專利名稱：一種腫瘤細胞疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤細胞疫苗的制備方法，具體的講，它涉及一種對細胞進行轉基因并結合加熱處理來制備腫瘤細胞疫苗的方法。
背景技術：
近年來，腫瘤細胞疫苗的發展為腫瘤的治療帶來了希望。目前用來制備腫瘤細胞疫苗的細胞主要有腫瘤細胞和抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells，APC)兩種，所采用的方法通常有以下幾種1.直接將死亡的全腫瘤細胞或者腫瘤細胞溶解物作為腫瘤疫苗；2.將進行了基因修飾的APC(一般是DC)作為腫瘤疫苗；3.將抗原提呈細胞尤其是樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)與腫瘤細胞進行融合形成雜交細胞，以雜交細胞的提取物作為腫瘤疫苗(一種腫瘤免疫治療及預防性疫苗的組成、制備、應用方案，申請號02153446.2)；4.將進行了基因修飾的腫瘤細胞經過處理后制成腫瘤疫苗(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)。其中，將細胞進行基因修飾的方法一般采用轉基因操作，將編碼腫瘤細胞缺少的蛋白質的基因、細胞因子基因(如GM-CSF)或者編碼“協同刺激分子”(如B7-1)的基因轉入腫瘤細胞或DC，從而增強細胞的抗原提呈能力，增加細胞的免疫原性，糾正患者的“免疫耐受狀態”，激發和強化患者自身的特異性抗腫瘤免疫功能。
目前認為APC功能異常可能是導致腫瘤患者體內缺乏有效的抗腫瘤免疫反應的重要原因，從而造成腫瘤患者的低免疫原性，而不能產生免疫應答。粒單細胞集落刺激因子(GM-CSF)是APC分化、成熟過程中最關鍵的細胞因子之一，它具有免疫佐劑的作用，能夠增強APC的功能，促進APC的增殖和分化，增強APC的吞噬能力而攝取足夠的抗原量，增加細胞膜表面MHC分子、輔助刺激分子和粘附分子等的表達，促進細胞分泌細胞因子等。現有報道GM-CSF能顯著上調人外周血單個核細胞B7-1和B7-2的表達，并促進APC通過B7分子與T細胞的CD28分子結合，使T細胞釋放GM-CSF，而GM-CSF又促進APC表面表達B7分子，在APC和T細胞之間通過GM-CSF形成正反饋調節途徑。小鼠黑色素瘤細胞株B16是不表達MHC-II類抗原的，因此不能遞呈抗原，無免疫原性，經體內外研究它不能誘導產生針對B16細胞的細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應。但在小鼠免疫接種過程中將GM-CSF注射13天，與無佐劑的免疫接種相比，主要和次要的免疫應答反應均得到增強，這說明GM-CSF通過提高APC的功能可以使機體的免疫應答得到增強，調節免疫反應。目前GM-CSF誘導抗腫瘤免疫反應主要用于以下五個方面(1)GM-CSF基因轉化的腫瘤細胞用于預防接種；(2)GM-CSF可以增強抗原激發和DC前體細胞的培養；(3)抗原-GM-CSF融合蛋白進行免疫接種；(4)GM-CSF與單抗共同注射用于單抗治療以增強自發性網絡狀反應；(5)與抗原接種有關的GM-CSF的應用。經GM-CSF基因修飾的DC能夠高表達B7協同刺激分子和其它粘附分子，從而能更有效地提呈抗原，誘導特異性的抗腫瘤CTL反應。有文獻報道，接種GM-CSF轉基因疫苗可使90％以上的NSCLC患者產生特異性抗瘤免疫反應(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)。
在進行了轉基因操作的腫瘤疫苗制備過程中，細胞的處理過程是十分關鍵的，對于細胞的處理希望達到三個目的1.使細胞不能增殖，保證進入體內的腫瘤細胞不會發展成新的腫瘤灶；2.增加基因表達效率，在基因修飾腫瘤疫苗中，目的基因的表達效率是影響療效的關鍵因素；3.促進細胞抗原相關蛋白的表達，如Hsp-70、MHC-I，這些蛋白可以促進細胞腫瘤抗原的呈遞，增加腫瘤抗原性。以上這三點對于轉基因腫瘤疫苗的安全性和有效性都是十分重要的，這三個方面的改進會進一步增加療效。
傳統的細胞處理方式有射線照射(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)、化療藥物等。但這些方法只能使細胞不再增殖，而對基因載體的轉導效率，轉入的外源基因的表達量，以及細胞抗原蛋白的表達量基本沒有影響。有文獻指出，對腫瘤細胞進行加熱處理能夠增加Hsp-70分子的表達量(Todryk，S.M.，Cancer Immunol.Immunother.2004)。而且，加熱處理后的腫瘤細胞在腫瘤轉移實驗中只能夠短暫生長，然后就失去增殖能力(Mise，K.，Cancer Res.1990)。
參考文獻及專利文獻1.Nemunaitis，J.
GVAX(GMCSF gene modified tumor vaccine)in advanced stage non small cell lung cancer.J.Control Release.2003 Aug 28；91(1-2)225-31.
2.Todryk，S.M.，Eaton，J.，Birchall，L.，Greenhalgh，R.，Soars，D.，Dalgleish，A.G，Melcher, A.A.，Pandha，H.S.
Heated tumour cells of autologous and allogeneic origin elicit anti-tumour immunity.
Cancer Immunol.Immunother.2004 Apr；53(4)323-30.Epub 2003 Nov 28.
3.Mise，K.，Kan，N.，Okino，T.，Nakanishi，M.，Satoh，K.，Teramura，Y.，Yamasaki，S.，Ohgaki，K.，Tobe，T.
Effect of heat treatment on tumor cells and antitumor effector cells.
Cancer Res.1990 Oct 1；50(19)6199-202.
專利一種腫瘤免疫治療及預防性疫苗的組成、制備、應用方案，申請號02153446.2，申請日2002.11.29。

發明內容
本發明克服了現有技術中的缺點，提供了一種對細胞進行轉基因操作結合加熱處理來制備腫瘤細胞疫苗的方法，經過這樣的處理后，基因載體的轉導效率明顯增加，外源基因的表達量增加，更好的實現轉基因的效果；同時，有利于細胞抗原暴露的免疫分子Hsp-70、MHC-I、MHC-II、ICAM的表達量也明顯增加，從而增強腫瘤疫苗激發的特異性免疫反應，增加腫瘤疫苗的療效。
本發明是通過下述技術方案實現的將手術切除的腫瘤組織，通過機械分離或酶消化法或直接通過100目細胞篩，制備成腫瘤細胞單細胞懸液；然后用能夠表達粒單細胞集落刺激因子(GM-CSF)的重組腺病毒(Ad-GM-CSF)感染這些原代細胞或培養增殖后的細胞；細胞在42～45℃加熱處理30～120分鐘，即可得到該種腫瘤的自體腫瘤細胞疫苗。對于難以獲得腫瘤組織的情況下，也可以應用有相同腫瘤抗原的腫瘤細胞株來替代手術切除的腫瘤組織，例如前列腺癌細胞株PSA(+)、肺癌細胞株A549、黑色素瘤細胞株A375、肝癌細胞株Hep3B，或者其他異體細胞來進行上述操作，制備異體腫瘤細胞疫苗。
所述加熱處理的溫度最好是42℃，所述加熱處理時間最好為60分鐘。
本發明所述的方法中，在對細胞進行轉基因操作和加熱處理時，可以先進行轉基因操作再進行加熱處理，也可以先進行加熱處理再進行轉基因操作，也可以將轉基因操作與加熱處理同時進行。
除了腫瘤細胞以外，本發明也可以處理樹突細胞、成纖維細胞等其他自體或異體的非腫瘤細胞，這些細胞在處理后可以直接參與免疫反應，或作為外源基因的分泌細胞，實現外源基因表達產物在局部的高濃度。本發明也可用于腫瘤疫苗制備以外需要使細胞不再增殖，同時增加外源基因的轉染效率或免疫相關分子的表達增高的其他情況。
本發明中進行轉基因操作時應用的轉基因載體可以是腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、仙臺病毒載體，也可以是質粒DNA載體。
本發明中應用的腺病毒載體是Ad5F35腺病毒載體，它屬于B組腺病毒。與通常使用的腺病毒通過CAR受體來感染細胞不同，B組腺病毒用CD46細胞受體作為吸附受體。CD46是一種廣泛表達的補體調節蛋白，幾乎在所有的人類體細胞表面都存在。所以應用Ad5F35作為載體來進行轉基因操作轉染造血干細胞、樹突狀細胞和惡性腫瘤細胞等靶細胞時，可以克服應用一般腺病毒作為載體進行轉染時感染效率低的缺點。
應用本發明處理細胞時，外源基因表達效率的提高不是由轉導的基因種類引起的，因此多種基因都可以用于轉染，以適應不同的設計需要，例如IL-2、Hsp70、IL-7、B7-1等各種免疫分子的基因，或CEA、PSA等各種抗原基因，以及其他治療用具有免疫活性的目的基因或報告基因。
本發明中加熱處理的方法可以有多種，例如氣浴、水浴、金屬加熱等方法。只要42～45℃的溫度持續30～120分鐘，就能夠達到使處理后的細胞喪失增殖能力，進入凋亡狀態，同時保持細胞的蛋白表達能力的效果。
與現有技術相比，加熱處理轉基因操作的細胞，能夠使細胞受到創傷并喪失增殖能力，與傳統的采取射線照射方法處理細胞效果相同。另外，加熱處理后，外源基因轉染細胞的效率明顯增高，外源基因的表達也明顯增強。而且由于細胞在受到熱激處理后的反應，細胞的免疫分子如Hsp-70、MHC-I、MHC-II以及ICAM的表達增加。因此，經過本發明處理所制備的腫瘤疫苗在保證了經加熱處理的細胞回輸人體的安全性的同時，可以增加腫瘤疫苗的抗原性，促進機體產生針對腫瘤細胞的免疫反應，增強疫苗的療效。


圖1.加熱處理和照射處理對外源基因轉染效率的影響圖中綠色熒光顯示轉染外源基因后細胞中表達的GFP。細胞經過不同處理，表達GFP的外源基因轉染效率為未處理組＜照射處理組＜加熱處理組。
圖2.加熱處理和照射處理對外源基因表達量的影響感染了Ad-GM-CSF的細胞，經過不同處理后，未處理組及照射處理組GM-CSF的表達量基本相同，而加熱處理組的表達量明顯增加。
圖3.加熱處理和照射處理對免疫相關分子MHC-I、MHC-II、ICAM表達量的影響A圖中顯示的是照射處理的細胞進行流式細胞儀檢測的結果；B圖中顯示的是加熱處理的細胞進行流式細胞儀檢測的結果。結果表明經加熱處理的A549細胞表面的MHC-I、MHC-II、ICAM的表達量增加。
圖4.加熱處理和照射處理對免疫相關分子Hsp-70表達量的影響1.加熱處理的細胞中Hsp-70的表達量；2.照射處理的細胞中Hsp-70的表達量；3.未經處理的細胞中Hsp-70的表達量。結果表明經加熱處理的A549細胞中Hsp-70的表達增加，明顯多于照射處理組和對照組。
圖5.采用加熱處理與照射處理制備的腫瘤疫苗對小鼠腫瘤動物模型的治療效果圖a顯示接種了黑色素瘤細胞的小鼠，分別注射加熱處理與照射處理制備的腫瘤疫苗后，腫瘤平均瘤塊體積對照組＞照射處理組＞加熱處理組；圖b顯示接種了黑色素瘤細胞的小鼠，分別注射加熱處理與照射處理制備的腫瘤疫苗后，存活率對照組＜照射處理組＜加熱處理組；圖c顯示接種了黑色素瘤細胞的小鼠，分別注射加熱處理與照射處理制備的腫瘤疫苗后，無瘤生存率對照組＜照射處理組＜加熱處理組。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步的描述。
實施例1自體腫瘤疫苗的制備所述操作均在無菌條件下進行1.腫瘤細胞懸液的制備，1.1將手術取得的腫瘤組織置于無血清培養基中，冰浴條件下送至細胞治療中心，可于4℃保存，但不應超過24小時。
1.2將腫瘤標本在標本浸泡液(Hanks液或1640培養基配制，含青霉素500～1000單位/mL、鏈霉素500單位/mL、兩性霉素2ug/mL)中浸泡15～30分鐘。
1.3取出標本置于平皿中，用眼科剪將標本切成1mm3小塊；可選酶消化法按1∶2(v/v)加入消化液(Hanks液或1640培養基配制，含0.25％胰蛋白酶、0.1～0.3ug/mL膠原酶)，置于37℃搖床消化或每15分鐘震蕩一次至液體明顯混濁；或者可以直接通過100目細胞篩，以注射器針芯輕柔碾壓使細胞通過細胞篩。
1.4以無血清培養基收集細胞，PBS清洗兩遍。800～1000g離心10分鐘后，少量無血清培養基重懸細胞，計數，以含5％人AB型血清培養基反復吹打細胞，制成單細胞懸液(以下列條件培養細胞密度106cell/mL；無血清培養基+5％人AB型血清；37℃；5％CO2)
2.轉基因操作上述細胞培養2～3小時后，以MOI＝10的劑量加入Ad-GM-CSF，感染12～16小時。
3.加熱處理用胰蛋白酶消化收集上述經Ad-GM-CSF感染的細胞，用培養液重懸于離心管中，每管3～8mL，置于42℃水浴1小時。
4.制備好的自體腫瘤細胞疫苗保存在低溫環境下備用。
實施例2同種異體腫瘤細胞疫苗的制備前列腺癌細胞株PSA(+)、肺癌細胞株A549、黑色素瘤細胞株A375、肝癌細胞株Hep3B可分別用于制備相應的腫瘤疫苗，本實施例以A549為例進行說明。
所述操作均在無菌條件下進行1.將凍存的A549細胞復蘇2.細胞培養擴增至2×108個細胞時，以MOI＝10的劑量加入Ad-GM-CSF，感染12～16小時。
3.用胰蛋白酶消化收集上述經Ad-GM-CSF感染的細胞，用培養液重懸于離心管中，每管3～8mL，置于42℃水浴1小時。
4.制備好的同種異體腫瘤細胞疫苗保存在低溫環境下備用。
實施例3利用特異性抗腫瘤細胞疫苗誘導制備特異性抗腫瘤CTL1.樹突細胞的培養和成熟1.1無菌操作取患者外周血，以肝素或EDTA抗凝后，緩慢加入裝有淋巴細胞分離液的離心管中，分層后離心棄上清，吸取中間的白色細胞層.
1.2以5倍體積的PBS或Hank’s液清洗細胞。
1.3以含有10％FCS的RPMI1640重懸細胞，稀釋至2×106個細胞/mL，加入六孔板中，每孔3mL，37℃孵育3小時。
1.4以培養基洗滌一次貼壁的細胞，加入含15％FCS的RPMI1640(含青鏈霉素，GM-CSF 800u/mL，IL-4500u/mL)培養。
1.5培養7天后，收集樹突細胞備用。
2.腫瘤細胞疫苗在體外刺激樹突細胞將制備好的腫瘤細胞疫苗加入成熟的樹突細胞中，37℃孵育24小時，清洗細胞，作為致敏的抗原呈遞細胞。
3.特異性抗腫瘤CTL的誘導制備方法3.12×106個細胞/mL的自體淋巴細胞與1×105個細胞/mL的致敏樹突細胞等體積混合，加入96孔板中，100μL/孔，37℃孵育。
3.2三天后加入IL-2至終濃度為25u/mL，誘導抗原特異性CTL的活化和擴增。此特異性抗腫瘤CTL細胞可直接應用于臨床治療。
實施例4加熱處理與照射處理對腫瘤細胞增殖的影響1.MTT試驗檢測加熱處理與照射處理對腫瘤細胞增殖的影響A549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于3個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。然后將3管細胞分別接種于96孔培養板中，另設空白孔和對照孔。加入RPMI-1640完全培養液，補足體積為200μL。混勻后放入CO2孵箱中培養。5天后取出細胞，棄去上清液，加培養液100μL，MTT液10μL，混勻后放入CO2孵箱中培養4小時。然后棄上清液，加二甲亞砜100μL/孔，混勻后測600nm的Dλ值，計算每組細胞存活率，存活率％＝D實驗/D對照×100％。
經過加熱處理或照射處理后的腫瘤細胞，五天后存活率均＜1％。
2.3H-TdR摻入法檢測加熱處理與照射處理對腫瘤細胞增殖的影響A549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于3個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。然后將3管細胞分別接種于96孔培養板中，另設空白孔和對照孔。加入RPMI-1640完全培養液，補足體積至200μL。混勻后放入CO2孵箱中培養。5天后，加入3H-TdR振蕩混勻，繼續培養24小時，棄去上清液，加胰酶消化后制成細胞懸液，用多頭細胞收集儀將細胞抽濾于49型纖維濾膜上，37℃烘干，加入固相閃爍液，脈沖計數儀測定Bq，計算細胞DNA合成率(％)＝Bq實驗/Bq對照×100％。
經過加熱處理或照射處理后的腫瘤細胞DNA合成率均＜1％。
3.細胞計數法檢測加熱處理與照射處理對細胞增殖的影響
A549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于3個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。在培養瓶中加1×105個/mL細胞懸液2mL/瓶，并加培養液至總體4mL。四天中每天取出一瓶細胞，胰酶消化制成細胞懸液，計數細胞，每種條件計數3次，取平均結果。
經過加熱處理或照射處理后的腫瘤細胞經1～4天，細胞總數均逐漸減少。
4.裸鼠成瘤試驗檢測加熱處理與照射處理對細胞增殖的影響3×108個A549細胞消化后制成細胞懸液，分成3管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。每組細胞分別接種裸鼠10只，每只接種1×107個細胞，30天內觀察成瘤情況，計算成瘤率＝成瘤只數/10×100％。
加熱處理和照射處理的腫瘤細胞的成瘤率為0％。未經處理的腫瘤細胞的成瘤率為100％。加熱處理和照射處理的腫瘤細胞均不會形成新的腫瘤灶。
實施例5加熱處理與照射處理對基因載體轉染效率的影響1.轉染Ad-GFPA549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于3個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。之后分別接種于24孔板中，細胞貼壁后以MOI＝10加入Ad-GFP，感染過夜后觀察熒光。
結果如圖1所示，加熱處理組細胞中表達的GFP熒光亮度明顯高于照射處理的細胞和空白對照細胞。
2.轉染Ad-GM-CSFA549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于3個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。之后接種于24孔板中，細胞貼壁后以MOI＝10加入Ad-GM-CSF，感染后1～7天每天吸取細胞上清凍存于-20℃，然后全部換液，7天后應用ELISA試劑盒檢測每天所取樣品中的GM-CSF含量。
結果如圖2所示，加熱處理組的細胞中，GM-CSF的表達量明顯高于照射處理組和空白對照組。
實施例6加熱處理與照射處理對免疫相關分子的表達量的影響
1.加熱處理與照射處理對MHC-I、MHC-II、ICAM表達量的影響A549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于2個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時。每種細胞分裝于2只管中，加入PE標記的抗人MHC-I抗體后，分別加入FITC標記抗人MHC-II抗體和抗人ICAM抗體，用流氏細胞儀進行檢測。
結果如圖3所示，與照射處理相比，加熱處理的A549細胞表面的MHC-I、MCH-II、ICAM的表達量均增加。
2.加熱處理與照射處理對Hsp-70表達量的影響A549細胞消化后制成細胞懸液，分裝于3個離心管，其中1號管用放射源以10,000rad照射，2號管置于42℃水浴中1小時，3號管作為陽性對照。分別加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，蛋白變性后取上清20μL做Western blot，檢測三組細胞中Hsp-70的表達量。結果如圖4所示，經加熱處理的A549細胞Hsp-70的表達量增加，明顯多于照射處理組和對照組。
實施例7采用加熱處理與照射處理制備的腫瘤疫苗在小鼠腫瘤動物模型中的治療效果1.小鼠腫瘤動物模型的建立4～6周雌性C57小鼠，每只于右側腋下接種1×105個小鼠黑色素瘤細胞B16F10。
2.GM-CSF轉基因腫瘤疫苗的制備B16F10細胞，以MOI＝10感染Ad-GM-CSF，過夜后，消化細胞，重懸分裝于2支離心管中，一支用放射源以10,000rad照射，另一支置于42℃水浴中1小時。凍存備用。
3.GM-CSF轉基因腫瘤疫苗治療小鼠腫瘤動物模型接種腫瘤細胞5天后的小鼠腫瘤模型動物，分為三組，第一組皮下注射經加熱處理的轉基因腫瘤疫苗，第二組皮下注射經照射處理的轉基因腫瘤疫苗，第三組注射PBS作為對照。觀察成瘤率、抑瘤率。
結果如圖5所示，三組動物的平均瘤塊體積大小依次為對照組＞照射處理組＞加熱處理組。三組動物的腫瘤發生率高低依次為對照組＞照射處理組＞加熱處理組。
權利要求
1.一種制備腫瘤疫苗的方法，包括以下步驟a)對細胞進行轉基因操作；b)將細胞在42～45℃加熱30～120分鐘。
2.根據權利要求1所述制備腫瘤細胞疫苗的方法，其特征在于，在制備腫瘤細胞疫苗的過程中，對細胞進行轉基因并結合加熱處理。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述的細胞是腫瘤細胞、成纖維細胞、樹突細胞。
4.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述細胞的來源可以是原代、傳代、自體、異體細胞。
5.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述熱處理的方法可以采用水浴、氣浴、金屬浴。
6.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述熱處理的溫度范圍在42～45℃之間。
7.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述熱處理的時間范圍在30～120分鐘之間。
8.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述轉基因操作的轉導基因是治療用具有免疫活性的基因及抗原基因，包括GM-CSF、IL-2、Hsp70、IL-7、B7-1、CEA、PSA。
9.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述轉基因操作應用了基因載體，包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、仙臺病毒載體、質粒DNA載體。
全文摘要
本發明公開了一種腫瘤細胞疫苗的制備方法，旨在提供一種不僅能夠增加基因載體的轉導效率、增加外源基因的表達量，而且能夠增加免疫分子Hsp－70、MHC－I、MHC－II、ICAM的表達量的腫瘤細胞疫苗制備方法，利用本方法制備的腫瘤細胞疫苗，不僅保證了腫瘤細胞疫苗回輸人體的安全性，而且可以增加腫瘤細胞疫苗的抗原性，促進機體產生針對腫瘤細胞的特異性免疫反應，增強腫瘤細胞疫苗的療效。本發明通過下述技術方案實現對細胞進行轉基因操作；將細胞在42～45℃加熱30～120分鐘。本發明的主要用途是制備自體或異體腫瘤細胞疫苗；體外誘導制備特異性抗腫瘤CTL；制備直接參與免疫反應，或作為外源基因分泌細胞的樹突細胞、成纖維細胞等其他自體或異體的非腫瘤細胞。
文檔編號A61P35/00GK1754576SQ20041008033
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月29日 優先權日2004年9月29日
發明者吳小兵, 康禹, 彭建強 申請人:本元正陽基因技術股份有限公司