專利名稱：蔗糖酯類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及蔗糖酯類化合物，具體地說，涉及蔗糖酯類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
蔗糖酯類化合物的化學結構自報道以來，對該化合物的研究甚少，關于其藥理活性方面，尤其是該類化合物在治療腫瘤方面的作用，迄今未見報道。本發明主要發現了蔗糖酯類化合物對腫瘤有顯著的治療作用，及其能夠增強臨床化療藥物對腫瘤的治療作用。

發明內容
本發明的目的是對已報道的蔗糖酯類化合物進行研究，研究蔗糖酯類化合物在治療肺癌、胃癌、直腸癌、膀胱癌、鼻咽癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌和白血病等各種腫瘤疾病治療藥物中的應用。所研究的化合物具有如下結構



其中

Phytochemistry 2000；53，1051報道了化合物1-7；Chemical&Pharmaceutical Bulletin1986；34，5005報道了化合物8-11；Journal of Natural Products 2000；63，1094報道了化合物12-15；Journal of Chromatography2005；1063，121報道了化合物16；Journal of NaturalProducts 2001；64，990報道了化合物17；Chemical&Pharmaceutical Bulletin1991；39，2362報道了化合物18；Phytochemistry 1987；26，2965報道了化合物19-21；Phytochemistry1986；25，2897報道了化合物22-26；Journal of Biosciences 1981；36，721報道了化合物27；Phytochemistry 2004；65，2167報道了化合物28；高等學校化學學報2003；24，61報道了化合物29，30；Phytochemistry 1995；38，1497報道了31-33；Chemical&PharmaceuticalBulletin 1994；42，2305報道了化合物34；Phytochemistry 1985；24，1793報道了化合物35，36；Phytochemistry 1997；44，695報道了化合物37；Journal ofNatural Products 1996；59，242報道了化合物38，39。
研究結果表明，所述的化合物對鼠源黑色素瘤細胞株B16F1細胞增殖有明顯的抑制作用，并且它們與足葉乙甙或阿霉素聯合應用時，可以非常顯著地增強這些化療藥物對腫瘤的抑制作用。因此，所述的化合物能應用于制備抗腫瘤的藥物。


圖1為Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙和阿霉素對B16F1細胞增殖抑制的影響。
小鼠黑色素瘤B16F1細胞以每孔2×104個細胞接種于60毫米的培養皿，預貼壁18小時后，分別加入不同終濃度的smiglaside E(3μM，10μM，30μM和100μM)，同時聯合足葉乙甙(etoposide)(0.2μM和0.4μM)和阿霉素(doxorubincin)(5nM和10nM)，繼續培養5天后，胰酶消化B16F1細胞，并用臺盼蘭染色計數活細胞，實驗重復三次，結果以X±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01 vs control(ANOVA and Student’s-ttest).
圖2為Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞凋亡的影響。
B16F1細胞以每孔1.5×105個接種于24孔培養板，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(5μM和10μM)和足葉乙甙(0.5μM)，培養24小時后，消化并收集各組細胞，PBS洗滌后進行AnnexinV-FITC/PI染色，一個小時內用流式細胞儀(FCM，flowcytometer)檢測分析，結果顯示的為三次獨立重復實驗中的一次。
圖3為Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞線粒體膜電位的影響。
B16F1細胞以每孔1.5×105個接種于24孔培養板，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(5μM和10μM)和足葉乙甙(0.5μM)，培養24小時后，消化并收集各組細胞，在100μl的細胞懸液中加入1μl的5mM的JC-1(5，5’，6，6’-tetrachloro-1，1’，3，3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)，室溫避光孵育30分鐘后，每管補足400μl PBS，FCM檢測在FL-1通道綠色熒光變化情況，結果顯示的為三次獨立重復實驗中的一次。
圖4為Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞caspase-3/7活性的影響。
5×103/孔的B16F1細胞接種于96孔培養板，待細胞完全貼壁后分別加入smiglasideE(10μM)和足葉乙甙(0.5μM)，繼續培養18h，加入caspase-3/7底物Z-DEVD-R110，室溫避光孵育6h，用熒光酶標儀檢測，實驗重復三次，結果以X±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01 vs control(ANOVA and Student’s-t test)圖5為Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞周期的影響。
每孔1.5×105個B16F1細胞接種于24孔培養板，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(3μM、10μM和30μM)和足葉乙甙(0.2μM)，培養24h后收集細胞，PI染色后FCM檢測分析，實驗重復三次，結果以X±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01vs control(ANOVA and Student’s-t test).
圖6為Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞的Bax、Bad和phospho-cdc2影響。
以6×105/孔的B16F1細胞接種于35毫米培養皿，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(10μM)和足葉乙甙(0.5μM)，繼續培養24h，收集細胞并提取總蛋白，進行Western Blotting分析Bax、Bad和phospho-cdc2表達，以actin做內參。
具體實施例方式
1.蔗糖酯類化合物的提取分離其中化合物1-5(smiglasideA-E)，及6和7可從土茯苓的根莖中提取分離得到，化合物8-11(helonioside A-D)可從新鮮的云南碘泡蟲株中提取分離得到，化合物12-15可從穿葉蓼中提取分離得到，化合物16可從大米中提取分離得到，化合物17可從蕓香中提取分離得到，化合物18可從印度百合的鱗莖中提取分離得到，化合物19-21可從鐵炮百合的鱗莖中提取分離得到，化合物22-26可從日本鹿子百合中提取分離得到，化合物27可從杏美人郁金香非成熟的花粉囊中提取分離得到，化合物28可從姜芋(蕉藕)的曬干根莖中提取分離得到，化合物29及30可從蟬翼藤莖中提取分離得到，化合物31-33可以從馬藍材中提取分離得到，化合物34可從植物遠志的根中提取分離得到，化合物35和36可從黃楊小喬木(P.chamaebuxus)的樹干中提取分離得到，化合物37-39可從黑三棱中提取分離得到。
各化合物提取分離方法相似，簡述如下取干燥或新鮮的提取原料，甲醇回流提取三次，得甲醇提取液，經減壓濃縮后，分別用3倍量石油醚和3倍量乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯萃取液用正相硅膠柱層析，用氯仿甲醇梯度洗脫得到不同組分。各組分再通過反復柱層析得到各種所需成分，我們對這些成分的抗腫瘤活性進行了研究。
2.蔗糖酯類化合物的藥理實驗1)細胞增殖抑制作用取對數生長期的鼠源黑色素瘤細胞株B16F1細胞，計數后，分別以2×104個細胞接種于60毫米的培養皿，預貼壁18小時。分別與提取獲得的蔗糖酯類化合物(10μM和100μM)共同培養，同時聯合0.4μM的足葉乙甙(etoposide)培養。培養5天后，用臺盼蘭染色計數活細胞，計算B16F1細胞的生存率。
此外，以不同終濃度的smiglaside E(3μM，10μM，30μM和100μM)，同時聯合足葉乙甙(0.2μM和0.4μM)和阿霉素(doxorubincin)(5nM和10nM)培養。繼續培養5天后，胰酶消化B16F1細胞，并用臺盼蘭染色計數活細胞。
2)細胞凋亡的檢測取對數生長期的B16F1細胞，以每孔1.5×105個細胞接種于24孔培養板，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(3μM和10μM)和足葉乙甙(0.5μM)，培養24小時后，消化并收集各組細胞，PBS洗滌后，把細胞懸浮于100μl的1×binding buffer中，分別加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PI(propidium iodide)，室溫避光孵育15分鐘后，每管補足400μl的1×binding buffer后，流式細胞儀(FCM，flow cytometer)檢測分析。
3)線粒體膜電位的檢測細胞處理同上，在5×105/100μl細胞懸液中加入1μl的5mM的JC-1(5，5’，6，6’-tetrachloro-1，1’，3，3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)，室溫避光孵育30分鐘后，每管補足400μl PBS，FCM檢測在FL-1通道綠色熒光變化情況。
4)Caspase-3/7活性的檢測把5×103/孔B16F1細胞接種于96孔培養板，每組三復孔，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(10μM)和足葉乙甙(0.5μM)，繼續培養18h。用Apo-ONEhomogeneous caspase-3/7檢測試劑盒(Promega，USA)檢測，即加入caspase-3/7底物Z-DEVD-R110，室溫避光孵育6h，用熒光酶標儀485nm激發，530nm檢測。
5)細胞周期的檢測取對數生長期的B16F1細胞，以每孔1.5×105個細胞接種于24孔培養板，待細胞完全貼壁后分別加入smiglaside E(3μM、10μM和30μM)和足葉乙甙(0.2μM)，培養24h后收集細胞，PBS洗滌兩次后，加入1ml 75％的乙醇4℃固定2h待測。檢測時把已固定的細胞用PBS洗滌兩次，并重懸至PI染色試劑中(0.05mg/ml propidiumiodide，1mg/ml RNase A和0.05％Triton X-100)，室溫避光孵育30分鐘，用PBS補足400μl，FCM檢測分析。
6)Western Blotting對蛋白水平的檢測收集B16F1細胞，PBS洗滌兩次后，加入100μl的細胞裂解液50mMTris pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，5mM EDTA，0.1mM phenylmethylsulfonylfluoride，0.15U/ml aprotinin，1μg/ml pepstatin and 10％glycerol)，冰浴1h，14000g離心，4℃2min，取上清。用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白含量(PIERCE，USA)。制備12.5％的SDS-PAGE膠，以30μg的蛋白量上樣，4℃低溫下電泳，恒定電流20mA，時間為1.5h。電泳結束后，用半干法轉至PVDF(Millipore，USA)。轉膜完成后用麗春紅S(0.5％ponceaus Sin1％acetic acid)染色，直至紅的條帶出現。根據預染maker(PIERCE，USA)將膜剪成所需大小，用0.1M的NaOH洗除麗春紅S。膜用阻斷液(2％free fatmilk in 10mM Tris-Cl，50mM NaCl，0.1％Tween20，pH7.4)阻斷，4℃過夜。過夜后，膜用洗滌溶液(10mM Tris-Cl，50mM NaCl，0.1％Tween20，pH7.4)洗滌三次，每次10分鐘。膜與適當稀釋的一抗anti-phospho-cdc2(Cell Signaling)，anti-Bad，anti-Bax(R&DSystems)and anti-actin(Santa Cruz Biotechnology)共孵，4℃過夜；之后同法洗滌三次，與適當稀釋的二抗共孵，室溫2h，膜同法洗滌三次，用ECL檢測試劑盒(PIERCE，USA)進行化學發光反應5分鐘。膜與X-感光膠片在暗盒曝光。
3.蔗糖酯類化合物藥理實驗結果分析1)蔗糖酯類化合物及蔗糖酯類化合物聯合足葉乙甙或阿霉素對B16F1細胞增殖抑制的影響如圖1所示，smiglaside E(3μM，10μM，30μM和100μM)劑量依賴性地抑制了小鼠黑色素瘤細胞B16F1的增殖，生存率分別是97.45±7.30％，88.54±10.54％，62.76±5.46％和26.80±4.22％。與此同時，smiglaside E還可顯著增強足葉乙甙(0.2μM和0.4μM)(圖1A)和阿霉素(5nM和10nM)(圖1B)對B16F1細胞增殖的抑制作用。足葉乙甙(0.2μM和0.4μM)對B16F1細胞的生存率為89.44±11.85％和62.92±6.70％，聯合30μM的smiglaside E后，生存率為33.59±2.67％和4.31±0.72％。阿霉素(5nM和10nM)對B16F1細胞的生存率為79.60±8.96％和48.12±10.44％，聯合30μM的smiglaside E后，生存率為28.35±3.19％和2.21±1.86％。這一結果顯示，smiglaside E不僅能單獨抑制腫瘤細胞的增殖，而且能夠顯著地增強一些化療藥物對腫瘤的抑制作用。
2)Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞凋亡的影響如圖2所示，smiglaside E(5μM和10μM)可劑量依賴性地誘導B16F1細胞凋亡，Annexin V陽性細胞從正常對照的8.2％分別增加至16.2％和17.8％。此外，smiglaside E還可顯著增強足葉乙甙誘導B16F1細胞凋亡的作用，特別在10μM smiglaside E的作用下，B16F1細胞中Annexin V陽性細胞從單獨0.5μM足葉乙甙作用下的16.1％增加至39.6％。
3)Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞線粒體膜電位的影響如圖3所示，smiglaside E(5μM和10μM)可劑量依賴性地降低B16F1細胞線粒體膜電位，線粒體膜電位低的細胞從正常對照的5.0％增加到27.8％和41.9％。且smiglaside E還可以劑量依賴性增強足葉乙甙促進B16F1細胞線粒體膜電位降低的作用，在5μM和10μM smiglaside E的作用下，線粒體膜電位低的B16F1細胞從單獨0.5μM足葉乙甙作用下的35.5％分別增加至52.1％和73.5％。表明smiglaside E促進凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑作用的。
4)Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞caspase-3/7活性的影響如圖4所示，smiglaside E(10μM)不僅能夠單獨誘導B16F1細胞caspase-3/7活性，而且能夠顯著增強足葉乙甙(0.5μM)誘導的B16F1細胞caspase-3/7活性，進一步證實smiglaside E的主要是通過促進腫瘤細胞凋亡發揮作用。
5)Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞周期的影響幾乎所有的臨床化療藥的藥理作用都是通過誘導細胞周期阻滯，而引起細胞發生凋亡，如圖5A所示，不同濃度smiglaside E(3μM，10μM和30μM)對細胞周期影響不大，但可以劑量依賴性增強足葉乙甙(0.2μM)誘導G2/M周期阻滯，降低G1期細胞的比率，而對S期的阻滯無明顯影響(圖5B)。
6)Smiglaside E及Smiglaside E聯合足葉乙甙對B16F1細胞的Bax、Bad和phospho-cdc2影響如圖6所示，smiglaside E(10μM)和足葉乙甙(0.2μM)單獨作用B16F1細胞可促進前凋亡蛋白Bax表達，當兩者聯合應用時，可顯著增強Bax和Bad的表達，以及增加周期蛋白cdc2的磷酸化。
以上結果提示，本發明有益效果為蔗糖酯類結構化合物具有明顯的抗腫瘤活性，并能顯著增強臨床化療藥物的藥理活性。故其可作為抗腫瘤藥物在肺癌、胃癌、直腸癌、膀胱癌、鼻咽癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和白血病等各種腫瘤疾病治療中應用；同時，蔗糖酯類結構化合物可以顯著增強足葉乙甙、阿霉素、5-FU、紫杉醇和長春新堿等臨床化療藥物的藥物活性，也可以作為化療增敏劑在臨床應用。
從以上實驗表明Smiglaside E可劑量依賴性地抑制B16F1細胞的增殖。此外，Smiglaside E還可以顯著增強足葉乙甙和阿霉素抑制腫瘤細胞B16F1增殖的藥理作用。
綜上所述Smiglaside E可劑量依賴性地誘導B16F1細胞凋亡，并能顯著增強足葉乙甙誘導B16F1細胞凋亡的藥理作用。
Smiglaside E可劑量依賴性地降低B16F1細胞的線粒體膜電位，并能顯著增強足葉乙甙誘導B16F1細胞線粒體膜電位降低的藥理作用。
Smiglaside E可增強B16F1細胞內caspase-3/7活性，并能顯著增強足葉乙甙上調B16F1細胞caspase-3/7活性的藥理作用。
Smiglaside E可誘導B16F1細胞上調前凋亡蛋白Bax和Bad，并能顯著增強足葉乙甙上調B16F1細胞內Bax和Bad分子表達水平的藥理作用。
Smiglaside E(3μM、10μM和30μM)可劑量依賴性的增強足葉乙甙誘導B16F1細胞G2/M期的細胞周期阻滯，而本身對B16F1細胞的周期影響不大。
在分子水平上，Smiglaside E能顯著增強足葉乙甙誘導的B16F1細胞內周期相關蛋白cdc2磷酸化水平的藥理作用。
用所述的39個化合物(包括化合物5Smiglaside E)進行細胞增殖抑制作用實驗，結果表明所述的39個化合物都可劑量依賴性地抑制B16F1細胞的增殖。此外，這39個化合物還可以顯著增強足葉乙甙抑制腫瘤細胞B16F1增殖的藥理作用，實驗結果見表1。
表1.蔗糖酯類化合物單獨作用及與足葉乙甙聯合應用對腫瘤細胞B16F1生存率的影響
權利要求
1.蔗糖酯類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所述的蔗糖酯類化合物是具有如下結構的39個化合物
其中
的結構。
全文摘要
本發明研究了39個蔗糖酯類化合物，結果表明它們對鼠源黑色素瘤細胞株B16F1細胞有明顯的增殖抑制作用，它們與足葉乙甙聯合應用時能顯著地增強足葉乙甙對B16F1細胞的抑制作用，因此它們可以在制備抗腫瘤藥物中應用。
文檔編號A61P35/00GK1883490SQ20061004070
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月29日 優先權日2006年5月29日
發明者徐強, 陳婷, 錢峰 申請人:南京大學