專利名稱：減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗后處理方法
技術領域：
本發明涉及減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗的后處理方法，屬于醫學生物
背景技術：
脊髓灰質炎是由脊髓灰質炎病毒I、II、III型引起的傳播廣泛且危害極大的急性傳染病。臨床癥狀引起肌肉特別是肢體松弛性麻痹，多發生于小兒，因此又稱為“小兒麻痹癥”。在疫苗問世前，該病在全世界范圍內流行，當時我國的發病率為3.18/10萬。50年代中后期，美國的兩位科學家Dr.Salk和Dr.Sabin先后成功研制出脊髓灰質炎滅活疫苗(IPV)和口服脊髓灰質炎減毒活疫苗(OPV)，從而為人類預防和消滅脊髓灰質炎提供了有力武器。實踐證明這兩種疫苗都是安全有效的。我國從1960年開始生產OPV供全國兒童服用。到目前為止總計供應了40多億人份的三價OPV，取得了輝煌的成績。然而，早期制造的IPV由于受到生產工藝的限制，抗原含量低，免疫效果不理想，尤其是隨著全世界消滅脊髓灰質炎進程的推進，與OPV相關的病例(VAPP)和由疫苗衍生的脊髓灰質炎病毒(VDPV)而引起的病例正受到人們的關注，如2000年在多美尼加和海地，2001年在菲律賓以及2002年在馬達加斯加發生的疫苗衍生株引起的麻痺病例，此外疫苗病毒毒株在免疫缺陷的人體內可長期存在，。為此，一些發達國家開始改變疫苗使用方案，采取先用IPV再用OPV的方案，進而過渡到僅使用IPV的方案，因為只有使用IPV才能避免疫苗相關病例的發生。但采用常規的方法，既不能滿足大規模生產的需要，也不能處理大規模生產的病毒液，因此，有必要對現有技術加以改進。

發明內容
本發明的目的在于提供一種能處理大規模生產的病毒液，制備出高質量的疫苗，滿足減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗生產需要的方法。
本發明通過下列技術方案實現一種減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗后處理方法，其特征在于采用下列工藝步驟
1、澄清將大規模培養出來的病毒液經過1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔徑的三級濾柱過濾、澄清，去除病毒液中的細胞碎片及雜質，并保持病毒液的無菌狀態；2、濃縮將澄清過的病毒液，用10萬截留分子量的超濾膜將病毒液濃縮200～400倍。
3、純化a、凝膠過濾濃縮的病毒液用層析柱純化，即用80mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液pH7.0-7.2，紫外吸收波長280測吸收值，收集第一峰即為凝膠過濾純化的病毒液；B、離子交換凝膠過濾純化的病毒液用層析柱純化，即用80mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液pH7.0-7.2，紫外吸收波長280測吸收值，收集第一峰即為純化的病毒液；4、除菌過濾純化的病毒液用0.22μm的濾膜除菌過濾，之后加入10倍濃縮M199，使病毒液中含有原倍的M199；5、滅活在過濾的病毒液中，按終濃度為1/4000加入福爾馬林滅活劑，在35-37℃溫度下滅活12-14天，每天取樣觀察，滅活至第6天時，將病毒液用0.22μm濾膜過濾至另一無菌瓶中，繼續滅活至12-14天，轉入4℃保存，即為單價半成品。
病毒液在經過步驟3的純化后，去除了細胞DNA及雜蛋白，使純度達到要求。
本發明具有以下優點1、可大規模處理大量的病毒液，能夠滿足減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗的生產需求，且生產工藝穩定，重復性好(結果見表1、表2)。
2、用本發明生產的疫苗半成品，無外原因子污染，細胞DNA殘留量少，滅活后的半成品經檢查無活病毒存在，安全性好，半成品抗原含量高，能夠滿足成品生產的需要(結果見表3)。
3、用本發明生產的疫苗半成品制備的Sabin IPV成品疫苗，質量穩定可靠，安全性及免疫原性良好，經檢定全部符合國家生物制品規程的要求(結果見表4)。
4、用本發明生產病毒液制備的疫苗，經25℃和37℃放置兩周，以及4℃長期存放后，檢測疫苗熱穩定性，結果表明該疫苗穩定性良好，其有效期可達兩年以上(結果見表5及表6)。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例11、澄清將550升發酵罐培養的病毒液350升，經孔徑為0.75μm、0.45μm、0.22μm的三級濾柱過濾澄清，去除病毒液中的細胞碎片及雜質，并保持病毒液的無菌狀態；2、濃縮將澄清的病毒液在Millipore交叉流超濾設備中，用10萬截留分子量的超濾膜濃縮至1.4升；3、純化A、凝膠過濾在Phamacia Index70層析柱中，裝Sepharose CL-6B層析填料，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)沖平，取病毒濃縮液，加入層析柱中，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗脫，紫外吸收波長280測吸收值，收集第一峰(病毒峰)約600毫升；B、離子交換在Phamacia Index100層析柱中，裝入DEAE SephasoreFast Flow層析填料，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)沖平，將凝膠過濾收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗脫，紫外吸收波長280測吸收值，收集出現的洗脫峰約800毫升，即為純化的病毒液，層析柱用1mol/L NaCl洗脫，之后用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)沖平備用；4、除菌過濾先將0.22μm的濾膜用50毫升10倍濃縮M199沖洗，濾液收集至一硅化的無菌1000毫升瓶中，再將離子交換收集的800毫升病毒液過濾到此瓶中，之后用40毫升10倍濃縮的M199及10毫升注射水洗膜，并將濾液同樣收集到上述瓶中；5、滅活在過濾的病毒液900毫升中，加入10％福爾馬林2.25毫升，使福爾馬林終濃度為1/4000，放入37℃孵箱中滅活，每天取樣觀察，滅活至第6天時，將病毒液用0.22μm濾膜過濾至另一無菌已硅化1000毫升瓶中，繼續滅活至12天，轉入4℃保存，即為單價半成品。
實施例21、澄清將550升發酵罐培養的病毒液350升，經孔徑為1.0μm、0.6μm、0.45μm的三級濾柱過濾澄清，去除病毒液中的細胞碎片及雜質，并保持病毒液的無菌狀態；2、濃縮將澄清的病毒液在Millipore交叉流超濾設備中，用10萬截留分子量的超濾膜濃縮至1.4升；3、純化A、凝膠過濾在Phamacia Index70層析柱中，裝Sepharose CL-6B層析填料，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)沖平，取病毒濃縮液，加入層析柱中，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗脫，紫外吸收波長280測吸收值，收集第一峰(病毒峰)約600毫升；B、離子交換在Phamacia Index100層析柱中，裝入DEAE SephasoreFast Flow層析填料，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)沖平，將凝膠過濾收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗脫，紫外吸收波長280測吸收值，收集出現的洗脫峰約800毫升，即為純化的病毒液，層析柱用1mol/L NaCl洗脫，之后用80mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)沖平備用；4、除菌過濾先將0.22μm的濾膜用50毫升10倍濃縮M199沖洗，濾液收集至一硅化的無菌1000毫升瓶中，再將離子交換收集的800毫升病毒液過濾到此瓶中，之后用40毫升10倍濃縮的M199及10毫升注射水洗膜，并將濾液同樣收集到上述瓶中；5、滅活在過濾的病毒液900毫升中，加入10％福爾馬林2.25毫升，使福爾馬林終濃度為1/4000，放入35℃孵箱中滅活，每天取樣觀察，滅活至第6天時，將病毒液用0.22μm濾膜過濾至另一無菌已硅化1000毫升瓶中，繼續滅活至14天，轉入4℃保存，即為單價半成品。
用與實施例1相同的方法進行了九批生產規模的后處理，結果見表5和表6。
表1.九批生產規模澄清及濃縮結果0.1病毒收獲液1.1澄清2.1濃縮批號 體 滴度體滴度體積滴度積 (logCCID50積 (logCCID50(L) (logCCID5SI 350 8.400 360 8.250 1.60 10.400SI 300 7.850 340 7.800 1.65 9.850SI 380 8.380 410 8.130 0.90 10.590SI 353 8.000 404 7.875 1.40 10.000SI 352 7.750 393 8.625 2.10 10.380SI 352 8.620 399 8.370 1.15 10.870SI 358 7.625 409 7.500 1.40 9.500SI 356 7.870 411 8.120 1.40 10.120SI 332 7.875 375 7.750 1.75 9.875表2.九批生產規模純化及除菌過濾結果3.1凝膠過濾4.1離子交換5.1除菌過濾批號 體 滴度體 滴度 體積 滴度積 (logCCID50積 (logCCID50(L) (logCCID5SI 0.62 9.250 0.829.250 0.90 9.125SI 0.61 9.625 0.839.625 0.90 9.500SI 0.62 9.625 0.839.500 0.90 9.500SI 0.62 8.375 0.828.250 0.90 8.250SI 0.62 8.250 0.828.250 0.90 8.000SI 0.65 8.250 0.818.250 0.90 8.125SI 0.62 9.500 0.839.125 0.90 9.125SI 0.63 9.250 0.858.875 0.90 8.500SI 0.62 9.000 0.828.500 0.90 8.125
表3.六批疫苗半成品檢定結果

表4.兩批Sabin IPV成品檢定結果項目SI 20021101 SI 20021201外觀 橙紅色透明液體 橙紅色透明液體無菌試驗陰性 陰性鑒別試驗 Polio I+II+III Polio I+II+IIIDAg含量I30 II32 III45 I30 II32大白鼠效力試驗 通過 通過異常毒性試驗 通過 通過蛋白質含量 ＜10μg/劑量 ＜10μg/劑量牛血清蛋白殘留量 ＜50ng/劑量＜50ng/劑量pH 7.13 7.13
表5 減毒株IPV25℃和37℃和熱穩定性試驗結果(D抗原回收率％*)批號 型別25℃3周37℃1周37℃2周SI001001 I95 90 75SI002001 II 100 100100SI003001 III 100 95 86SI001002 I85 80 53SI002001 II 100 100100SI003002 III 93 93 71*4℃DAg含量作為100％表6 減毒株IPV4℃穩定性試驗結果DAgU/劑量 大白鼠效力試驗(ED50)型別0月 12月 18月 24月0月 18月I20 20 18 18 2.19 2.08II 16 16 16 16 1.49 1.12III 30 30 30 28 1.82 1.6權利要求
1.一種減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗后處理方法，其特征在于采用下列工藝步驟1)、澄清將大規模培養出來的病毒液經過1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔徑的三級濾柱過濾、澄清，去除病毒液中的細胞碎片及雜質，并保持病毒液的無菌狀態；2)、濃縮將澄清過的病毒液，用10萬截留分子量的超濾膜將病毒液濃縮200～400倍。3)、純化a、凝膠過濾濃縮的病毒液用層析柱純化，即用80mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液pH7.0-7.2，紫外吸收波長280測吸收值，收集第一峰即為凝膠過濾純化的病毒液；B、離子交換凝膠過濾純化的病毒液用層析柱純化，即用80mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液pH7.0-7.2，紫外吸收波長280測吸收值，收集第一峰即為純化的病毒液；4)、除菌過濾純化的病毒液用0.22μm的濾膜除菌過濾，之后加入10倍濃縮M199，使病毒液中含有原倍的M199；5)、滅活在過濾的病毒液中，按終濃度為1/4000加入福爾馬林滅活劑，在35-37℃溫度下滅活12-14天，每天取樣觀察，滅活至第6天時，將病毒液用0.22μm濾膜過濾至另一無菌瓶中，繼續滅活至12-14天，轉入4℃保存，即為單價半成品。
全文摘要
本發明提供一種減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗后處理方法，它將大規模培養出來的病毒液經過1.0－0.6μm、0.6－0.45μm、0.45－0.22μm孔徑的三級濾柱過濾、澄清，超濾濃縮，柱層析純化及滅活等后處理工藝，將病毒液制備成純度高、免疫原性及安全好、質量穩定的合格疫苗半成品，從而滿足減毒株脊髓灰質炎滅活疫苗的生產需要。本發明可大規模處理大量的病毒液，且生產工藝穩定，重復性好；用本發明生產的疫苗半成品，無外原因子污染，細胞DNA殘留量少，滅活后的半成品經檢查無活病毒存在，安全可靠，半成品抗原含量高，能夠滿足成品生產的需要；用本發明生產的疫苗半成品制備成Sabin IPV成品疫苗，其質量穩定，安全性及免疫原性良好，經檢定全部符合國家生物制品規程的要求。
文檔編號A61P31/14GK1616095SQ200410040720
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月16日 優先權日2004年9月16日
發明者褚嘉祐, 姜述德, 孫明波, 廖國陽, 張麗旌, 李衛東, 俞泳霆, 李平忠 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所