在高溫下持久穩定[8]。然而，由于一些蛋白質在此類溶劑中的溶解度低，因此含此類溶劑的制劑并不是對所有蛋白質都穩定。制劑中蛋白質的溶解度越低，用于運送特定量蛋白質的溶劑量就越大。低濃度溶液可能適于注射，但是不適于長期低速給藥。
已有采用全氟萘烷[9，10]、甲氧氟烷[9]、水中高濃度[11]、聚乙二醇[12]、PLGA[13，14]、乙烯醋酸乙烯酯/聚乙烯吡咯烷酮混合物[15]、PEG400/聚維酮[16]將蛋白質制成給藥制劑。然而，這些制劑不能使蛋白質在粘性載體中持久地保持均勻的混懸液。
許多生物活性化合物在水性環境中均降解。蛋白質不是溶解而是混懸于載體中，這樣的載體可提高化學穩定性。另外，如果有益物質在所需載體中的溶解較低，那么將其混懸于載體中是有益的。然而，由于所混懸的有益物質易于凝結和聚集，混懸液的物理穩定性其實很低。在非水性載體中，這種問題隨著活性化合物的濃度增加而加劇。
已有研究[17-21]將粉化蛋白質或肽分散到類脂載體載體中制備非腸道緩釋制劑。所用載體可以是植物的(芝麻、大豆、花生等)或合成油類(如Miglyol)，它們用鋁脂肪酸酯如硬脂酸鋁(一-，二-或三聚)、或用聚甘油酯膠凝化。盡管理論上這些載體可防止溶液變性并可保護藥物不發生水性化學降解，這些載體本身在較高溫度下并不穩定。液態植物油在體溫下貯存會形成活性種如游離脂肪酸和過氧化物(一種可被從某些植入裝置流失的痕量金屬離子如銅或鐵加速的過程)。這些過氧化物對蛋白質穩定性并無影響[22]，但是可產生毒性，特別是直接向人或動物的中樞神經系統給藥時。
緩釋給藥有許多益處，使用植入裝置可確保病人用藥順應性，因為給藥裝置是防干擾的。僅僅需要將裝置植入而不需每日注射，這減少位點刺激性。降低了醫師的職業危險，降低了重復注射設備而提高了成本效果，減少廢料處置的風險，并且與貯庫式注射相比其控釋效率提高。現有技術中已有許多藥物或其他有益物質采用植入裝置緩釋給藥。典型的裝置可見專利US5034229、5057318、5110596和5782396的描述，其公開內容在此引入作為參考。
對于植入給藥而言，劑量維持期一般可長達一年。適用于植入劑的藥物主要是較低治療給藥速率的有益物質。當裝置植入或貯存時，液體制劑中有可能產生有益物質的凝結。這種不均勻性對所分散的有益物質的濃度有負面影響。再就是植入的有益物質貯庫的大小問題。植入貯庫通常為25-250μl，但也可高達25ml。
采用用時和所用藥物混合的兩種單獨組分[23]、加到水性組合物中的增稠劑[24]、加到水性藥物溶液中的膠凝劑[25]、多孔織物片狀基質[26]、含油狀材料的增稠劑[27]、用于有限溶解度藥物的粘性水性載體[28]、和可壓的彈性凝膠[29]可制得粘性制劑。然而，這些制劑在用時混合，含有水性組分，采用片狀基質，或經局部、口服或十二指腸給藥。
可通過冷凍干燥、凍干或噴霧干燥活性成分來提高制劑的穩定性。干燥活性成分的優點還包括可對在水性溶液中相對不穩定的化合物進行處理并將其裝入劑量容器中，在不升高溫度下干燥并且以干燥狀態貯存，這樣穩定性問題就相對少一些。
藥用制劑特別是非腸道給藥產品，在盡可能短的時間內裝入并密封于最終容器中后應當滅菌。(可參見Remington，PharmaceuticalSciences，第15版.(1975年))。滅菌技術的實施例包括熱或干熱、除菌(aseptic)和電離輻射。也可聯合使用上述滅菌方法。
有必要將蛋白質組合物運送到體內，并且使其在體溫下持久穩定從而可長期給予蛋白質。也有必要運送有效濃度的蛋白質。因此，需要一種新穎的非水性制劑，它在體溫下可持久地低流速均勻混懸和分散蛋白質。
發明簡述本發明提供可形成蛋白質均勻混懸液的穩定的單相非水性生物相容粘性載體。該粘性載體的組分包括至少聚合物、表面活性劑和溶劑中的兩種組分。依據組分的分子量和最終載體所需的粘度可變化組分間比率。優選組分的比率為聚合物約5-60％、溶劑約30-50％和表面活性劑約5-20％。
本發明還提供穩定制劑，其中有益物質均勻地混懸于穩定的單相非水性生物相容粘性載體中。具體而言，粘性載體中有益物質的濃度至少為0.1％，這取決于有益物質的效力。這些穩定制劑可持久地(1-12月或更長)在有益物質適宜的溫度下貯存，溫度可從較涼至體溫(約37℃)。在一個優選實施方案中，制劑中可含有0.1-50％(w/w)的有益物質，這取決于有益物質的效力、治療時間和給藥系統的釋放率。
這些制劑特別適于植入給藥系統在體溫優選約37℃下低流速長期(如1-12月或更長)給予藥物。本發明可持久地向體內運送蛋白質，這樣就可以約0.3-100μl/天、優選約0.3-4μl/天的低流速長期給予蛋白質達約6個月，優選以5-8μl/天的流速給藥約3個月。
本發明另一方面還提供制備含有益物質的單相粘性載體的非水性生物相容制劑的方法。優選的制劑含有0.1-50％(w/w)的有益物質，這取決于有益物質的效力、治療時間和給藥系統的釋放率。
本發明另一方面還提供一種治療疾病的方法，其中患者患有給予有益物質可減輕的疾病，該方法包括將治療有效量的穩定的非水性制劑給予患者，所述制劑含有至少一種均勻混懸于單相粘性載體中的有益物質。
另一方面，本發明含有有益物質的非水性單相粘性載體在廣泛的溫度范圍內可長期保持化學和物理穩定性。單相粘性載體中的有益物質在廣泛的溫度范圍內也可持久地保持化學和物理穩定性。這樣，這些制劑可在低于、等于或高于室溫的環境下長期運輸和貯存。它們也適用于要求其所含制劑在體溫下持久穩定的植入裝置。
本發明制劑采用植入給藥系統運送時也可保持穩定。當從植入給藥系統以低流速釋放時，有益物質可持久地表現為零級釋放速率。
附圖簡述

圖1為37℃下用反相HPLC測定的本發明hGH制劑的穩定性。
圖2為37℃下用粒度排阻色譜測定的本發明hGH制劑的穩定性。
圖3為本發明含10％噴霧干燥溶菌酶的制劑的平均釋放速率(μl/天)。
圖4為含10％噴霧干燥hGH的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮載體的平均釋放速率(μl/天)。
圖5為含10％溶菌酶的月桂醇/聚乙烯吡咯烷酮載體的平均釋放速率(μl/天)。
圖6為含25％溶菌酶的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮載體的平均釋放速率(μl/天)。
圖7為含33％溶菌酶的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮載體的平均釋放速率(μl/天)。
圖8為含45％溶菌酶的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮載體的平均釋放速率(μl/天)。
發明詳述本發明涉及出人意料的發現將有益物質均勻分散于非水性單相生物相容的粘性載體中，所得的穩定制劑可在體溫下持久地低流速給藥。已知用含或不含賦形劑的水性或非水性溶液緩沖的有益物質制劑，由于其不能在體溫下持久地低流速均勻分布而出現了不可接受量的制劑聚集或降解。本發明要求保護的制劑使有益物質穩定，并且可在有益物質適宜的溫度下貯存。溫度可以持久地從較涼(不超過8℃)至體溫(約37℃)。這些制劑特別適于植入給藥系統在體溫優選約37℃下低流速長期(如1-12月或更長)給藥。
標準的有益物質制劑由稀釋的水性或非水性溶液或混懸液組成。通過調節以下條件中的一項或幾項可以穩定藥物pH、緩沖劑類型、離子強度、賦形劑(EDTA、抗壞血酸等)。由于存在需要水的降解途徑(水解、脫酰胺、外消旋)，這些制劑不能完全穩定化。在本發明中，有益物質處于非水性生物相容的單相粘性載體中，該載體含有例如聚乙烯吡咯烷酮、醋酸乙烯酯、和/或聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物而表現出化學和物理穩定性。制劑的粘度取決于多個標準，包括有益物質的效力和濃度、和制劑的制備方法。對制劑粘度加以選擇可使之在所需時間內運送所需量的有益物質。
本發明也可由均勻混懸有益物質的非水性單相生物相容的粘性載體和含有至少一種可在所述粘性載體中均勻混懸的有益物質的制劑組成。本發明也可由含有至少一種可在非水性單相生物相容粘性載體中均勻混懸的有益物質的制劑組成，所述制劑在體溫下持久穩定，并可低速率均勻運送所述有益物質。本發明在于穩定的非水性粘性載體在包括濃度、高溫和制劑保持穩定時間等廣泛的制劑條件下提高了有益物質的穩定性，這樣就可能使用植入裝置長期給予有益物質，而這是其它制劑不能達到的。定義在此使用的術語具有以下含義術語“化學穩定性”指經化學降解途徑如氧化、脫酰胺、水解產生了可接受百分數的降解產物。具體而言，如果制劑在37℃下2個月后的降解產物不超過35％，就可認為是化學穩定的。
術語“物理穩定性”指產生了可接受百分數的有益物質聚集(如二聚體、三聚體或更多聚體)。對于制劑(粘性載體和有益物質)來說，該術語指制劑有適宜的穩定性、流動性和均勻分散有益物質能力。具體而言，如果制劑在37℃下2個月后的聚體物不超過15％，就可認為是物理穩定的。
術語“穩定的制劑”指在37℃(或高溫的相當條件)下2個月后制劑中仍含有至少65％的化學和物理穩定的有益物質。特別優選制劑在這些條件下仍含有至少80％的化學和物理穩定的有益物質。特別優選的制劑在輻射滅菌(如γ、β或電子束)后沒有降解。
術語“有益物質”指肽、蛋白質、核酸、激素、病毒或抗體等，包括氨基酸或核酸殘基的聚合物。這些有益物質在水中一般是可降解的，但是其干粉在高溫下通常穩定。該術語也包括合成、天然衍生或重組的組分。該術語還包括脂蛋白及其轉譯后(Posttranslationally)的修飾形式如糖化蛋白質。同樣地，該術語也包括其衍生物、激動劑、拮抗劑和可藥用鹽。該術語也包括蛋白質和/或具有D-氨基酸、在D-或L-構型和/或其結構的胨樣單元中有修飾的、衍生的或非天然形成的氨基酸的蛋白質物質。本發明將采用術語蛋白質。該術語也指固態如粉狀或結晶的有益物質。
術語“賦形劑”指作為稀釋劑或載體或提供賦形或稠度而加入制劑中的惰性物質。賦形劑并非用于溶解藥物的溶劑如乙醇(ETOH)。賦形劑包括非離子表面活性劑如在制劑用于藥物增溶的聚山梨酸酯；用于防止或抑制微生物生長的防腐劑如苯甲醇或甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；螯合劑；調味劑；和其它可藥用的制劑輔劑。
術語“粘性載體”指粘度約為1,000-10,000,000泊的載體。包括牛頓流體和非牛頓流體。優選粘度約為10,000-250,000泊的載體。本發明制劑可將混懸于粘性載體中的有益物質均勻地從植入給藥裝置中排出。制劑在所述裝置出口的剪切速率約為1-1×10-7倒易秒，優選出口剪切速率約為1×10-2×10-5倒易秒。
術語“單相”指經差示掃描量熱法(DSC)測得物理和化學均勻的固體、半固體或液體系統。DSC掃描僅出現單峰表示系統為單相。
術語“生物相容的”指粘性載體經過長期對病人體內生物環境的反應而分解或碎裂性質或特性。這可經一種或多種物理或化學降解過程來完成，例如通過酶解作用、氧化或還原、水解(蛋白水解)、置換如離子交換、或通過增溶、乳化或形成膠束而溶解，然后這些物質被身體和周圍組織吸收、或消散。
術語“聚合物”包括聚酯如PLA(聚乳酸)[其比濃對數粘度為0.5-2.0i.v.]和PLGA(聚乳酸聚乙醇酸)[其比濃對數粘度為(0.5-2.0i.v.]、吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮(其分子量為2,000-1,000,000)、不飽和醇的酯或醚如醋酸乙烯酯、和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(37℃下具有高粘度)如Pluronic 105。通常優選的聚合物為聚乙烯吡咯烷酮。
術語“溶劑”包括羧酸酯如月桂基乳酸酯、多元醇如甘油、多元醇聚合物如聚乙二醇(其分子量為200-600)、脂肪酸如油酸和辛酸、油類如蓖麻油、碳酸丙烯酯、月桂醇、或多元醇酯如甘油三乙酸酯。通常優選月桂基乳酸酯。
術語“表面活性劑”包括多元醇酯如甘油一月桂酸酯、乙氧基化蓖麻油、聚山梨酸酯、飽和醇的酯或醚如肉豆蔻基乳酸酯(Ceraphyl 50)、和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物如Pluronic。通常優選甘油一月桂酸酯和聚山梨酸酯。
術語“抗氧劑”指可用于防止有益物質降解如氧化的可藥用輔劑。抗氧基包括但不限于生育酚(維生素E)、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、叔丁對甲氧酚、二叔丁基對甲酚和丙基沒食子酸酯。優選的抗氧劑在于其溶解度和其防止優選載體中有益物質降解或化學變化的效力。一般優選棕櫚酸抗壞血酸酯。制備制劑本發明涉及可在體溫下持久地低流速混懸和均勻分散有益物質的穩定的非水性單相生物相容粘性載體。本發明還涉及所含有益物質均勻地混懸于單相生物相容粘性載體中的制劑，所述載體在體溫下可持久穩定。
本發明制劑所采用的有益物質包括具有生物活性或可用于治療疾病或其它病理學狀態的蛋白質或肽。其中包括但不限于促腎上腺皮質激素、血管緊張素I和II、心鈉素肽、鈴蟾肽、緩激肽、降鈣素、小腦肽、強啡肽N、α和β內啡肽、內皮素、腦啡肽、表皮生成因子、fertirelin、卵泡促性腺素釋放肽、galanin、胰高血糖素、GLP-1、促黃體生成素釋放素、促性腺素、促性腺激素釋放激素、促生長素釋放肽、組胺瑞林、人生長激素、胰島素、干擾素、亮丙瑞林、LHRH、胃動素、那法瑞林、神經緊張素、催產素、松弛素、生長抑素、物質P、腫瘤壞死因子、曲普瑞林、加壓素、生長激素、神經生長因子、血液凝集因子、核糖酶和反義寡聚核酸。及上述物質的類似物、衍生物、拮抗劑激動劑和可藥用鹽。
本發明制劑和方法所采用的有益物質可以是其鹽、優選可藥用鹽形式。適用的鹽為本領域技術人員已知，包括無機酸、有機酸、無機堿或有機堿的鹽。
本發明優選有益物質在非水性溶劑中不易溶。這樣，本領域技術人員基于其溶解度可很容易地確定有益物質。根據化合物的效力、治療的疾病、化合物的溶解度、預定的給藥劑量和維持期，可對有益物質的用量加以調整。(例如可參見Gilman等的The PharmacologicalBasis of Therapeuticus，第7版.(1990年)和Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版.(1990年)，上述公開內容在此引入作為參考)。
令人驚奇地發現采用穩定的非水性單相生物相容粘性載體可提高有益物質的穩定性。例如，如圖1和2所示，聚乙烯吡咯烷酮/PEG；Pluronic；和甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮制劑中人生長激素(hGH)可在37℃下穩定12個月以上。圖1和圖2分別為用反相HPLC和粒度排阻色譜測定的穩定性結果。
通常，將干燥(低濕度)的組分置于干燥箱或干燥條件下并于高溫優選約40-70℃混合，使其液化而制得穩定的非水性單相生物相容粘性載體。然后將液態載體冷卻至室溫。經差示掃描量熱法(DSC)證實載體為單相。粘性載體的最終濕度低于2％。
通常，在干燥條件下將載體和有益物質真空高溫優選約40-70℃混合，使有益物質均勻地分散在所述載體中而制得本發明的穩定制劑。然后制劑冷卻至室溫。
在制備制劑之前先干燥有益物質被證明有利于提高制劑的穩定性。
同時也發現，加入抗氧劑如生育酚、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、叔丁對甲氧酚、二叔丁基對甲酚和丙基沒食子酸酯，可減少制劑在滅菌中產生的降解產物(如不穩定的化學中間體)。方法學在干燥條件下，將粘性載體組分高溫混合使其液化并形成單相，可制得含粘性載體的穩定的非水性有益物質制劑。單相粘性載體形成后將其冷卻至室溫。真空高溫下混合將有益物質加入使其均勻地分散在所述粘性載體中。
對有益物質如hGH制劑進行加速老化試驗來考察其穩定性。結果表明這些制劑可持久保持穩定。
將有益物質如人生長激素和溶菌酶混懸于本發明各種非水性單相粘性載體中，然后將置于高溫下進行加速老化試驗來考察這些制劑的穩定性。測量制劑的穩定性。研究結果證實這些制劑在37℃下可至少穩定貯存約一年。
同時還考察了這些有益物質制劑經2.5兆拉德γ-輻射后的穩定性。結果表明經上述輻射后仍能保持化學和物理穩定性。方法以下方法可用于實施下述實施例。
1.制備蛋白質粉末人生長激素(可購自BresaGen公司，Adelaide，澳大利亞)于去離子水中重建活性劑。含活性劑的溶液用Amicon Diaoflo超濾膜(截留(cut-off)分子量為1000)進行緩沖交換。
超濾的活性劑溶液用YAMATO小型噴霧干燥器噴霧干燥。用收集器的離心式捕獲器收集粉末。對噴霧干燥粉末的處置均在經氮氣排空的干燥箱中進行。用粒度排阻和反相色譜分析所得粉末的粒徑和分布、濕度、蛋白質含量和穩定性。
已知加入糖類(如蔗糖或甘露醇)或多元醇(如乙二醇、甘油、葡萄糖和右旋糖酐)可穩定某些蛋白質的構象。
2.制備粘性載體高溫下將組分混合使其液化并形成單相可制得穩定的單相生物相容粘性載體。經DSC掃描僅出現單峰表示為單相。于真空下混合完全以除去粉末中的氣泡。混合器為轉速40轉/分種的雙螺旋葉片混合器(D.I.T)。可采用更高轉速但并不需要。
如果要制備含三組分的粘性載體，則先將溶劑加入混合器的加熱筒中，再加入表面活性劑，最后加入聚合物，混合組分直至獲得溶液(即單相)。混合時使用真空以除去氣泡。高溫下分散溶液，然后冷卻至室溫。冷卻后載體的粘度增加。含二或單組分的凝膠可按同樣方法制備。
3.制備有益物質制劑為了制備制劑，將單相粘性載體加熱后與一定量的有益物質真空下混合。用雙螺旋葉片混合器(或其它類似混合器)按制備載體的方法混合有益物質的粘性載體。40-120轉/分鐘混合約15分鐘或直至獲得均勻的分散體。從混合器中取出所得混合物，密封于干燥容器中并冷卻至室溫。
4.制備貯庫將適宜的hGH制劑裝入植入給藥系統的貯庫(如專利申請US08/595761中所披露的，在此引入作為參考)中。用聚合物塞將鈦貯庫的兩端堵住。將含藥貯庫密封于polyfoil袋中并置于穩定性試驗烘箱中。
這些裝置貯庫中的制劑完全與外界隔離。
5.反相高效液相(RP-HPLC)用反相色譜(RP-HPLC)分析hGH穩定性試樣的蛋白質含量和化學穩定性。分析時采用配有冷卻自動進樣器(4℃)的Hewlett PackardHP-1090系統。色譜條件如下表所示。
表1反相HPLC色譜條件種類參數柱子J.T.Baker-C18，4.6×250mm流速1.0mL/min檢測214nm流動相 A含0.1％三氟乙酸的水B含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度時間 ％A ％B065355505045 356550 307055 6535制備hGH的參比標準溶液，測定其280nm吸收值計算其中的蛋白質含量。在每一進樣的開始和結尾時，分別重復進樣該溶液的三個稀釋液，即代表試樣中hGH預定濃度的80％、100％和120％，用來計算試樣中蛋白質總含量。
6.粒度排阻色譜(SEC)用粒度排阻色譜分析hGH穩定性試樣的蛋白質含量和高分子量的降解產物。分析是采用配有冷卻自動進樣器(4℃)的Hewlett PackardHP-1090系統。色譜條件如下表所示。
表2粒度排阻色譜色譜條件種類 參數柱 TSK-2000SWXL流速 0.5ml/min檢測 214nm流動相 25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.0
制備hGH的參比標準溶液，測定其280nm吸收值計算其中的蛋白質含量。在每一進樣的開始和結尾時，分別重復進樣該溶液的三個稀釋液，即代表試樣中hGH預定濃度的80％、100％和120％，并計算試樣中蛋白質總含量。用面積歸一法計算高分子量降解產物的含量。
下列實施例用于說明本發明，但不以任何方式對本發明的范疇加以限定。
實施例1制備非水性單相粘性載體下面將制備非水性單相粘性載體并示于下表中。A.于65℃下，將甘油一月硅酸酯(Danisco Ingredients，NewCentury，堪薩斯州)(25g)溶于月桂基乳酸酯(ISP Van Dyk公司.，Belleville，新澤西州)(35g)中。加入聚乙烯吡咯烷酮C30(BASF，Mount Olive，新澤西州)(40g)，混合物用轉速40轉/分種的雙螺旋葉片混合器(D.I.T)混合直至獲得單相。在混合室中使用真空以除去氣泡。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。B.于65℃下，將甘油一月硅酸酯(Danisco Ingredients，NewCentury，堪薩斯州)(25g)溶于月桂基乳酸酯(ISP Van Dyk公司.，Belleville，新澤西州)(35g)中。加入聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(40g)，混合物用轉速40轉/分種的雙螺旋葉片混合器(D.I.T)混合直至獲得單相。在混合室中使用真空以除去氣泡。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。C.于約65℃下，將聚乙烯吡咯烷酮C30(BASF，Mount Olive，新澤西州)(50g)溶于聚乙二醇400(Union Carbide)(50g)中，直至獲得單相溶液。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。D.于約65℃下，將聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(50g)溶于聚乙二醇400(Union Carbide)(50g)中，直至獲得單相溶液。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。E.于約65℃下，將聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(50g)溶于蓖麻油(Spectrum，Gardena，CA)(50g)中，直至獲得單相溶液。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。F.于約65℃下，將聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(50g)溶于辛酸(Spectrum，Gardena，CA)中，直至獲得單相溶液。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。G.于約65℃下，將聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(50g)溶于油酸(Spectrum，Gardena，CA)中，直至獲得單相溶液。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。H.于約65℃下，將聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(35％)溶于甘油(Bker，新澤西州)(65％)中，直至獲得單相溶液。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。I.于約65℃下，將Cremophor EL(乙氧基化蓖麻油)(BASF，MountOlive，新澤西州)(5％)溶于蓖麻油(Spectrum，Gardena，CA)(70％)中，加入聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新澤西州)(25％)并溶解，混合物用約40轉/分鐘轉速混合直至獲得單相載體。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。J.Pluronic 105(BASF，Mount Olive，新澤西州)隨著混合加熱至約65℃直至融化。從混合器中取出單相載體，并冷卻至室溫。
表3組分比率組分 低剪切率時的聚合物表面活性劑溶劑 比率 粘度(泊)PVP GMLLL 53∶5∶42 25,000PVP GMLLL 55∶10∶3550,000PVP GMLLL 50∶15∶357,000PVP ----- LA 60∶40PVP Ceraphyl50 LA 60∶10∶30PVP ----- 油酸50∶5030,000PVP ----- 辛酸55∶457,000PVP 吐溫80 ----- 50∶50PVP ----- PEG400 50∶50PVP 蓖麻油 ----- 50∶50----- Pluronic105----- 100 1,000,000PVP ----- 甘油50∶505,000其中GML＝甘油-月桂酸酯LL＝月桂基乳酸酯PVP＝聚乙烯吡咯烷酮C30LA＝月桂醇PEG＝聚乙二醇400實施例2制備hGHA.噴霧干燥法制備凍干的hGH(BressaGen公司，Adelaide，澳大利亞)用150ml去離子水重建。該儲備液含1050mg hGH。用Amicon Diaoflo超濾膜(截留分子量為1000)進行緩沖交換。超濾池(cell)與含有5mM磷酸鹽緩沖液(pH7)的輔助貯庫連接。超濾池的流體體積及hGH的濃度隨著磷酸鹽緩沖液置換賦形劑而保持恒定。
超濾的蛋白質溶液(其中蛋白質的濃度約2％)用YAMATO小型噴霧干燥器噴霧干燥。噴霧干燥器的設置如下抽吸(aspiration)壓力通常定為1.3kgf/cm2，進口溫度為120℃，噴液速率為2.5(約3ml/分鐘)。用收集器的離心式捕獲器收集粉末。對噴霧干燥粉末的處置均在氮氣排空的干燥箱(相對濕度1-4％)中進行。混懸載體的水分含量如下表所示。
表4混懸載體的水含量0時載體中37℃，12周時水含量 載體中水含量載體 ％w/w％w/wPluronic105 0.25 0.4GML/LL/PVP1.5 1.3PVP/PEG 2.0 2.0其中GML＝甘油-月桂酸酯LL＝月桂基乳酸酯PVP＝聚乙烯吡咯烷酮C30PEG＝聚乙二醇400實施例3制備hGH制劑稱取部分單相粘性載體(9g)并加熱到60℃。將hGH(BressaGen公司，Adelaide，澳大利亞)(1g)加入載體中并混合15分鐘。于真空下混合完全以除去粉末中的氣泡。
稱取約10mg噴霧干燥的hGH粉末(基于測定的水和鹽含量重新計算粉末中hGH的含量)，與100μl載體(每種載體取3個試樣)55-65℃下混合。仔細將粉末混合于混懸載體中，以獲得在載體中有最大化的顆粒均分散體。所有步驟均在干燥箱中進行。
用10ml release rate緩沖液溶解所得混懸液，并用粒度排阻和反相色譜分析。以噴霧干燥的hGH粉末為對照品。
表5粒度排阻色譜法測得的hGH混懸液在37℃的穩定性時間 噴霧干燥PVP/PEG400GML/LL/PVP Pluronic105周 粉末-80℃混懸液 混懸液 混懸液％LS％LS ％LS％LS096±188±6 92±2 87±7199±881±2 94±3 93±3299±383±1 97±1 94±1397±184±2 95±2 95±3495±282±8 94±4 93±5795±476±3 93±4 88±21297±479±3 97±1 95±6每一數據點均為取自3個獨立小瓶的3個獨立試樣的平均值±相對標準偏差。
表6反相HPLC測得的hGH混懸液在37℃時的穩定性時間噴霧干燥 PVP/PEG 400GML/LL/PVP Pluronic105周 粉末-80℃ 混懸液 混懸液 混懸液％LS ％LS ％LS ％LS0 104±1 99±3 99±289±71 104±8 78±2 98±396±62 104±4 73±3 95±196±13 104±2 78±4 97±397±44 100±2 74±10 93±496±47 108±5 72±4 96±294±29 102±3 66±3 92±393±212 101±2 66±1 89±292±5每個數據點均為取自3個獨立小瓶的3個獨立試樣的平均值±相對標準偏差。
實施例4制備貯庫釋放速率圖植入給藥裝置的鈦貯庫系統(如專利申請US08/595761中所披露的，在此引入作為參考)均配備有滲透裝置(engine)、活塞和控釋膜。將適宜量的粘性載體制劑裝入貯庫中，并用流動塞堵住。將該系統置于37℃水浴中，使其持久釋放制劑。釋放的物質每周取樣兩次。用反相高效液相分析釋放物質。將每種系統的有益物質濃度折算成每日釋放量。如圖3-8所示，有益物質從植入給藥裝置中的釋放為零級釋放。
實施例5非水性粘性載體制劑中hGH的穩定性如上所述制備載體中含10％w/w hGH的制劑，并密封于小瓶中。將制劑置于控溫烘箱中進行高溫加速老化試驗，試驗條件見下表。
表7粒度排阻色譜 反相HPLC載體 時間(小時)溫度 測得的％LS 測得的％LSPluronic105 0 50℃ 98±3 101±3Pluronic105 1 50℃ 98±3 101±4Pluronic105 2 50℃ 100±1102±3Pluronic105 4 50℃ 101±3105±3GML/LL/PVP 0 65℃ 99±3 101±3GML/LL/PVP 1 65℃ 93±6 97±6GML/LL/PVP 2 65℃ 91±5 95±5GML/LL/PVP 4 65℃ 95±3 98±3每一數據點均為取自3個獨立小瓶的3個獨立試樣的平均值±相對標準偏差。
如下表所示，結果證明這些制劑在各種條件下均可保持hGH的穩定性。在每種條件下，hGH的含量至少保持為70％。
表8hGH從非水性混懸液中的回收率載體反相HPLC測得的％LS 粒度排阻HPLC測得的％LSPVP/PEG 400 99±3％ 88±6％GML/LL/PVP 99±2％ 92±2％Pluronic105 89±7％ 87±7％
每一數據點均為取自3個獨立小瓶的3個獨立試樣的平均值±相對標準偏差。
％LS％或稱％標示濃度＝(測得的蛋白質濃度+理論的蛋白質濃度)×100％本領域技術人員在本發明的教導下，很容易對上述許多實施方案的實施方式加以修改。上述實施例僅用于說明本發明，并不對下面權利要求所定義的本發明的范疇構成任何限制。
權利要求
1.一種穩定的非水性單相生物相容粘性載體，該載體可混懸有益物質并可在體溫下持久地低流速均勻分散所述有益物質。
2.如權利要求1的載體，包括選自溶劑、表面活性劑和聚合物的兩種組分，其中兩種組分不是同一類型。
3.如權利要求1的載體，包括選自溶劑、表面活性劑和聚合物的至少兩種組分，其中各組分不是同一類型。
4.如權利要求1的載體，包括選自溶劑、表面活性劑和聚合物的三種組分，其中各組分不是同一類型。
5.如權利要求2或4的載體，其中所述溶劑選自羧酸酯、多元醇、多元醇聚合物、脂肪酸、油類、碳酸丙烯酯、月桂醇和多元醇酯。
6.如權利要求2或4的載體，其中所述表面活性劑選自多元醇酯、乙氧基化蓖麻油、聚山梨酸酯、飽和醇的酯或醚、和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。
7.如權利要求2或4的載體，其中所述聚合物選自聚酯、吡咯烷酮、不飽和醇的酯或醚、和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。
8.如權利要求2的載體，其中組分間的比例為40∶60-60∶40。
9.如權利要求4的載體，其中各組分的比例為溶劑約30-50％，表面活性劑約5-20％，和聚合物約5-60％
10.如權利要求4的載體，其中聚合物為聚乙烯吡咯烷酮，表面活性劑為甘油一月桂酸酯(gml)，溶劑為月桂基乳酸酯。
11.如權利要求4的載體，其中聚合物為聚乙烯吡咯烷酮，表面活性劑為聚山梨酸酯，溶劑為月桂基乳酸酯。
12.如權利要求1的載體，其中包括抗氧劑。
13.如權利要求12的載體，其中抗氧劑選自生育酚、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、叔丁對甲氧酚、二叔丁基對甲酚和丙基沒食子酸酯。
14.一種穩定的非水性粘性蛋白質制劑，包括a)至少一種有益物質，和b)非水性單相生物相容粘性載體，該制劑可在低流速下持久地均勻分散。
15.一種非水性制劑，包括至少一種均勻混懸于非水性單相生物相容粘性載體中的有益物質，該制劑可采用植入給藥系統給藥，該制劑的出口剪切速率約為1-1×10-7倒易秒。
16.如權利要求14的制劑，其中制劑在體溫下可持久穩定。
17.如權利要求14的制劑，其中包括至少0.1％(w/w)的有益物質。
18.如權利要求14的制劑，其中包括至少10％(w/w)的有益物質。
19.如權利要求14的制劑，其中有益物質選自肽、蛋白質、核酸、激素、病毒或抗體。
20.如權利要求19的制劑，其中有益物質為蛋白質。
21.如權利要求14的制劑，其中制劑在65℃下至少穩定2個月。
22.如權利要求14的制劑，其中制劑在37℃下至少穩定3個月。
23.如權利要求14的制劑，其中制劑在37℃下至少穩定一年。
24.如權利要求14的制劑，所述制劑適用于植入給藥裝置。
25.如權利要求14的制劑，其中載體選自溶劑、表面活性劑和聚合物。
26.如權利要求14的制劑，其中載體包括抗氧劑。
27.如權利要求14的制劑，其中有益物質在摻入該制劑之前先經干燥至低濕度。
28.如權利要求14的制劑，所述制劑經滅菌后仍穩定。
29.一種制備如權利要求1的穩定的單相粘性載體的方法，包括(1)在干燥條件下高溫混合組分使其液化，和(2)將步驟(1)獲得的液體冷卻至室溫。
30.一種制備如權利要求14的穩定制劑的方法，包括在干燥條件下合并有益物質和單相粘性載體并于真空下高溫混合，使有益物質均勻分散于載體中，并將所得制劑冷卻至室溫。
31.如權利要求30的方法，其中至少有約0.1％(w/w)的有益物質混懸于所述載體中。
32.如權利要求30的方法，其中至少有約10％(w/w)的有益物質混懸于所述載體中。
33.一種治療患有給予有益物質可減輕的疾病的患者的方法，包括將治療有效量的如權利要求14制劑給予所述患者。
34.如權利要求33的方法，其中給藥方法為非腸道給藥。
35.如權利要求33的方法，其中給藥方法為長期連續給藥。
36.如權利要求33的方法，其中通過植入給藥系統給藥。
37.如權利要求33的方法，其中日給藥持續時間選自約3個月、約6個月、和約12個月。
38.如權利要求37的方法，其中日給藥通過植入給藥系統實施。
全文摘要
本發明涉及穩定的非水性單相粘性載體和采用該載體的制劑。該制劑含有至少一種均勻混懸于所述載體中的有益物質。本發明制劑可持久地在較涼至體溫的溫度范圍內貯存。該制劑可以約1－1×10
文檔編號A61K9/19GK1339962SQ00803563
公開日2002年3月13日 申請日期2000年2月2日 優先權日1999年2月8日
發明者S·A·拜瑞, P·J·費瑞拉, H·迪納德, A·姆啻尼克 申請人:阿爾薩公司