專利名稱：具有免疫調節作用的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以天然植物提取物成分作為有效藥物成分的具有免疫調節作用的藥物。
背景技術：
山葵(Wasabia japonica Matsum)又名山崳菜，為十字花科山葵屬多年生草本植物，地下莖肥大，圓柱形，皮綠色，髓部偏白，肉質堅硬，磨碎后具有揮發性芒香辣味。山葵原產日本，是一種經濟價值很高的蔬菜兼藥用植物。數百年來作為傳統的調味品辛辣料。現在已知，山葵中的葡糖異氰酸酯(Glucosinolate)及其分解產物是特殊辛辣味的來源，這是一類含硫的化合物，其共同的基本結構是一個β-D-硫葡糖基團和一個可變的側鏈(可衍生自蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和某些分支氨基酸)。其中不同的側鏈R使它們具有各自不同的特性。葡糖異硫氰酸酯存在于細胞器中，本身化學性質穩定，并無生物活性。只有當植物組織遭到損害細胞崩解時，在內源性黑芥子硫苷酸酶的作用下，水解生成葡萄糖和各種揮發性產物，異硫氰酸酯可能是其中最重要和研究最充分的分解產物。其葡糖異硫氰酸酯、異硫氰酸酯的相互轉換過程如下 Sultana，Tamanna；McNeil，David L.；Porter，Noel G.；Savage，Geoffrey P.Investigationof isothiocyanate yield from flowering and non-flowering tissues of wasabi grown in aflooded system.Journal of Food Composition and Analysis Volume16，Issue6，December，2003，pp 637-646中報道，在山葵的所有異硫氰酸酯類化合物中，烯丙基異硫氰酸酯(Allyl Isothiocyanate)的含量約為89-94％，是其中含量最高的一種成分，在葉柄、莖和根部尤為豐富。辛辣物質中另一含量較高的成分是3-丁烯基異硫氰酸酯(3-Butenyl Isothiocyanate)，其他如4-戊烯基(4-pentenyl)、異丙基(iso-propyl)、二丁基(sec-butyl)、異丁基(iso-butyl)異硫氰酸酯等僅占異硫氰酸酯總含量的1.4-3.5％。山葵各部分揮發性含硫化合物及含量如表1所示。
表1 山葵各部分揮發性含硫化合物及含量 在A.Depree，J.；M.Howard，T.；P.Savage，G.Flavour and pharmaceutical properties ofthe volatile sulphur compounds of Wasabi(Wasabia japonica)Food ResearchInternational.Volume31，Issue5，June，1998，pp329-337中，Kumagai等人也證實，山葵根部富含6-甲硫基己基(6-methylthiohexyl)和7-甲硫基庚基(7-methylthioheptyl)異硫氰酸酯，莖部6-甲硫基己基異硫氰酸酯含量較高，而葉柄部7-甲硫基庚基異硫氰酸酯含量較高，葉片中各化合物的濃度相對較低。以上化合物中，甲亞硫化物是山葵和辣根均含有的，而甲硫化物是山葵所特有的辛辣成分，其含量是辣根的200-400倍。
近來研究發現其不僅可作為食品，現已研究發現并報道，其中的主要辛辣成分——異硫氰酸酯(Isothiocyanate)更具有抗菌、抗癌、抗氧化等多種藥理作用。如，Hecht等人在Tanida N.Kawaura A.Takahashi A.Sawada K.Shimoyama T.Suppressive effect ofwasabi(pungent Japanese spice)on gastric carcinogenesis induced by MNNG in rats.[Journal Article] Nutrition & Cancer.16(1)53-8，1991.，以及黃建，孫靜在“葡糖異硫氰酸酯的生物利用率及對人體健康的意義”(《國外醫學衛生學分冊》2003，30(2).-94-97)中分別報道，苯乙基異硫氰酸酯(PEITC)、異硫氰酸芐酯(BITC)和sulforaphane等異硫氰酸酯可改變肝臟和上皮細胞中表達的I相和II相外源性致癌物相關代謝酶的平衡。異硫氰酸酯能夠阻抑I期代謝中的細胞色素P450酶，促進II期代謝中的NADPH(包括醌還原酶QR，UDP-glucronyl轉移酶)，其結果是增加致癌物質解毒和排泄，繼而減少致癌物質對DNA的損傷作用。
Watanabe M等在Watanabe M.Ohata M.Hayakawa S.Isemura M.Kumazawa S.Nakayama T.Furugori M.Kinae N.Identification of 6-methylsulfinylhexylisothiocyanate as an apoptosis-inducing component in wasabi.[Journal Article]Phytochemistry.62(5)733-9，2003 Mar.的報道中也證實，山葵乙醇提取液中的6-甲亞硫基己基異硫氰酸酯在體外可抑制單核細胞性白血病U937細胞和胃癌MKN45細胞的生長并誘導其凋亡、抑制細胞增殖。
此外，Pedras MS.Sorensen JL.Okanga FI.Zaharia IL.Wasalexins A and B，newphytoalexins from wasabiisolation，synthesis，and antifungal activity.[Journal Article]Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.9(20)3015-20，1999 Oct18.和Ono H.TesakiS.Tanabe S.Watanabe M.6-Methylsulfinylhexyl isothiocyanate and its homologues asfood-originated compounds with antibacterial activity against Escherichia coli andStaphylococcus aureus.[Journal Article]Bioscience，Biotechnology & Biochemistry.62(2)363-5.1998 Feb.等一些文獻還證實了異硫氰酸酯對大腸埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、金黃色葡萄球菌等多種細菌都能具有很強的殺菌力。
山葵還具有抗血小板聚集的作用，雖然有報道達到其二分之一的藥理效力所需的異硫氰酸酯濃度約為阿斯匹林的10倍，但其作用迅速，而阿斯匹林則需要30分鐘才能起效。Morimitsu R進一步研究證實，山葵提取液在體內外均具有明顯抗血小板聚集作用，其機理可能與6-HITC誘導谷胱甘肽轉移酶活性有關。
目前對山葵等十字花科植物的抗氧化效果已得到廣泛認同。這與其中的苯乙基異硫氰酸酯和sulforaphane密切相關。而氧化對組織器官造成的損傷在癌癥、老化及一些慢性疾病中的作用已引起關注，抗氧化劑可在一定程度延緩甚至抑制這一過程的發生。
一些文獻還報道，芐基(benzyl)和烯丙基異硫氰酸酯等含硫化合物還可具有抗哮喘的功效，及抗寄生蟲等方面的作用。

發明內容
在上述內容的基礎上，本發明將進一步提供以山葵提取物作為有效藥物成分的具有免疫調節作用的藥物。
本發明的具有免疫調節作用的藥物，以由山葵為原料提取得到的油性混合物為有效藥物成分，與藥物中允許接受的輔助成分共同組成。其中，優選的是將其制備成為口服制劑型的藥物。
希望本發明藥物有效藥物成分的山葵提取物成分，可以采用目前文獻中已有報道的方法由山葵原料中提取得到。作為具體實例，也可以采用本發明提供的方法制備。
制備方法之一將山葵頭粉200克與水1700毫升加入圓底燒瓶混合，加熱并保持沸騰狀態約1小時，減壓過濾，得黃綠色懸濁液，有辛辣刺激味。將該油狀物質濃縮成較為粘稠的油狀液，必要時可再作過濾處理，即成為本發明所說的可作為有效藥物成分使用的油性混合物提取成分。
制備方法之二將山葵粉25克加入乙酸乙酯250毫升進行加熱回流萃取，得翠綠色混合液，有酯的香味。冷卻過濾得翠綠色濾液。以分餾方式分離回收乙酸乙酯，即得到本發明所說的可作為有效藥物成分使用的油性混合物提取成分。必要時可再加入乙酸乙酯作同樣處理，進行純化精制。
以上述得到的山葵油性混合物提取成分作為試驗藥物進行了下述對免疫調節作用影響的試驗。
一、體外免疫調節的作用1.刺激小鼠巨噬細胞Ana-1產生NO的試驗。
上述試驗藥物能夠刺激小鼠巨噬細胞Ana-1產生NO(一氧化氮)，不同濃度山葵提取物試驗藥物刺激Ana-1產生NO能力不同，高濃度(C1組5mg生藥/ml)大于中濃度(C2組0.5mg生藥/ml)，大于低濃度(C3組0.05mg生藥/ml)；C1濃度組刺激能力最強，隨濃度降低刺能力下降，C3濃度組生長曲線趨于正常對照。不同濃度的山葵提取物刺激小鼠巨噬細胞Ana-1不同時間培養上清液中NO的OD值比較結果如圖1所示。
2.刺激小鼠巨噬細胞Ana-1產生IL-12(白細胞介素-12)的試驗。
上述試驗藥物能夠刺激小鼠巨噬細胞Ana-1產生IL-12，不同濃度山葵提取物試驗藥物刺激Ana-1產生IL-12能力不同，高濃度(C1組5mg生藥/ml)大于中濃度(C2組0.5mg生藥/ml)。低濃度(C3組0.05mg生藥/ml)無作用。不同濃度的山葵提取物試驗藥物刺激小鼠巨噬細胞Ana-1不同時間培養上清液中IL-12的OD值比較結果如圖2所示。
3.刺激小鼠巨噬細胞Ana-1產生TNF-α(腫瘤壞死因子-α)的試驗。
山葵提取物試驗藥物能夠刺激小鼠巨噬細胞Ana-1產生TNF-α，不同濃度山葵提取物試驗藥物刺激Ana-1產生IL-12能力不同，高濃度(C15mg生藥/ml)大于中濃度(C20.5mg生藥/ml)。低濃度(C3 0.05mg)生藥/ml)無作用。不同濃度的山葵提取物試驗藥物刺激小鼠巨噬細胞Ana-1不同時間培養上清液中TNF的OD值比較結果如圖3所示。
二、體內免疫調節作用試驗。
采用博萊霉素建立肺纖維化大鼠動物模型，研究本發明的山葵提取物試驗藥物對肺部炎癥的調節作用。本發明山葵提取物試驗藥物與空白對照組對肺組織INF-γ(γ-干擾素)，IL-2(白細胞介素-2)及IL-12的表達的對比試驗結果照片分別如圖4、圖5和圖6所示。各圖中的照片A分別均為空白對照組，照片B分別為本發明山葵提取物試驗藥物。各組照片B中的深色顯示部分分別表明有INF-γ(γ-干擾素)、IL-2(白細胞介素-2)及IL-12(白細胞介素-12)的表達。由于INF-γ、IL-2及IL-12為參與免疫功能的細胞因子，因此該免疫組織化學結果的試驗顯示本發明山葵提取物具有顯著的體內免疫調節作用和功能。
以該提取物成分為有效藥物成分，與藥物中允許接受的其它輔助添加成分，例如與口服制劑中可以被接受的崩解劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑等常用的輔助添加成份混合后，按相應的常規工藝方法處理，即可制成為如片劑、丸劑、膠囊劑等固體型口服藥物制劑。或是與常用的增溶劑、乳化劑、潤濕劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩定劑、矯味劑、增稠劑等混合，按相應的常規工藝方法處理，即可制成為水劑、糖漿等液體制劑形式的口服藥物。由于這些制劑的方式均屬于目前的成熟技術，無需過多贅述。


圖1是不同濃度的山葵提取物試驗藥物刺激小鼠巨噬細胞Ana-1不同時間培養上清液中NO的OD值比較結果圖2是不同濃度的山葵提取物試驗藥物刺激小鼠巨噬細胞Ana-1不同時間培養上清液中IL-12的OD值比較結果。
圖3是不同濃度的山葵提取物試驗藥物刺激小鼠巨噬細胞Ana-1不同時間培養上清液中TNF的OD值比較結果。
圖4是發明山葵提取物試驗藥物增加肺組織INF-γ表達的對比試驗結果。
圖5是發明山葵提取物試驗藥物增加肺組織IL-2表達的對比試驗結果。
圖6是發明山葵提取物試驗藥物增加肺組織IL-12表達的對比試驗結果。
權利要求
1.具有免疫調節作用的藥物，其特征是以由山葵為原料提取得到的油性混合物為有效藥物成分，與藥物中允許接受的輔助成分共同組成。
2.如權利要求1所述的具有免疫調節作用的藥物，其特征是該藥物為口服制劑型藥物。
全文摘要
本發明為一種具有免疫調節作用的藥物，以由山葵為原料提取得到的油性混合物為有效藥物成分，與藥物中允許接受的輔助成分共同組成。
文檔編號A61P37/02GK1593578SQ20041004020
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月13日 優先權日2004年7月13日
發明者黃素清, 李為民 申請人:臺青(四川)食品有限公司