專利名稱：人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法及醫用組合物的制作方法
技術領域：
本發明屬于間充質干細胞的分離及培養方法，具體涉及的是一種人羊膜間充質干細胞的分離及體外培養方法，以及含有人羊膜間充質干細胞作為有效成分的醫用組合物。
背景技術：
近幾年來，干細胞的研究取得了重大突破.1999和2000年，世界最權威的美國《Science》雜志連續2年將干細胞和人類基因組計劃列為當年的10大科學突破，尤其是在1999年甚至將干細胞研究列為第一位。干細胞很可能在醫學領域引發革命性進步，因而具有不可估量的醫學價值而引起全世界的廣泛關注和研究，美國《時代》周刊認為干細胞和人類基因組計劃將同時成為新世紀最具有發展和應用前景的領域。
間充質干細胞(mesenchymal stem cells，簡稱MSCs)是來源于成熟組織中的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞，具有廣闊的應用前景。其中，研究最為廣泛的MSCs是來源于骨髓的間充質干細胞，盡管其倫理問題與胚胎干細胞相比大為減少，但骨髓細胞必須通過侵入的途徑獲得，及其隨著年齡的增長，干細胞數量顯著減少。許多研究機構已經在其它組織中尋找到多能干細胞，包括動員的外周血、臍血、乳牙、臍帶間充質細胞，然而，從這些組織中得到的細胞數量十分有限。

發明內容
本發明的第一個目的在于針對現有干細胞來源或者受倫理限制或者數量有限的問題，提供一種不受倫理限制且來源廣泛的人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法。
本發明的第二個目的在于利用本發明的方法制得的人羊膜間充質干細胞，提供一種醫用組合物。
本發明的第一個目的是這樣實現的本發明包括如下順序的步驟(1)取人羊膜先用胰蛋白酶消化，然后用膠原酶、脫氧核糖核酸酶消化，得到細胞懸液；(2)將上一步所得的細胞懸液過濾，制成單細胞懸液；(3)將第(2)步所得細胞接種于培養基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5％的CO2培養箱中進行培養，并通過換液和傳代，使人羊膜間充質干細胞逐漸得到擴增和純化，所述培養基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養基，其中含有體積百分含量為10％-20％的胎牛血清和終濃度為10-20ng/ml的堿性成纖維生長因子。
在上述第(1)步中，優選采用重量百分含量為0.125-0.25％的胰蛋白酶，室溫消化30-60分鐘，共2-4次，然后用含體積百分含量為10％-20％胎牛血清的DMEM/F12培養液中止胰蛋白酶，采用含0.5-2.0g/L膠原酶和0.05-0.20g/L脫氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養液，37℃消化1-2小時。
在上述第(3)步中，優選將第(2)步所得細胞以1×105-1×106/ml密度接種于培養基中培養。
將細胞擴增和純化的過程優選如下在本發明的第(3)步開始細胞培養后，培養48～72小時，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3～4天全量換液一次，待細胞達到80％～90％融合時，用重量百分含量為0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例或1∶3的比例進行傳代接種培養，并記為P1代，傳代培養過程中每3天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復上述操作進行傳代培養，并記為P2代，繼續上述傳代培養過程。
本發明的醫用組合物，包括通過本發明所述的方法制得的人羊膜間充質干細胞，優選包括人羊膜間充質干細胞和纖維蛋白膠的醫用組合物。本發明的醫用組合物可用于神經替代治療、用于心肌梗塞的治療、用于糖尿病的治療、用于骨組織工程、應用于整形外科。
本發明的優點在于人羊膜是胎兒出生以后的廢棄物，本發明從羊膜分離、體外培養人羊膜間充質干細胞(Human Amniotic-derivedmesenchymal stem cells，簡稱HADMSCs)，具有來源廣泛，不受倫理限制等優越性；本發明的醫用組合物含有能夠分化為中胚層及其它胚層的成熟組織的人羊膜間充質干細胞，應用廣泛。


圖1是實施例一中培養不同時間的HADMSCs的放大100倍的顯微照片。
圖2是實施例一中流式細胞分析結果圖。
圖3是實施例二中HADMSCs經誘導向神經細胞分化的細胞照片，其中A為誘導4天的放大100倍的照片；B為誘導7天的照片；C為誘導前細胞表達nestin的照片，放大200倍；D為誘導7天細胞表達NSE的照片，放大200倍。
圖4是實施例三中移植后神經細胞表達特異性標志物的照片，其中A、B、C、D為HADMSCs移植組，放大400倍，A、B為移植后2周、4周移植細胞表達GFAP的照片，C、D為移植后2周、4周移植細胞表達NSE的照片；E、F、G、H為纖維蛋白膠和HADMSCs混合移植組，放大400倍，E、F為移植后2周、4周移植細胞表達GFAP的照片，G、H為移植后2周、4周移植細胞表達NSE的照片。
具體實施例方式
實施例一人羊膜間充質干細胞的分離、培養、擴增及純化1、人羊膜間充質細胞的分離在無菌條件下取正常足月剖腹產胎兒的人胎盤，鈍性分離胎盤臍帶面的羊膜，用磷酸緩沖液(PBS)充分沖洗，將羊膜剪成1.0cm×1.0cm大小的片狀，按每克組織加入重量百分含量為0.25％的胰蛋白酶2ml，室溫消化30分鐘，共3次，然后用含體積百分含量為10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養液中止胰蛋白酶，以盡可能除去上皮細胞。然后將羊膜盡可能剪碎，以每克組織加入含1.0g/L膠原酶和0.10g/L脫氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養液2ml，37℃消化1小時后得細胞懸液。然后用不銹鋼網過濾將消化下來的細胞制成單細胞懸液，1000r/m離心10分鐘，用PBS洗2次，用臺盤蘭染色，計數活細胞，以2×105/ml的密度將所得細胞接種于75ml培養瓶內。本發明在接種時的細胞密度可采用1×105-1×106/ml。
2、人羊膜間充質干細胞的培養、純化及擴增培養基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養基，其中加了體積百分含量為10％的胎牛血清(FBS)和終濃度為20ng/ml的堿性成纖維生長因子(bFGF)，將上一過程所得的人羊膜間充質細胞分裝于75ml培養瓶中，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5％的CO2培養箱中培養48-72小時后，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次。待細胞達到80％-90％融合時，用重量百分含量為0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2或1∶3的比例的比例進行傳代接種培養，并記為P1代。傳代培養過程中每3天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作進行傳代，此傳代培養記為P2代，然后繼續上述傳代培養過程。細胞于24小時內開始貼壁，72小時觀察，見細胞呈圓形、梭形、星形、多角形等多種形態，通過全量換液逐漸去除未貼壁細胞，此時貼壁細胞呈單個分散或幾個細胞的克隆，10天以后細胞形態逐漸均勻，呈長梭形，有偽足，14天左右可見兩種細胞克隆上皮樣細胞克隆和成纖維樣細胞克隆，前者是雜細胞，后者是人羊膜間充質干細胞HADMSCs，每個克隆約含200～300個細胞，培養至14～18天細胞達80％～90％融合，見成纖維樣細胞呈放射狀或漩渦狀分布，上皮樣細胞呈鋪路石樣排列。傳代后細胞24小時內完全貼壁，7～10天達到完全融合，傳至3代，細胞形態很均勻，上皮樣細胞克隆消失。隨著傳代的進行，HADMSCs的胞體逐漸增大，出現部分寬大扁平的細胞，失去增殖和分化能力，而大部分細胞仍然維持細長的梭形，保持增生和分化能力。體外培養10代以后，細胞的增殖速度明顯減慢，細胞出現老化現象。
在上述培養傳代過程中的細胞形態可參見圖1A是培養8天的圖，細胞混雜，見圓形、星形、多角形、梭形等多種形態；B、C是培養13天的圖，其中B是成纖維細胞樣克隆，C是上皮細胞樣克隆；D是第1代3天的圖，E是第3代3天的圖，F是第3代6天的圖，G是第6代3天的圖，H是第8代10天的圖。
3、流式細胞檢測培養4-6代的人羊膜間充質干細胞用重量百分含量為0.25％的胰蛋白酶消化后，用含體積百分含量為1％小牛血清白蛋白的PBS調整細胞至5×105/50ul。然后分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-ABC、HLA-DR，置4℃孵育30分鐘，用PBS洗1次，直標單抗可直接上流式細胞儀檢測，而間標單抗再加兔抗鼠FITC二抗，置4℃孵育30分鐘，用PBS洗滌2次后，進行流式細胞儀分析。分析結果如圖所示，顯示CD29、CD44、HLA-ABC陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性。上述鼠抗人單克隆抗體CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-ABC、HLA-DR購自Santa Cruz Biontechnology Ins.公司。
在本實施例的第1步的分離步驟中，胰蛋白酶的重量百分含量可為0.125-0.25％，消化時間可為30-60分鐘，次數為2-4次；中止胰蛋白酶的DMEM/F12培養液中胎牛血清的體積百分含量可為10％-20％；膠原酶、脫氧核糖核酸酶消化時，VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養液中膠原酶的濃度可采用0.5-2.0g/L，脫氧核糖核酸酶可為0.05-0.20g/L，消化時間可為1-2小時。
實施例二定向誘導HADMSCs向神經元樣細胞分化1、定向誘導取傳至第3代的HADMSCs按4×105/L密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內制備細胞爬片，待細胞達80％融合時，以含30μmol/L全反式維甲酸(Retinic acid，購自sigma公司)、20ng/mlbFGF、10％FBS的DMEM/F12培養基誘導7天，對照組不加任何誘導劑。結果培養的人羊膜間充質干細胞表達神經干細胞的標志物人神經巢蛋白(nestin)，經誘導后的細胞表達nestin和神經元的標志物人神經元特異性烯醇化酶(NSE)，不表達神經膠質細胞的標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)。
2、倒置顯微鏡下觀察HADMSCs向神經細胞的誘導分化，在加入誘導液后2天，即有部分細胞發生形態變化，胞體回縮，凸起變細變長，逐漸呈現神經元樣細胞形態，可觀察到部分細胞脫壁死亡；誘導4天后，大部分細胞發生形態改變，較多的神經元樣細胞聚集在一起，相鄰的細胞間軸突聯結成網狀，誘導的神經元樣細胞形態不一，有簡單的雙極細胞，也有復雜的多極細胞，少部分細胞始終未發生形態改變，仍保持寬大扁平狀；7天后，大部分細胞呈神經元樣形態。HADMSCs在上述誘導分化過程中的細胞形態參見圖3。
3、免疫細胞化學檢測取生長有細胞的蓋玻片，采用SP免疫組化方法進行免疫細胞化學染色，細胞蓋玻片用80％的丙酮固定10分鐘，3％H2O2封閉10分鐘，山羊血清封閉15分鐘，去除血清后分別加入兔抗人神經巢蛋白、小鼠抗人神經元特異性烯醇化酶和膠質纖維酸性蛋白單抗工作液，并設陰性對照，以PBS代替一抗，置于濕盒中4℃下過夜，PBS洗滌3遍，分別滴加羊抗兔及羊抗鼠的二抗工作液，室溫30分鐘，再加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育30分鐘，用顯色劑DAB顯色，中性樹膠封片。鏡下隨機取10個非重疊視野(放大100倍)，計算nestin和NSE和GFAP陽性細胞占總細胞的比例。結果顯示，誘導分化前HADMSCs的nestin表達率為82.0±3.3；誘導4天NSE表達率為40.4±2.0，誘導7天后NSE表達率為78.1±3.4，誘導4天和7天相比NSE表達在統計學上有差異，t＝-30.52，P＜0.05，表達上調；不表達GFAP。
實施例三含有HADMSCs的組合物在治療神經系統疾病中的應用HADMSCs能夠分化為神經細胞，為神經移植開辟了新的細胞來源。可通過局部應用或、腰椎穿刺及靜脈輸注等途徑將HADMSCs移植人體來治療腦損傷、帕金森綜合癥、腦卒中、脊髓損傷及外周神經損傷等神經系統疾病。
1、動物分組及模型制作Wistar大鼠80只，雌雄不限，隨機分為4組A組為損傷組(Sham)，20只，只開顱鉆孔不打擊腦組織不移植細胞，作為陰性對照組。B組為假移植組(TBI+NS)，20只，開顱鉆孔打擊腦組織1天后注射生理鹽水10μl，作為干預對照。C組為移植組(TBI+HADMSCs)，20只，開顱鉆孔打擊腦組織1天后注射含HADMSCs的生理鹽水10μl，作為HADMSCs移植組。D組為纖維蛋白膠移植組(TBI+FG+HADMSCs)，20只，開顱鉆孔打擊腦組織1天后將HADMSCs以1×106/ml密度與纖維蛋白膠的組分主體膠和催化劑混合，于損傷區用纖維蛋白膠專用注射器單點注射混合液100μl，作為纖維蛋白膠細胞移植組。纖維蛋白膠由廣州倍秀生物技術有限公司生產。
B、C、D組三組采用自由落體硬膜外撞擊法制作大鼠腦創傷模型，損傷裝置有底板，固定支架，垂直導桿，20g砝碼，聚乙烯撞擊圓錐組成。撞擊圓錐頭端直徑4mm，高2.5mm。10％水合氯醛腹腔內注射麻醉大鼠，注射量為3ml/kg體重，將大鼠頭部固定于手術臺上，減去頂部皮毛，消毒，沿中線切開皮膚及骨膜，左側前鹵后3mm，左旁開2mm，鉆一直徑為5mm的圓形窗，將撞擊圓錐頭端放入骨窗中，砝碼自30cm高處垂直落下，撞擊置于硬膜上的圓錐，致中度腦損傷，縫合骨膜及皮膚，放回復蘇。
2、免疫組化創傷后2周、4周用10％水合氯醛腹腔內過量注射麻醉處死大鼠，每組各5只，立即開胸經心臟主動脈插管，1分鐘內用1％肝素生理鹽水100ml快速灌注，然后用4％多聚甲醛溶液滴灌2小時，灌注后取出腦組織，放入4℃、4％多聚甲醛溶液中固定過夜。梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟并制成蠟塊，以損傷區為中心切片10張，將切片貼附于多聚賴氨酸處理的玻片上以備免疫組化染色。
免疫組化SP法將石蠟切片脫蠟和水化；用PH7.4的PBS沖洗，沖洗3次，每次5分鐘，3％H2O2室溫孵育5-10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗3次，每次5分鐘；加熱抗原修復將切片放入抗原修復液中，電爐加熱至96～100℃，持續20分鐘；室溫冷卻后用PBS沖洗5分鐘×3次；10％正常山羊血清封閉，室溫孵育20分鐘，傾去血清，勿洗；滴加鼠抗人GFAP工作液，鼠抗人NSE工作液，4℃濕盒過夜；PBS沖洗3分鐘×3次；滴加二抗即生物素標記山羊抗鼠IgG工作液，室溫下孵育30分鐘；PBS沖洗3分鐘×3次；滴加三抗即辣根酶標記鏈霉卵白素-過氧化物酶溶液，37℃孵育30分鐘；PBS沖洗3分鐘×3次；加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察5～10分鐘；自來水充分沖洗；蘇木素復染；酸酒精分化；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結果顯示動物腦內移植2周、4周均表達NSE和GFAP，參見圖4。表明HADMSCs在體內分化為神經元和神經膠質細胞，HADMSCs能夠在纖維蛋白膠內存活和分化。
實施例四纖維蛋白膠作為HADMSCs的支架材料在組織工程中的應用纖維蛋白膠是從血液中提取相關成分如纖維蛋白原、XIII因子、凝血酶等制成的醫用生物材料，可作為粘合劑粘合修復組織損傷，其組織相容性和生物降解性良好，可被組織完全吸收。我們將纖維蛋白膠和HADMSCs混合，并移植于大鼠的損傷腦組織內，2周和4周均發現其分化為神經元和神經膠質細胞，表明移植的HADMSCs在纖維蛋白膠內能夠很好的生存，且在局部微環境的影響下，能夠分化為神經細胞。移植區未見炎細胞浸潤，表明其和腦組織的良好相容性。2周的組織HE切片中未發現纖維蛋白膠團塊，說明纖維蛋白膠已經完全溶解，其降解性能良好。且用纖維蛋白膠作為細胞移植的支架，不僅能夠起到局部止血的作用，還能防止細胞的流動，使局部保持更大的細胞濃度，更有利于損傷的修復。同時，纖維蛋白膠作為HADMSCs的支架材料，還可用于骨組織工程等其它組織工程。
從以上實施例可見本發明方法可成功地從羊膜分離、培養出人羊膜間充質干細胞，該細胞可在體外成功地擴增和純化，經流式細胞檢測，該細胞表達CD29、CD44、HLA-ABC，不表達CD34、CD45、HLA-DR陰性；人羊膜間充質干細胞表達神經干細胞的標志物nestin，經體外誘導該細胞可分化為神經元，在損傷腦區可分化為神經元和神經膠質細胞。
實施例五含有HADMSCs的醫用組合物用于心肌梗塞的治療HADMSCs具有間充質干細胞的普遍特性，能夠分化為中胚層及其它胚層的成熟組織。可通過介入手段或靜脈輸注等途徑將其移植于心肌梗死部位，替代梗死心肌，恢復心臟功能。
實施例六含有HADMSCs的醫用組合物用于糖尿病的治療糖尿病主要是胰島功能衰竭所致，將HADMSCs移植于胰島，通過一定的分化調控，使其分化為功能性的胰島細胞，替代胰島功能，治療糖尿病。
實施例七含有HADMSCs的醫用組合物用于骨組織工程將HADMSCs在一定的誘導條件下分化為骨組織，可將HADMSCs移植于骨缺損處，修復骨缺損。
實施例八含有HADMSCs的醫用組合物在整形外科的應用將HADMSCs通過適當的誘導體系誘導，分化為脂肪細胞，用于身體塑性。
權利要求
1.一種人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于包括如下順序的步驟(1)取人羊膜先用胰蛋白酶消化，然后用膠原酶、脫氧核糖核酸酶消化，得到細胞懸液；(2)將上一步所得的細胞懸液過濾，制成單細胞懸液；(3)將第(2)步所得細胞接種于培養基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5％的CO2培養箱中進行培養，并通過換液和傳代，使人羊膜間充質干細胞逐漸得到擴增和純化，所述培養基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養基，其中含有體積百分含量為10％-20％的胎牛血清和終濃度為10-20ng/ml的堿性成纖維生長因子。
2.根據權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于在第(1)步中，采用重量百分含量為0.125-0.25％的胰蛋白酶，室溫消化30-60分鐘，共2-4次，然后用含體積百分含量為10％-20％胎牛血清的DMEM/F12培養液中止胰蛋白酶，采用含0.5-2.0g/L膠原酶和0.05-0.20g/L脫氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培養液，37℃消化1-2小時。
3.根據權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于將第(2)步所得細胞細胞以1×105-1×106/ml密度接種于培養基中培養。
4.根據權利要求1至3所述的任意一種人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于在第(3)步開始細胞培養后，培養48～72小時，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3～4天全量換液一次，待細胞達到80％～90％融合時，用重量百分含量為0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例或1∶3的比例進行傳代接種培養，并記為P1代，傳代培養過程中每3天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復上述操作進行傳代培養，并記為P2代，繼續上述傳代培養過程。
5.一種醫用組合物，包括通過權利要求1至3所述的任意一種方法制得的人羊膜間充質干細胞。
6.根據權利要求5所述的醫用組合物，其特征在于還包括纖維蛋白膠。
全文摘要
本發明為一種人羊膜間充質干細胞的分離及培養方法及醫用組合物，分離及培養方法是將人羊膜用胰蛋白酶、膠原酶、脫氧核糖核酸酶相繼消化，然后過濾制成單細胞懸液，再采用加有體積百分含量為10％－20％的胎牛血清和終濃度為10－20ng/ml的堿性成纖維生長因子的V
文檔編號A61K35/50GK1810959SQ20061003300
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月13日 優先權日2006年1月13日
發明者胡祥, 楊波 申請人:深圳市北科生物科技有限公司