專利名稱：結(jié)核轉(zhuǎn)基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)預(yù)防學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及利用卡介苗作為載體，采用自殺載體和整合載體介導(dǎo)的方式將外源基因esat-6和/或cfp10導(dǎo)入卡介苗基因組中，制備了轉(zhuǎn)基因疫苗，命名為轉(zhuǎn)基因卡介苗，可用于結(jié)核病的預(yù)防。
背景技術(shù)：
結(jié)核病作為一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。近年來(lái)，隨著人口流動(dòng)增加、艾滋病的流行和耐多種藥物的結(jié)核出現(xiàn)，全球結(jié)核病疫情出現(xiàn)回升，引起了國(guó)際社會(huì)的高度重視，世界衛(wèi)生組織已將結(jié)核病作為重點(diǎn)控制的傳染病之一，并宣布全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)。目前全世界已有19億人感染結(jié)核桿菌，每年新增結(jié)核病例1000萬(wàn)例，死亡300萬(wàn)，居各種傳染病死亡人數(shù)之首，并且由于結(jié)核病多重耐藥現(xiàn)象十分突出，治療困難逐漸顯現(xiàn)。據(jù)2000年第四次全國(guó)流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者約450萬(wàn)，其他結(jié)核病，如腎結(jié)核、骨結(jié)核、皮膚結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎等尚未納入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，初步估計(jì)有4～5億人已受過(guò)結(jié)核桿菌感染。因此，我國(guó)結(jié)核病的防治任務(wù)尤其緊迫。降低結(jié)核病發(fā)病率及死亡率的關(guān)鍵是安全、高效的結(jié)核疫苗的應(yīng)用。
自從1921年以來(lái)，卡介苗一直廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的預(yù)防，但其對(duì)結(jié)核病的預(yù)防作用十分有限，在不同地區(qū)其免疫保護(hù)作用差異很大，效果不穩(wěn)定，給艾滋病等免疫功能受損的患者接種后還可能導(dǎo)致嚴(yán)重的播散性結(jié)核病。雖然卡介苗存在缺點(diǎn)，但仍具有許多其它疫苗無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)首先，卡介苗是目前世界上應(yīng)用最廣泛的疫苗，至今已接種了超過(guò)30億人；其次，卡介苗在嬰兒出生后即可接種，且不受來(lái)自母體的抗體的影響，是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的兩種出生時(shí)即可接種的活疫苗之一；第三，卡介苗本身是一種極強(qiáng)的免疫佐劑，具有增強(qiáng)人體免疫功能的作用；第四，卡介苗培養(yǎng)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、便于保存；第五，卡介苗是一種減毒多價(jià)活疫苗，它可以克服亞單位疫苗和DNA疫苗成分單一的缺點(diǎn)。而且，近年來(lái)卡介苗作為腫瘤基因治療和傳染病疫苗載體的研究也取得了重要成果。因此，利用基因工程的方法增強(qiáng)其保護(hù)效果，并去除毒力，使其成為安全、高效的新一代結(jié)核疫苗，這是新形勢(shì)下我國(guó)控制結(jié)核病的正確策略，對(duì)于結(jié)核病的預(yù)防具有十分重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
1998年，英國(guó)Sanger中心和法國(guó)Pasteur研究所科學(xué)家合作完成了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的全基因組測(cè)序工作，從而徹底改變了長(zhǎng)期困擾著人們的結(jié)核分枝桿菌遺傳背景不清的傳統(tǒng)觀念，為對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行高水平高層次的研究提供了很好的機(jī)遇。現(xiàn)階段預(yù)防結(jié)核病的新型疫苗研究主要有蛋白質(zhì)亞單位疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗和重組卡介苗，綜合分析各項(xiàng)研究結(jié)果表明，前三者疫苗免疫保護(hù)效果均不及卡介苗，而利用穿梭質(zhì)粒構(gòu)建的重組卡介苗，其缺點(diǎn)在無(wú)抗生素篩選時(shí)不能長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。
esat-6基因是由Anderson等首先發(fā)現(xiàn)的，他們從結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)液中分離純化出6kDa的分泌型蛋白，命名為esat-6，首次對(duì)esat-6基因進(jìn)行了克隆和DNA序列測(cè)定，表明該編碼95個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)能引起強(qiáng)烈的抗結(jié)核記憶性T細(xì)胞應(yīng)答。Berthet等將esat-6上游34bp處的一個(gè)基因命名為lhp(L45homologous protein)，與esat-6的方向是相同的，位于同一個(gè)超縱子內(nèi)，共同轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白為CFP10，故該基因又名cfp10。Harboe等從基因和蛋白表達(dá)的水平對(duì)卡介苗和結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明esat-6和cfp10基因普遍存在于人型和牛型結(jié)核分枝桿菌中，而不存在于卡介苗和其他環(huán)境分枝桿菌中，他們還通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了esat-6蛋白多肽鏈中含多個(gè)B淋巴細(xì)胞特異性識(shí)別表位。此后，Ravin和Skjot等研究表明，ESAT-6蛋白多肽鏈中還存在多個(gè)T淋巴細(xì)胞特異性識(shí)別表位，而CFP10表現(xiàn)出與ESAT-6相當(dāng)?shù)膹?qiáng)的T細(xì)胞性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)的IFN-γ的釋放水平與ESAT-6相當(dāng)。近來(lái)人們又將上述基因通過(guò)穿梭載體轉(zhuǎn)入卡介苗中，發(fā)現(xiàn)重組卡介苗的毒力沒有改變，而免疫原性增加了。綜合以上研究結(jié)果，表明esat-6和cfp10基因都是卡介苗體外傳代培養(yǎng)過(guò)程中丟失了的具有重要免疫保護(hù)作用的抗原基因。
基因打靶(Gene Targeting)又叫基因同源重組(HomologousRecombination)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，也是研究基因功能最直接最有效的手段之一。早在1990年，Husson等就用基因定點(diǎn)同源重組技術(shù)對(duì)分枝桿菌進(jìn)行分子遺傳學(xué)操作，成功地將麻風(fēng)分枝桿菌65kDa的熱休克蛋白編碼基因?qū)霅u垢分枝桿菌基因組DNA中進(jìn)行表達(dá)。Mederle等把猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的基因nef和gag整合到卡介苗基因組，與多拷貝質(zhì)粒表達(dá)外源基因相比，克服了染色體外質(zhì)粒易丟失的缺點(diǎn)，即使在染色體上是單拷貝，表達(dá)水平和介導(dǎo)細(xì)胞免疫的程度，也絲毫不遜色，從而為我們采用基因定點(diǎn)同源重組技術(shù)改造卡介苗提供了科學(xué)依據(jù)。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法把重組基因轉(zhuǎn)移給動(dòng)物、植物和微生物并使之表達(dá)、穩(wěn)定地傳給后代。Gordon等1980年首次將外源基因通過(guò)顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵原核中，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。此后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)就用在了動(dòng)物、植物和微生物的改造中，在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也十分廣泛，比如轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗、遺傳病的治療、惡性腫瘤的治療、傳染病的治療和藥用蛋白的生產(chǎn)等。隨著同源重組技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在微生物中的研究也是目前研究的熱點(diǎn)之一。也為本發(fā)明的研究技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的構(gòu)思是利用傳統(tǒng)卡介苗的種種優(yōu)點(diǎn)，將其缺失的esat-6和cfp10基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)表達(dá)，在不改變其毒力的基礎(chǔ)上增加其免疫原性和免疫保護(hù)性，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，克服穿梭載體表達(dá)外源基因不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，制備了轉(zhuǎn)基因卡介苗，達(dá)到了優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗的效果，可用于結(jié)核病的預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面，通過(guò)基因工程手段，將卡介苗缺失的基因esat-6和cfp10從結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組中擴(kuò)增出來(lái)，裝載在合適的載體中，將其轉(zhuǎn)化入宿主菌，表達(dá)并純化相應(yīng)的蛋白，制備抗體。
本發(fā)明另一方面，以卡介苗基因組為模板，擴(kuò)增α-Ag信號(hào)肽序列，插入T-Vector中，轉(zhuǎn)化宿主菌，備用。
本發(fā)明的又一方面，采用重疊延伸剪接技術(shù)，將α-Ag信號(hào)肽序列分別與esat-6和cfp10連接，通過(guò)自殺載體或整合載體，轉(zhuǎn)入卡介苗基因組中。
本發(fā)明的再一方面，將esat-6和cfp10的融合基因通過(guò)自殺載體或整合載體，轉(zhuǎn)入卡介苗基因組中。
將上述制備的轉(zhuǎn)基因疫苗進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其毒性、免疫原性和免疫保護(hù)性，用于結(jié)核病的預(yù)防。
具體實(shí)施例方式
1)以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組為模板，設(shè)計(jì)esat-6和cfp10基因引物，并加上合適的酶切位點(diǎn)，克隆esat-6和cfp10基因。
2)通過(guò)基因工程手段，將esat-6和cfp10基因轉(zhuǎn)入合適載體，并將其轉(zhuǎn)化宿主菌，如大腸桿菌，測(cè)序證實(shí)序列正確后，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，純化目的蛋白，制備相應(yīng)的抗體。
3)以卡介苗基因組為模板，擴(kuò)增α-Ag信號(hào)肽序列，插入T-Vector中，轉(zhuǎn)化宿主菌，提取質(zhì)粒備用。
4)采用重疊延伸剪接技術(shù)(splicing by overlap extension，SOE)，將α-Ag信號(hào)肽序列分別與esat-6和cfp10連接，通過(guò)自殺載體或整合載體，轉(zhuǎn)入卡介苗基因組中，應(yīng)用PCR、Southern blot、Northern blot、Western blot和ELISA等方法檢測(cè)外源基因的定點(diǎn)轉(zhuǎn)入和表達(dá)情況。
5)采用重疊延伸剪接技術(shù)(splicing by overlap extension，SOE)，將esat-6與cfp10連接，并將融合基因通過(guò)自殺載體或整合載體，轉(zhuǎn)入卡介苗基因組中，同樣用上述方法檢測(cè)外源基因的定點(diǎn)轉(zhuǎn)入和表達(dá)情況。
6)轉(zhuǎn)基因卡介苗的毒力檢測(cè)以豚鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將豚鼠隨機(jī)分成兩組，一組注射轉(zhuǎn)基因卡介苗，另一組注射傳統(tǒng)卡介苗作為對(duì)照，觀察豚鼠的成活時(shí)間。將轉(zhuǎn)基因卡介苗加入體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因卡介苗侵入巨噬細(xì)胞的能力及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。
7)轉(zhuǎn)基因卡介苗的體液免疫反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因卡介苗體外培養(yǎng)至OD600達(dá)1-1.5，收集菌體用于免疫動(dòng)物，以BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將小鼠隨機(jī)分成三組，第一組注射生理鹽水，第二組注射傳統(tǒng)卡介苗，第三組注射轉(zhuǎn)基因卡介苗，4周后小鼠斷尾取血，用PPD作為已知抗原通過(guò)ELISA檢測(cè)小鼠體內(nèi)的特異性抗體水平。
8)轉(zhuǎn)基因卡介苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)仍以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按上述方法免疫接種，末次免疫6-16周后，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，然后加入PPD刺激，用3H-TdR摻入法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖程度，進(jìn)一步可作IFN-γ，IL-2等細(xì)胞因子含量測(cè)定。
9)轉(zhuǎn)基因卡介苗動(dòng)物免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)以BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，仍按上述方法免疫接種，末次免疫4周后，通過(guò)霧化吸入或腹腔注射結(jié)核桿菌H37Rv株進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，4周后取肺、肝、脾等臟器組織作鏡檢，觀察組織有無(wú)病變及其病變程度，病變組織進(jìn)一步作結(jié)核桿菌培養(yǎng)，以檢測(cè)病變組織的含菌量，并將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較。
實(shí)施例實(shí)施例1基因克隆及蛋白表達(dá)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv接種Sauton液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)28天收集細(xì)菌，1×TE(10mmol/L Tris.HCl，lmmol/L EDTA，pH8.0)重懸細(xì)菌后置100℃水浴煮沸30分鐘滅活，將滅活的菌體置潔凈研磨器中進(jìn)行適當(dāng)研磨，將研磨后的菌液轉(zhuǎn)入EP管中，加溶菌酶(50mg/ml)使其終濃度為5μg/ml，37℃水浴放置8小時(shí)，然后加入蛋白酶K(20mg/ml)至終濃度為100μg/ml，并加入10％的SDS使其終濃度為4.0％，37℃孵育過(guò)夜，次日以12000轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入另一潔凈EP管中，加等體積酚∶氯仿(1∶1)混勻，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清加入RNase至終濃度為20μg/ml，37℃孵育1小時(shí)，再用酚∶氯仿抽提1次，上清轉(zhuǎn)入另一潔凈EP管中，加入2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)，4℃以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌2次，真空干燥后，溶于50μl 1×TE，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 根據(jù)GenBank上公布的esat-6和cfp10基因序列，設(shè)計(jì)引物，引物的兩端分別加上BamH I和EcoR I的酶切位點(diǎn)，以上述提取的基因組為模板，PCR擴(kuò)增后純化，再用BamH I和EcoR I酶切，同時(shí)酶切融合表達(dá)載體pGEX-1λT(Invitrogen公司)，將目的基因重組到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再用GST融合蛋白專用純化試劑盒(Bulk and RediPack GST Purification Modules，Amersham Biosciences)純化，凍干，得到目的蛋白。
實(shí)施例2esat-6轉(zhuǎn)基因卡介苗的制備根據(jù)卡介苗基因組α-Ag信號(hào)肽、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組esat-6基因前后序列設(shè)計(jì)引物，引物兩端加上合適的酶切位點(diǎn)，以卡介苗基因組為模板，分別擴(kuò)增卡介苗α-Ag信號(hào)肽和hsp60下游3kb片段、以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組為模板，擴(kuò)增esat-6基因。
利用重疊延伸剪接術(shù)(splicing by overlap extension，SOE)，將卡介苗α-Ag信號(hào)肽序列與esat-6分別連接起來(lái)，同時(shí)通過(guò)反向PCR的方法，將卡介苗hsp60下游3kb片段從中分開，并加上合適的酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后，其間插入卡介苗α-Ag信號(hào)肽-esat-6基因，將該基因片段插入自殺載體p2NIL，再插入來(lái)源于pGOAL的含有標(biāo)志基因(hygromycin，Ag85-LacZ，Phsp60-sacB)的插入片斷(Marker genecassette)，構(gòu)建用于基因打靶(基因重組)的載體。
以電穿孔法將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)入卡介苗中，用潮霉素選擇培養(yǎng)基進(jìn)行第一步篩選，所得陽(yáng)性克隆再用蔗糖選擇培養(yǎng)基進(jìn)行第二步篩選，再用酶切、PCR和Southern blot進(jìn)一步證實(shí)，陽(yáng)性克隆即為轉(zhuǎn)基因卡介苗。經(jīng)熱休克誘導(dǎo)后，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)基因卡介苗能高效表達(dá)esat-6基因編碼產(chǎn)物。
實(shí)施列3轉(zhuǎn)基因卡介苗動(dòng)物免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)1、動(dòng)物免疫取BALB/c小鼠36只，隨機(jī)分為3組，每組12只。第一組為空白對(duì)照組，每只小鼠于后背部皮下注射生理鹽水100μl；第二組為卡介苗組，每只鼠皮下注射卡介苗100μl(106CFU)；第三組為轉(zhuǎn)基因卡介苗組，每只鼠皮下注射轉(zhuǎn)基因卡介苗100μl(106CFU)。
2、攻擊試驗(yàn)疫苗接種8周后，各組行結(jié)核分枝桿菌H37Rv株攻擊，即腹膜內(nèi)注射100μl菌液(105CFU)。
3、脾重量指數(shù)及臟器活菌計(jì)數(shù)在結(jié)核分枝桿菌攻擊后第4、8周時(shí)，每組取3只小鼠斷頸致死，無(wú)菌操作下，解剖后肉眼觀察肺、脾、肝變化，脾稱重，將右肺和脾置于5ml含0.05％吐溫80的PBS中，剪碎后勻漿，取50μl勻漿液分別稀釋5倍、10倍、20倍后，取100μl涂布于Sauton平板上(其中卡介苗、轉(zhuǎn)基因卡介苗的平板中加入2μg/ml thiophene carboxamic hydrazide以抑制殘存卡介苗的生長(zhǎng))，37℃培養(yǎng)3-4周，計(jì)數(shù)菌落。結(jié)果接種轉(zhuǎn)基因卡介苗組脾重量低于卡介苗組，肺脾含菌量轉(zhuǎn)基因組也低于卡介苗組，實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性。
4、肺部病理改變?cè)诠艉蟮?、8周時(shí)，每組取3只小鼠處死，取左肺于10％甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因卡介苗組肺組織病變也輕于卡介苗組和陰性對(duì)照組，證明轉(zhuǎn)基因卡介苗具有抗結(jié)核的保護(hù)作用，但其效力較之傳統(tǒng)卡介苗有提高。
權(quán)利要求
1.結(jié)核轉(zhuǎn)基因疫苗，其特征在于，以卡介苗作為載體，將外源基因轉(zhuǎn)入卡介苗基因組內(nèi)制備結(jié)核疫苗，可用于預(yù)防結(jié)核病。
2.如權(quán)利要求1所述的新型疫苗，以卡介苗為載體，命名為轉(zhuǎn)基因卡介苗。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因疫苗，其特征在于，作為載體的卡介苗基因組中導(dǎo)入編碼分泌蛋白ESAT-6和CFP10的多核苷酸或與之互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)入卡介苗基因組的分泌蛋白編碼基因可以是單獨(dú)的esat-6或cfp10，也可以是二者連在一起的融合基因。
5.如權(quán)利要求3所述的分泌蛋白編碼基因可以是單獨(dú)的esat-6或其前端連接促分泌的修飾基因(如α-Ag信號(hào)肽序列等)。
6.如權(quán)利要求3所述的分泌蛋白編碼基因可以是單獨(dú)的cfp10或其前端連接促分泌的修飾基因(如α-Ag信號(hào)肽序列等)。
7.如權(quán)利要求4所述的融合基因可以是esat-6在前，也可以是cfp10在前，二者的前端也可加促分泌的修飾基因(如α-Ag信號(hào)肽序列等)。
8.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因疫苗，可由特殊的自殺載體(如p2NIL等)通過(guò)同源重組技術(shù)定點(diǎn)整合入卡介苗的基因組中。
9.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因疫苗，可由特殊的整合載體(如pMV361等)通過(guò)整合酶的作用定點(diǎn)整合入卡介苗的基因組中。
全文摘要
結(jié)核轉(zhuǎn)基因疫苗及其制備方法屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種用于結(jié)核病預(yù)防的轉(zhuǎn)基因疫苗及其制備方法。本發(fā)明用于結(jié)核病預(yù)防的轉(zhuǎn)基因疫苗是在卡介苗的基礎(chǔ)上，利用特殊載體，采用定點(diǎn)同源重組技術(shù)和整合酶定點(diǎn)插入技術(shù)將外源基因片段esat－6和cfp10插入卡介苗基因組中，命名為轉(zhuǎn)基因卡介苗，該方法在不改變卡介苗毒力的情況下增加了免疫原性和免疫保護(hù)性，同時(shí)克服了利用穿梭載體表達(dá)外源基因容易丟失的缺點(diǎn)，作用優(yōu)于傳統(tǒng)的卡介苗，可用于結(jié)核病的預(yù)防。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1748796SQ20041004068
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者鮑朗, 趙明才 申請(qǐng)人:四川大學(xué)