本發明屬于天然產物領域，具體涉及五個大環內酯類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。

背景技術：
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長期以來，惡性腫瘤已成為嚴重危害人類生命和生活質量的主要疾病之一。據報道，惡性腫瘤已經成為我國居民首要死因，而且，隨著經濟的發展以及人們對環境保護的不力，惡性腫瘤的致死率還在不斷增長。世界衛生組織預測，到2020年，將有2000萬新發惡性腫瘤病例，其中死亡人數達1200萬，且絕大部分將發生在發展中國家。對于惡性腫瘤的治療，天然產物及其衍生物藥物發揮著重要作用。據報道，1981年到2008年間，天然產物來源的抗腫瘤藥物占上市抗腫瘤藥物的60％以上，而且，新型天然產物及其衍生物作為新的抗腫瘤藥物所占數量還在不斷增加。

技術實現要素：
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本發明的第一個目的是提供五個具有抗腫瘤活性的大環內酯類化合物及其藥用鹽。

本發明的大環內酯類化合物或其藥用鹽，其結構如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示：

式(Ⅰ)中，化合物1：β-OH；或化合物2：α-OH；或式(Ⅱ)中，化合物3：β-OH；或化合物4：α-OH；或式(Ⅲ)中，化合物5。

本發明人通過對海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89發酵提取物的HPLC-DAD圖譜分析，發現其所產次級代謝產物紫外吸收特征鮮明，通過搖床放大發酵和提取純化，得到5個紫外吸收基本一致的同類化合物。經結構分析，其被確定為大環內酯類化合物，具體結構如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示，化合物1：β-OH；或化合物2：α-OH；或式(Ⅱ)中，化合物3：β-OH；或化合物4：α-OH；或式(Ⅲ)中，化合物5。

通過對化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的抗腫瘤活性評價，發現化合物1-5對人肺癌(A549)、人鼻咽癌(CNE2)、人宮頸癌(HeLa)、人肝癌(HepG2)、人乳腺癌(MCF-7)具有明顯抑制作用。

因此，本發明的第二個目的是提供化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5在制備抗腫瘤藥物中的應用。

優選，所述的抗腫瘤藥物為抗人肺癌、人鼻咽癌、人宮頸癌、人肝癌或人乳腺癌的藥物。

本發明的第三個目的是提供一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包括有效量的作為活性成份的如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5，或其藥用鹽，和藥學上可以接受的載體。

優選，所述的抗腫瘤藥物為抗人肺癌、人鼻咽癌、人宮頸癌、人肝癌或人乳腺癌的藥物。

本發明的第四個目的是提供一種制備化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的方法，其特征在于，所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5是從海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發酵產物中制備分離得到的。

優選，具體步驟如下：

A、制備海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發酵產物；

B、將海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發酵產物進行離心分離，獲得發酵液和菌絲體，發酵液用丁酮萃取，丁酮萃取液濃縮得發酵液浸膏；菌絲體用丙酮萃取，丙酮萃取液經濃縮得菌體浸膏，該浸膏用硅膠分離，采用氯仿/甲醇從100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,80/20,50/50,0/100,v/v梯度洗脫順序得9個組分A1-A9；

氯仿/甲醇94/6洗脫得餾份-組分A4用氯仿/甲醇100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,v/v梯度洗脫順序得6個組分B1-B6，氯仿/甲醇96/4洗脫得餾份-組分B3用氯仿/甲醇100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,v/v得5個組分C1-C5；

氯仿/甲醇92/8洗脫得餾份-組分A5、氯仿/甲醇94/6洗脫得餾份-B4合并，然后用石油醚/乙酸乙酯P/E，80/20,70/30,60/40,55/45,50/50,40/60,30/70,20/80,v/v梯度洗脫順序得到組分D1-D8，合并氯仿/甲醇94/6洗脫得餾份-組分C4、石油醚/乙酸乙酯40/60洗脫得餾份-D6和石油醚/乙酸乙酯30/70洗脫得餾份-D7，經高效液相純化得到化合物5，合并組分氯仿/甲醇98/2洗脫得餾份-C2和氯仿/甲醇96/4洗脫得餾份-組分C3，經高效液相純化得到化合物1、化合物4、化合物3和化合物2。

所述的制備海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發酵產物是以海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89作為發酵菌株在放大發酵培養基中培養得到海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的發酵產物；所述的放大發酵培養基，按總質量分數100％計，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，粗海鹽3％，pH 7.2-7.4，余量為水。

本發明的大環內酯類化合物-化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，可以用于制備抗腫瘤藥物，用于治療腫瘤，因此本發明為開發新的抗腫瘤藥物提供了備選化合物，對開發中國海洋藥物資源具有重要的意義。

本發明的海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89于2016年11月22日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其保藏編號為：CGMCC NO.13322。

附圖說明：

圖1是化合物2-5的¹H-¹H COSY和部分HMBC相關信息，其中2代表化合物2，3代表化合物3，4代表化合物4，5代表化合物5。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5的制備和結構鑒定

一、如式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4或化合物5的制備

1.種子培養：

(1)種子培養基配方：按質量分數100％計，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，粗海鹽3％，pH 7.2-7.4，余量為水。按照配方將上述物質混合在一起，配好后分裝于250mL的錐形瓶中，每瓶裝50mL，121℃滅菌20分鐘，做為備用的種子培養基。

(2)種子的培養：將海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89的菌絲體或孢子接入到上述種子培養基中，以200rpm的轉速、在28℃下、搖床培養36小時得種子培養液。

2.放大發酵培養：

(1)放大發酵培養基配方：按總質量分數100％計，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，CaCO₃ 0.2％，粗海鹽3％，pH 7.2-7.4，余量為水。按照配方將上述物質混合在一起，分批配好后共計21.8L放大發酵培養基，配好后分裝于1000mL的錐形瓶中，每瓶裝200mL，121℃滅菌20分鐘，做為備用的放大發酵培養基。

(2)發酵培養：

在無菌操作下，將培養好的種子培養液分別接種于放大發酵培養基中，每1000ml錐形瓶(含200mL放大發酵培養基)接種一瓶種子培養液(50mL)。每50ml種子培養液接入裝有200mL放大發酵培養基的1000mL錐形瓶中，以200rpm的轉速、在28℃下、搖床培養7天得海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89發酵產物。

3.提取分離：

將上述海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO ZJ89發酵產物，以3600rpm離心，得上清發酵液和沉淀菌絲體。上清發酵液用丁酮等體積萃取3次，丁酮萃取液在低于40℃減壓濃縮得發酵液浸膏；沉淀菌絲體用共計3L丙酮反復萃取三次，丙酮萃取液在低于40℃下減壓濃縮得菌體浸膏；經HPLC-DAD檢測后，合并發酵液浸膏和菌體浸膏共計得約31.22g浸膏。該浸膏用100-200目硅膠分離，經拌樣、干法裝柱后，采用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,80/20,50/50,0/100,v/v)梯度洗脫順序得9個組分(A1-A9)。組分A4(氯仿/甲醇94/6洗脫的餾份)用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,90/10,v/v)梯度洗脫順序得6個組分(B1-B6)。組分B3(氯仿/甲醇96/4洗脫的餾份)用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4,94/6,92/8,v/v)得5個組分(C1-C5)。組分A5(氯仿/甲醇92/8洗脫的餾份)、B4(氯仿/甲醇94/6洗脫的餾份)合并，然后用石油醚/乙酸乙酯(P/E，80/20,70/30,60/40,55/45,50/50,40/60,30/70,20/80,v/v)梯度洗脫順序得到組分D1-D8。合并組分C4(氯仿/甲醇94/6洗脫的餾份)、D6(石油醚/乙酸乙酯40/60洗脫的餾份)和D7(石油醚/乙酸乙酯30/70洗脫的餾份)，以254nm波長做檢測、采用2.5ml/min的流速、以42/58(水/乙腈，v/v)用反相柱YMC-Pack ODS-A column(250×10mm,5μm)進行半制備高壓液相分離(SP-HPLC)洗脫，在保留時間為26min得到化合物5(39.9mg)，同樣，合并組分C2(氯仿/甲醇98/2洗脫的餾份)-C3(氯仿/甲醇96/4洗脫的餾份)，以254nm波長做檢測、采用2.5ml/min的流速、以40/60(水/乙腈，v/v)用反相柱YMC-Pack ODS-A column(250×10mm,5μm)進行半制備高壓液相分離(SP-HPLC)洗脫，將在17.8min、20.4min、22.7min、24.7min得到化合物1(139.1mg)、化合物4(3.7mg)、化合物3(3.6mg)和化合物2(14.3mg)。

二、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的結構鑒定

對化合物1、化合物2、化合物3和化合物4和化合物5進行結構分析測試，得到以下理化性質數據，其核磁數據如表1和2所示：

化合物1:白色無定形粉末；[α]²⁵_D-18.0(c12.1,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z490.3171[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3163)and 512.2986[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2983)。

化合物2:白色無定形粉末；[α]²⁵_D+14.1(c 3.0,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z 490.3161[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3169)and 512.2987[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2988)

化合物3:白色無定形粉末；[α]²⁵_D+41.1(c 2.6,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z 490.3162[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3163)and 512.2980[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2983)

化合物4:白色無定形粉末；[α]²⁵_D-35.8(c 3.1,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z 490.3161[M+H]⁺(calcd for C₂₈H₄₄NO₆,490.3163)and 512.2986[M+Na]⁺(calcd for C₂₈H₄₃NNaO₆,512.2983)

化合物5:白色無定形粉末；[α]²⁵_D-4.7(c 8.8,ethanol)；(+)-HR-ESI-MS m/z536.3566[M+H]⁺(calcd for C₃₀H₅₀NO₇,536.3582)and 558.3389[M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₄₉NNaO₇,558.3401)

表1：化合物1-3在CD₃OD.中的¹H(500MHz)和¹³C NMR(125HMz)數據

*Resonances overlapped

表2：化合物4-5在CD₃OD.中的¹H(500MHz)和¹³C NMR(125HMz)數據

化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的2D NMR相關信息如圖1所示：

根據以上理化數據分析可知，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的具體結構如式(Ⅰ)和(Ⅱ)所示。

式(Ⅰ)中，化合物1：β-OH；或化合物2：α-OH；或式(Ⅱ)中，化合物3：β-OH；或化合物4：α-OH；或式(Ⅲ)中，化合物5。

實施例2：

對實施例1的大環內酯類化合物-化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的抗腫瘤細胞的實驗。

采用國際通用的腫瘤細胞株，即：人肺癌細胞株(A549)、人鼻咽癌細胞株(CNE2)、人宮頸癌細胞株(HeLa)、人肝癌細胞株(HepG2)、人乳腺癌細胞株(MCF-7)和正常人肝細胞(L02)和正常人臍靜脈內皮細胞(Huvect-12)。試驗方法為CCK-8法：

1)細胞培養：根據細胞生長速度，將處于對數生長期的腫瘤細胞和正常細胞以100μL/孔接種于96孔板，貼壁生長24小時。

2)加樣品(藥品)：每孔加10μL不同濃度的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的培養基稀釋溶液，并設相應濃度的培養基溶媒對照及無細胞凋零孔。

3)加藥細胞培養：腫瘤細胞在37℃、5％的CO₂條件下培養48小時。

4)活性測試：經培養后的細胞，每孔加入10μL的CCK-8溶液，繼續培養2小時，酶標儀450nm波長測定OD值。以多柔比星、順鉑作為陽性對照。

5)活性報告。每株細胞系做五個平行實驗，實驗結果見表3：

表3：化合物1、2、3、4和5對腫瘤細胞株和正常細胞的的抑制作用(IC₅₀,μM)

^a陽性對照

上述實驗結果表明，化合物1、化合物2、化合物3和化合物4對腫瘤細胞有明顯抑制作用，尤其是化合物4，不但對腫瘤細胞的抑制活性明顯較強，而且相比于腫瘤細胞，對正常細胞的抑制活性明顯較弱，對正常細胞的毒性較小。

綜上所述，本發明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導化合物，對開發中國海洋藥物資源具有重要的意義。