專利名稱：二苯乙烯苷衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及何首烏中有效單體2，3，5,4'-四羥基二苯乙烯 -2-CH3-D-葡萄糖苷的分離純化工藝；還涉及2，3,5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-|3-0-葡萄糖苷的晶體及其制備方法，以及以其為主要成分的藥物組合物。
背景技術(shù)：
何首烏為蓼科植物何首烏(pllygonummultiflorumThunb.)的塊根，為常用中藥，藥用歷史悠久，國內(nèi)外的大量研究結(jié)果表明何首烏具有免疫調(diào)節(jié)，保肝，抗氧化，抗腫瘤、降血脂等多方面藥理活性。隨著研究的深入，對其化學(xué)成分的研究也越來越清晰，大量研究表明，何首烏中的起主要作用的是2，3，5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(以下簡稱二苯乙烯苷)。二苯乙烯苷的生 理活性主要有抗衰老作用、降血脂作用、保肝護肝作用、改善記憶功能、抗 腫瘤作用等(參見魯堅、侯雙秋等，二苯乙烯苷的研究進展，安徽化工，2006(3)， 10~13)。中國專利ZL01134284.6中公開了二苯乙烯苷在治療癡呆癥中的應(yīng)用。 中國專利申請CN01134283.8中公開了二苯乙烯苷在治療缺血性腦血管疾病中的 應(yīng)用。隨著二苯乙烯苷的藥用功效不斷被發(fā)現(xiàn)，工業(yè)上希望獲得大量的適合藥用 的二苯乙烯苷原料，所述適合藥用的二苯乙烯苷原料至少應(yīng)該具備較高的純度 和制備制劑所要求的物理性質(zhì)。但由于工藝水平的限制，高純度二苯乙烯苷的 分離純化仍然一直處在實驗室極少量制備的水平，未見有適合工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模 的高純度二苯乙烯苷制備工藝的報道，因此，開展適合藥用的二苯乙烯苷的分 離純化工藝研究具有重要意義。目前，現(xiàn)有技術(shù)中主要采用高效液相色譜法、結(jié)晶法、樹脂柱等方法來制 備高純度的二苯乙烯苷。高效液相色譜法雖然能夠得到純度極高的二苯乙烯苷，但其純化效率難以 提高，純化成本也相對較高，因而此法主要用于實驗室制備，難以應(yīng)用于工業(yè) 化生產(chǎn)。班翊等人公開了一種結(jié)晶精制二苯乙烯苷的方法(參見班翊、劉其禮、金悠等，二苯乙烯苷的穩(wěn)定性研究，中草藥，2004， 35(11)， 1235~1237)。該方法 利用乙醇回流法所得的何首烏浸膏，用適量蒸餾水稀釋后以等量乙醚萃取3次， 分離出水層；水層用兩倍體積的醋酸乙酯熱回流5 6小時，收集醋酸乙酯層， 減壓濃縮至原體積的1/10，室溫靜置，析晶，濾過，得粗品。粗品于適量熱水 或熱醋酸乙酯中溶解，趁熱濾過，放冷析晶，如此反復(fù)結(jié)晶，得灰色無定型結(jié) 晶粉末，mp.l62 163'C，經(jīng)分析，二苯乙烯苷純度為99.94%。此法雖能夠得到 純度很高的二苯乙烯苷產(chǎn)品，但需反復(fù)多次結(jié)晶，工藝繁瑣，有機溶劑消耗量 大，資源利用率低，而且要用到乙醚等易燃易爆的試劑，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。另一些文獻公開了采用大孔吸附樹脂分離純化二苯乙烯苷的方法(參見朱 海升等，大孔吸附樹脂分離純化何首烏有效成分二苯乙烯苷的研究，解放軍藥 學(xué)學(xué)報，2006， 22(4)， 269 273和呂麗爽等，大孔樹脂純化何首烏中二苯乙烯苷 的工藝研究，食品科學(xué)，2005， 6(26)， 178-181)。這些文獻也都是基于實驗室 研究所進行的基礎(chǔ)研究，所用的樹脂量一般也只有幾克，和工業(yè)化生產(chǎn)工藝還 無法相比，而且制得的二苯乙烯苷純度也遠(yuǎn)未達(dá)到單體的質(zhì)量要求。另外，中國專利ZL98120290.X公開了一種制備二苯乙烯苷的方法，該方法 將用于分離純化的層析柱進行破壞性切割，再進行取樣分離，過程煩瑣，成本 極高，也是典型的實驗室制備微量樣品的方法，無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本發(fā)明提供了一種二苯乙烯苷的提取分離方法，此法操作簡便，成本低廉， 收率穩(wěn)定，完全能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的需求，制得的二苯乙烯苷純度在保 證低成本和高收慮的同時，能獲得高純度的二苯乙烯苷結(jié)晶，達(dá)到了工業(yè)化生 產(chǎn)的要求。此外本發(fā)明還提供一種新物理形態(tài)的二苯乙烯苷，以及含有該形態(tài) 的藥物組合物，新的物理形態(tài)具有更適宜制備制劑的物理性質(zhì)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種提取分離結(jié)構(gòu)如式l的化合物的方法，所述的 提取分離方法如下式Ia) 提取取何首烏藥材，酌于碎斷，加入一定量的水、甲醇、乙醇中的一種或一種以上溶劑組成的混合溶劑，調(diào)節(jié)提取液的pH至7.0-8.0，加熱提取1 4次， 每次1 3小時，加熱溫度為4(TC 回流溫度，合并提取液，放冷，過濾。其中提 取溶劑優(yōu)選水；調(diào)節(jié)提取液pH值的可以是酸、堿或鹽，優(yōu)選氫氧化鈉、亞硫酸 鈉、亞硫酸氫鈉、碳酸鈉，最優(yōu)選為亞硫酸鈉；提取液的pH值優(yōu)選為7.5;加 熱提取優(yōu)選提取3次，每次1.5小時。b) 分離將上述提取液過大孔樹脂柱，加水充分洗脫去除提取液中的無機鹽及 其它雜質(zhì)后，改用一定濃度的有機溶劑洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液。大 孔樹脂的型號可以為HPD-400、 HPD-IOO、 AB-8、 D1300，優(yōu)選的大孔樹脂型號 為HPD-400;洗脫溶劑可以為乙醇、甲醇或丙酮，優(yōu)選為乙醇，更優(yōu)選濃度為 70°%的乙醇。c) 萃取將洗脫液在60 80'C下減壓濃縮至原洗脫液體積的1/10^1/30 (V/V)， 如濃縮液體積較小可以加入適量的水，加入濃縮液體積1 2倍的石油醚、乙醚、 氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取24次，收集有機層萃取液，將有機層萃取液減 壓濃縮至干，得到固體粗提物；優(yōu)選將洗脫液濃縮至原體積的1/20。萃取所用 的有機溶劑優(yōu)選乙酸乙酯；優(yōu)選用濃縮液體積的1倍的有機溶劑萃取3次。d) 純化上述粗提物溶于適量的有機溶劑，過層析柱，選用適當(dāng)溶劑進行洗脫， 收集含二苯乙烯苷成份的洗脫液，濃縮，干燥，得二苯乙烯苷粗品。層析柱的 填料可以為硅膠或氧化鋁，優(yōu)選氧化鋁；目數(shù)是100-200目或200-300目，優(yōu)選 為200-300目；柱層析前溶解粗提物所用溶劑可以是丙酮、乙醇、乙酸乙酯，優(yōu) 選為乙醇；柱層析過程中所用洗脫液可以是丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或氯 仿中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑，優(yōu)選為乙酸乙酯。e) 結(jié)晶將上述二苯乙烯苷粗品在丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種 或幾種溶劑組成的混合溶劑中加熱溶解，優(yōu)選的結(jié)晶溶劑為丙酮水乙酸乙 酯的混合溶劑，其比例為1~10: 5~20: 1 10 (V:V:V)，最優(yōu)選丙酮水乙酸 乙酯為2:10: l(V:V:V)，結(jié)晶溶劑的用量是為二苯乙烯苷粗品的1 10倍(V/W)， 優(yōu)選的溶劑用量為二苯乙烯苷粗品的5倍(V/W)，活性炭脫色，過濾，靜置析 晶，結(jié)晶溫度為-20 10。C，優(yōu)選為-10 5。C，最佳溫度為-4。C，過濾，干燥，即 得到高純度的二苯乙烯苷。本發(fā)明的二苯乙烯苷提取物以高效液相色譜法檢測其純度可達(dá)到90%以 上，優(yōu)選在95%以上，最優(yōu)選985^以上。本發(fā)明中二苯乙烯苷的含量測定采用高效液相色譜(HPLC)法進行。其中 使用的2,3，5,4，-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷對照品購于中國藥品生物制 品檢定所；使用的流動相為乙腈水=15: 85;檢測器為JASW UV-1575;流 速為lmL/min;色譜柱采用Agilent Extend C-18 (4.6mmx250mm，5Mm);柱溫為 30'C，具體測試方法如下 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密稱取2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷對照品5.15 mg，用水 溶解并定容至100 ml，配成對照品儲備液，分別取儲備液1 ml， 2 ml， 4 ml， 6 ml， 8 ml，各自加水定容至10ml，分別取上述各濃度的對照品溶液20nJ,依次注入 色譜儀，得到表一所示的峰面積數(shù)據(jù)，由此制得表二所示的二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)曲 線，可見進樣量與峰面積間呈良好的線性關(guān)系。線性范圍5 50|xg/ml 回歸方程為Y=80909X+19722 相關(guān)系數(shù)R-0.9992表一 二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積數(shù)據(jù)濃度(嗎/ml)5.1510.3020.6030.卯41.20峰面積(mv/s)4157978881281706896244592233921922. 二苯乙烯苷樣品的含量測定方法準(zhǔn)確稱取二苯乙烯苷對照品(簡稱對照品)和自制的二苯乙烯苷樣品(簡 稱供試品)各20.00mg,分別用水溶解，并定容至100ml，各取1 ml加水稀釋 定容至10ml，得到對照品溶液和供試品溶液。分別吸取上述兩種溶液各20^1 依次注入色譜儀，記錄峰面積，運用外標(biāo)法計算，得到供試品中二苯乙烯苷的 含量。本發(fā)明的二苯乙烯苷和二苯乙烯苷對照品(購于中國藥品生物制品檢定所) 的高效液相色譜圖如附圖5和附圖6所示。本發(fā)明的另一個目的在于提供二苯乙烯苷的新型晶體及其制備方法，本發(fā)明的再一個目的在于提供含有所述的二苯乙烯苷晶體的藥物組合物。本發(fā)明的二苯乙烯苷晶體基本不含水和其它有機溶劑，其X-射線粉末衍射 光譜圖(該圖譜是在X、TRA-X射線衍射儀上用Cu-Ka輻射測量)，在d值為 4.772、 4.471、 3.678、處有衍射峰，典型的在14.572、 12.200、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622處有衍射峰，更典型的在14.572、 12.200、 7.320、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622、 3.343、 2.384處有衍射峰。本發(fā)明的二苯乙烯苷晶體的差示掃描量熱分析(采用NETZSCHDSC 204 Fl 儀器)，以10K/分鐘的速率升溫，其吸收熱轉(zhuǎn)變峰值約為178°C。本發(fā)明的二苯乙烯苷晶體用KBr壓片測定的紅外吸收光譜在3333cm—1 (寬 峰)、1607cm—、 1593cm"、 1515cm"處有吸收峰。本發(fā)明的二苯乙烯苷晶體的熱失重分析圖譜如附圖4所示。本發(fā)明的二苯乙烯苷晶體可由如下方法制備將二苯乙烯苷粗品或純品在 丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑中加熱 溶解，優(yōu)選的結(jié)晶溶劑為丙酮水乙酸乙酯的混合溶劑，其比例為1 10: 5 20:1 10 (V:V:V),最優(yōu)選丙酮水:乙酸乙酯為2: 10: 1 (V:V:V)，結(jié)晶溶劑的 用量是為二苯乙烯苷粗品的1 10倍(v/w)，優(yōu)選的溶劑用量為二苯乙烯苷粗 品的5倍(V/W)，活性炭脫色，過濾，靜置析晶，結(jié)晶溫度為-2(Kl(TC,優(yōu)選 為-10~5匸，最佳溫度為-4t:，過濾，干燥，即得到高純度的二苯乙烯苷結(jié)晶。根據(jù)上述步驟制得的二苯乙烯苷晶體，還可以與適當(dāng)?shù)乃幱幂o料混合，制 成一定形式的組合物，包括片劑、膠囊、滴丸、軟膠囊、注射液或其它適于施 用的制劑形式，以方便臨床上施用。本發(fā)明提供了一種含量高、成分明確、質(zhì)量可控、藥效確切、副作用小的 新型二苯乙烯苷結(jié)晶及其制備方法，二苯乙烯苷結(jié)晶不同于無定型的二苯乙烯 苷，其更穩(wěn)定，同時溶解度和生物利用度都不同，其中二苯乙烯苷結(jié)晶更容易 制備成藥劑。所以本發(fā)明包括了含有高純度二苯乙烯苷結(jié)晶的藥物組合物，該 藥物組合物在治療高血脂癥、動脈粥樣硬化、抗氧化等效果明顯。本發(fā)明的制 備工藝已經(jīng)通過多批生產(chǎn)驗證，證明其重復(fù)性、穩(wěn)定性都好，并且總收率高， 只需一步結(jié)晶，既適合于工業(yè)化大生產(chǎn)又降低了生產(chǎn)的成本。本發(fā)明所提供的 方法制備的二苯乙烯苷純度高，雜質(zhì)少，不但改善了中成藥常有的服用劑量大、 成分不明確等缺點，而且其在臨床上藥效顯著，具有很好的適用性。


圖l 二苯乙烯苷晶體的x射線粉末衍射光譜圖。圖2 二苯乙烯苷晶體的差示掃描量熱分析(DSC)圖譜。 圖3 二苯乙烯苷晶體的紅外吸收圖譜。 圖4 二苯乙烯苷晶體的熱失重分析(TGA)圖譜。 圖5 二苯乙烯苷晶體的高效液相色譜圖。圖6 二苯乙烯苷對照品的高效液相色譜圖。 圖7 二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實施例方式以下非限制性實施例是為了更好地說明本發(fā)明所提供的新型高純度二苯乙 烯苷晶體的制備方法，并不意味著對本發(fā)明的任何限制。下列實施例中，所用的提取用水為自來水；所用乙醇為藥用級；何首烏藥 材產(chǎn)地為安徽亳州中藥材市場；硅膠和氧化鋁均購自青島海洋化工有限公司。 實施例l取干燥的何首烏藥材100kg，切成l-3mm的薄片，裝入熱回流提取罐，加 入10倍量的水及亞硫酸鈉適量，調(diào)節(jié)提取液pH至7.6，加熱回流提取3次，每 次1小時，合并提取液，過濾，收集濾液。濾液過HPD-400大孔吸附樹脂柱， 加水500L洗脫后，加80%乙醇洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，總計200L， 于6(TC減壓濃縮至IOL，加入乙酸乙酯萃取3次，每次用量IOL， 60。C減壓濃縮 乙酸乙酯液至干，得二苯乙烯苷粗提物2.5kg。取上述粗提物，加入乙醇5.0L，加熱攪拌使其充分溶解，過濾，濾液過 200-300目中性氧化鋁層析柱，上柱完成后改用乙酸乙酯洗脫，薄層監(jiān)測，收集 含二苯乙烯苷組分的洗脫液，于5(TC減壓濃縮至干，得到二苯乙烯苷粗品1.82kg。取上述粗品，加入丙酮水乙酸乙酯(2: 10: 1， V/V/V) 9L, 60。C力口 熱至溶解，加入適量活性炭后，加熱回流15分鐘，趁熱過濾，濾液置-5'C條件 下靜置15小時，析晶充分后，過濾，干燥，得到白色二苯乙烯苷結(jié)晶1.28化8。 取上述樣品，用高效液相色譜法進行含量測定，二苯乙烯苷粗品含量為90.3%， 二苯乙烯苷結(jié)晶的含量為98.9%。實施例2取干燥的何首烏藥材100kg，粉碎成粗粉，裝入熱回流提取罐，加入8倍量的水及亞硫酸氫鈉適量，調(diào)節(jié)提取液pH至7.5，加熱回流提取2次，每次2 小時，合并提取液，過濾，收集濾液。濾液過HPD-100大孔吸附樹脂柱，加水 600L洗脫后，加70°/。乙醇洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，總計300L，于 70'C減壓濃縮至15L，加入正丁醇萃取2次，每次用量15L， 8(TC減壓濃縮，濃 縮正丁醇至干，得二苯乙烯苷粗提物2.3kg。取上述粗提物，加入乙酸乙酯8.0L，加熱攪拌使其充分溶解，過濾，濾液 過200-300目硅膠層析柱，上柱完成后改用乙酸乙酯丙酮(2: 1)洗脫，薄層 監(jiān)測，收集含二苯乙烯苷組分的洗脫液，于6(TC減壓濃縮至干，得到二苯乙烯 苷粗品1.60 kg。取上述粗品，加入水乙酸乙酯(20: 1， V/V) 8L， 6(TC加熱至溶解，加 入適量活性炭后，加熱回流5分鐘，趁熱過濾，濾液置-l(TC條件下靜置10小時， 析晶充分后，過濾，干燥，得到白色二苯乙烯苷結(jié)晶1.28kg，結(jié)晶為針狀，聚 集成簇。取上述樣品，用高效液相色譜法進行含量測定，二苯乙烯苷粗品含量 為91.1%， 二苯乙烯苷結(jié)晶的含量為99.6%。實施例3取干燥的何首烏藥材120kg，粉碎成粗粉，裝入熱回流提取罐，加入7倍 量的水及碳酸鈉適量，調(diào)節(jié)提取液pH至7.8，加熱回流提取3次，每次1.5小 時，合并提取液，過濾，收集濾液。濾液過AB-8大孔吸附樹脂柱，加水600L 洗脫后，加90%乙醇洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，總計320L，于70。C減 壓濃縮至20L，加入乙酸乙酯萃取3次，每次用量20L， 80。C減壓濃縮，濃縮乙 酸乙酯至干，得二苯乙烯苷粗提物2.92kg。取上述粗提物，加入丙酮12 L，加熱攪拌使其充分溶解，過濾,濾液過200-300 目中性氧化鋁柱，上柱完成后改用乙酸乙酯洗脫，薄層監(jiān)測，收集含二苯乙烯 苷組分的洗脫液，于5(TC減壓濃縮至干，得到二苯乙烯苷粗品1.9kg。取上述粗品，加入丙酮水乙酸乙酯(1: 10: 1， V/V/V) IOL， 50 。C加熱至溶解，加入適量活性炭后，加熱回流10分鐘，趁熱過濾，濾液置-(C條件下靜置20小時，析晶充分后，過濾，干燥，得到白色二苯乙烯苷結(jié)晶1.51kg，結(jié)晶為針狀，聚集成簇。取上述樣品，用高效液相色譜法進行含量測定，二苯乙烯苷粗品含量為92.8%, 二苯乙烯苷結(jié)晶的含量為99.9%。
權(quán)利要求
1. 一種提取分離結(jié)構(gòu)式如下的化合物的方法，所述的提取分離方法包括id="icf0001" file="A2007100204430002C1.gif" wi="67" he="51" top= "38" left = "68" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>a.取何首烏藥材，酌于碎斷，加入水、甲醇、乙醇中的一種或一種以上溶劑組成的混合溶劑，調(diào)節(jié)提取液的pH至7.0～8.0，加熱提取，放冷，過濾；b.將上述提取液過大孔樹脂柱，加水洗脫后，改用有機溶劑洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，大孔樹脂的型號可以為HPD-400、HPD-100、AB-8、D1300，洗脫溶劑可以為乙醇、甲醇或丙酮；c.將洗脫液減壓濃縮，加入石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取，收集有機層萃取液，將有機層萃取液減壓濃縮至干，得到固體粗提物；d.上述粗提物溶于有機溶劑，過層析柱，收集含二苯乙烯苷成份的洗脫液，濃縮，干燥，得二苯乙烯苷粗品，層析柱的填料可以為硅膠或氧化鋁，目數(shù)是100-200目或200-300目，柱層析前溶解粗提物所用溶劑可以是丙酮、乙醇、乙酸乙酯，柱層析過程中所用洗脫液可以是丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或氯仿中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑；e.將上述二苯乙烯苷粗品在丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑中加熱溶解，結(jié)晶溶劑的用量是為二苯乙烯苷粗品的1～10倍(V/W)，活性炭脫色，過濾，靜置析晶，結(jié)晶溫度為-20～10℃，過濾，干燥，即得二苯乙烯苷。
2. 權(quán)利要求
3. 權(quán)利要求
4. 權(quán)利要求
5. 權(quán)利要求
6. 權(quán)利要求
7. 權(quán)利要求步驟a中，提取溶劑為水。步驟b中，大孔樹脂型號為HPD-400。步驟b中，洗脫溶劑為乙醇。步驟c中，萃取所用的有機溶劑是乙酸乙酯。步驟d中，層析柱的填料為氧化鋁。步驟d中，柱層析過程中所用洗脫液為乙酸乙酯,
8. 權(quán)利要求l步驟e中，結(jié)晶溶劑為丙酮水乙酸乙酯為1 10: 5~20: 1~10的混合溶劑，溶劑用量為二苯乙烯苷粗品的5倍。
9. 一種基本不含水和其它有機溶劑的二苯乙烯苷晶體，其特征在于其X-射線 粉末衍射光譜圖在d值為4.772、 4.471、 3.678、處有衍射峰。
10. 權(quán)利要求9所述的二苯乙烯苷晶體，其X-射線粉末衍射光譜圖在d值為 14.572、 12.200、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622處有衍射峰。
11. 權(quán)利要求9所述的二苯乙烯苷晶體，以10K/分鐘的速率升溫，其差示掃描量 熱吸收熱轉(zhuǎn)變峰值約為178'C。
12. —種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求9、 lO或ll所述的二苯乙烯苷晶體(
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷晶體及其制備方法，以及含有該晶體的藥物組合物。高效液相色譜法測定所述晶體的含量為90～99.9％，所述方法是通過何首烏提取、有機溶劑萃取、柱層析分離及適當(dāng)溶劑中結(jié)晶等步驟，得到所述高純度的二苯乙烯苷晶體。本發(fā)明提供的制備工藝得率高，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K125/00GK101255180SQ20071002044
公開日2008年9月3日 申請日期2007年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日
發(fā)明者楊永安, 鴦 王 申請人:江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司