專利名稱：：具有抑制癌細胞效果的三七發酵液及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗癌組合物及其制備方法，尤其涉及一種抗癌三七乳酸菌發酵液及其制備方法。
背景技術：
：癌癥是全世界僅次于心血管疾病的第二大疾病，截至目前為止，除了少數癌癥，如直腸癌和乳癌可通過外科手術切除，或血癌可通過化學藥物獲得一定治療效果外，大多數的癌癥在癌細胞轉移時仍束手無策。目前國內的癌癥死亡率高達百分之二十六點八，平均每十四分零七秒就有一人死于癌癥。目前肝癌的治療方法主要有外科手術、放射療法、免疫療法、化學藥物療法和酒精局部注射等。大多數抗腫瘤藥物對于在人體中快速增生的癌細胞(如白血病、淋巴癌)具有較佳毒殺效果，但對于發展較緩慢的癌癥(如肝癌、肺癌)的治療效果則不佳；此外，許多抗腫瘤藥物對細胞選擇性較差，因此常有合并免疫抑制等不良副作用。因此，從傳統中草藥中尋找具有抗癌活性的天然植物成分，以輔助或取代西藥為目前研究的新方向。肝臟是腹腔內最大的器官，也是人體內體積最大的腺體，其重量約占成人體重的2.5%,具有代謝、儲存、解毒及合成血漿蛋白等多重功能。肝臟的功能單位為小葉(lobule)，由肝實質細胞和非實質細胞或間質細胞所組成。肝實質細胞(parenchymalcells)—般是指肝細胞(hepatocytes),而非實質細胞則包括竇內皮細月包(simisoidsendothelialcells)、星4夫細月包(stellatecells)禾口卡者月旨細月包(fat-storingcells)等。其中，肝細胞約占總肝細胞數的60-65%，且肝細胞細胞體積較大，因此肝細胞約占肝臟總體積的70-80%。肝癌即肝臟的惡性胂瘤，一般可分為二種一為源自于肝臟，稱為原發性肝癌，其中60%是由肝硬化轉變而來；二為身體其它部分擴散到肝臟的轉移性肝癌。依形態學來分，肝癌可分為三類塊狀型、結節型和彌漫型，其中以結節型最多。依組織學來分，肝癌可分為(l)肝細胞癌(H印atocellularcarcinoma),即慣稱的肝癌，占肝癌發生率的80%;(2)膽管癌(Cholanglocarcinoma)，占肝癌發生率的20%,多發于老人；(3)肝細胞膽管癌(Mixhepatocholangiocarcinoma)，較為少見；(4)肝原細胞癌(Hepatoblastoma),較為少見，多發于幼兒。臨床上治療肝癌的方法可分為手術切除(surgicalresection)或局部性治療，如經皮穿刺腫瘤內酒4青注射(percutaneousethanolinjection)、射頻燒灼治療(radiofrequencyablation)、,令凍療法(cryotherapy),以及樣i'波凝固治療(percutaneousmicrowavecoagulation)(Carr,2004;Labontetal"2000),大部分治療的方法成效不明顯。目前肝癌手術切除的成功率只有10-20%,術后五年的存活率在20-50%之間。即使是小于2公分的肝癌，在手術后五年復發的機率也是百分之百。另外，在抗肝癌藥物的使用方面，現有藥物多半毒性大、特異性小，并多半具免疫抑制等不良作用。Doxorubicin(Adriamycin)為化學治療使用藥物之一，屬于抗生素類，副作用為增力口罹患心月幾癥(cardiomyopathy)或心臟衰竭(congestiveheartfailure)的機率(Bristowetal.,1978;Minow,1975)、惡心、嘔吐、脫發，若外漏則可能造成周圍組織局部壞死現象。因此，除了積極開發較少副作用的新治療藥物外，另一方面則是研究如何由攝取天然飲食成分來達到保護肝臟健康、預防癌癥發生的目的。三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)，五力口科人參屬，性溫、味辛，傳統用于散癡止血、消腫定痛等，為中國傳統名貴藥材之一，目前已被證實具有鎮痛、護肝、抗發炎、抗血栓、降血壓、保護心肌和抗腫瘤等生理功效。其主要用藥部位為干燥根部，又稱蔘三七、田七、金不換等。三七具有抗血栓、降血壓、保護心肌、鎮痛、抗發炎、抗疲勞及保肝等功效，其活性物質包含皂脊(dammarane)、三七三酸甘油酯(trilinolein)、田七胺酸(dencichine)、三七多醣(sanchinan-A)、酵素(xylanase),口黃酉同類。三七具有護肝、治療肝病的功效，近年來日本和中國有許多保健產品以三七為主要成份。但是，三七中的皂苷會受到消化系統的代謝和吸收影響，而影響其功效。因此，需要提供一種能夠提升三七保肝、抗癌能力的方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種良好的抗癌化合物及其制備方法。為實現上述目的，本發明提供了一種發酵三七的方法，其包括以一培養基活化乳酸菌；將乳酸菌接種至三七培養液中發酵，以獲得發酵液；離心發酵液，取得上清液。為實現上述目的，本發明還提供了一種三七乳酸菌發酵液，由上述方法制備，其具有抑制癌細胞生長的能力。為實現上述目的，本發明另提供了一種預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其包括有效量的由上述方法制備的三七乳酸菌發酵液，以及一種藥學上可接受的載體或賦形劑。為了讓本發明的發明目的、特征和優點明顯易懂，現在結合具體實施方式和附圖，對本發明進行進一步詳細說明，其中圖la-lb所示為所有的三七乳酸發酵產物都具有抑制Hep3B或HepG2細胞的能力。圖2a-2b所示為混合與單一乳酸菌抗癌效果的對比。圖3a-3b所示為發酵溫度為32。C時，發酵產物的抗癌效果。圖3c-3d所示為發酵溫度為37。C時，發酵產物的抗癌效果。圖3e-3f所示為發酵溫度為42。C時，發酵產物的抗癌效果。圖4a-4b所示為pH值為3.5時，發酵產物的抗癌效果。圖4c-4d所示為pH值為4.5時，發酵產物的抗癌效果。圖4e-4f所示為pH值為5.5時，發酵產物的抗癌效果。圖5顯示黑豆粹取液可增加抗氧化效果。圖6a-6b顯示預先熱處理三七培養液可增強抗癌效果。圖7所示為三七發酵液對正常肝細胞的影響。圖8所示為三七發酵液對B型肝炎表面抗原的影響。圖9所示為動物實驗的結果。具體實施方式本發明提供一種發酵三七的方法，其包括活化乳酸菌；將乳酸菌接種至三七培養液中發酵，以獲得發酵液；離心發酵液，取得上清液。本發明發酵方法首先以一培養基活化乳酸菌，培養基可以為一般現有的培養基，如MRS或消化蛋白-酵母萃取液(peptone-yeastextractbase)等。乳酸菌可為嗜熱唾液鏈球菌(Streptococcussalivariussubsp.Thermophilus(BCRC12268))、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillushelveticus(BCRC14092))、雷曼氏乳酸桿菌(LactobacillusrhamnosusGG.(BCRC16000))、嗜酸性乳酸菌(Lactobacillusacidophilus(BCRC10695))、菲德氏-隆根菌(Bifidobacteriumlongum(BCRC14602))、鏈雙歧桿菌(Bifidobacteriumcatenulatum(BCRC14667》、短比非德氏菌(Bifidobacteriumbreve(BCRC11846))、雙叉乳酸桿菌(Bifidobacteriumbifidum(BCRC14615))或其組合。然后，將上述至少一種乳酸菌接種于三七培養液中發酵。在本發明中，可使用單一乳酸菌或混合乳酸菌，最好為混合乳酸菌。三七培養液的成份為10-30。/。(w/w)的三七粉末和70-90。/。(w/w)的蒸餾水，最好為10-15%(\￥~)的三七粉末和85-90。/。(w/w)的蒸餾水。三七依其根疣的大小可分為20頭、40頭或60頭，在本發明中，最好可以使用40頭以上的三七。發酵時間在1至7天之間，最好為1至3天。發酵溫度在25至42。C之間，較佳為30至40°C,最佳為35至37°C。發酵時的pH值在3.0至5.0之間，最好在3.5至4.5之間。應當注意的是，若pH值在5.5以上，則發酵產物就不具有抗癌效果。此外，在發酵的過程中，可適當攪拌培養液，以縮短發酵時間。發酵完成后，以高溫滅菌中止發酵，并離心過濾菌體和碳氮源固形物，取得本發明的發酵產物。在本發明的一個實施方式中，可添加其它活性物質(如黑豆或柴胡萃取液等)至三七培養液中，以增加發酵產物的生物活性，如抗氣化能力等。在本發明的一個實施方式中，可預先熱處理三七培養液，以增加發酵產物的抗癌效果。熱處理溫度在75。C以上，最好在100。C以上。熱處理時間在10分鐘以上，最好為20至180分鐘。本發明還提供了一種三七乳酸菌發酵液，由上述發酵流程制得。本發明的三七乳酸菌發酵液具有抑制癌細胞生長的能力，抑制率達60%以上。其中癌細胞可為乳癌細胞、前列腺癌細胞、血癌細胞、直腸癌細胞、子宮癌細胞、卯巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、子宮頸癌細胞、睪丸癌細胞、淋巴癌細胞、橫紋肌肉瘤細胞、神經母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞、肺癌細胞、腦部腫瘤細胞、皮膚癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、腎臟癌細胞或鼻咽癌細胞，較佳為肝癌細胞。本發明的組合物具有高度安全性，本發明的三七乳酸發酵液可抑制癌細胞的生長，且對正常細胞的毒性較小。本發明的三七發酵液對小鼠初代肝細胞的LD5o在900嗎/ml以上，最好在970嗎/ml以上。除了可抑制癌細胞的生長外，本發明的三七乳S臾發酵液還可抑制B型肝炎表面抗原(HBsAg)，其抑制效果隨著發酵時間而增加，水卩制率可達80%以上。此外，本發明另提供了一種預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其包括有效量的三七乳酸菌發酵液和一種藥學上可接受的載體或賦形劑。其中，癌癥可為乳癌、前列腺癌、血癌、直腸癌、子宮癌、卯巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦部腫瘤、皮膚癌、胃癌、肝癌、腎臟癌或鼻咽癌，較佳為肝癌。本發明的醫藥組合物具有抑制癌細胞生長的能力，抑制率達60%以上，本發明的醫藥組合物可為口服或注射劑型。本發明的醫藥組合物具有預防和/或治療癌癥的效果，因此可給藥至癌癥患者、接受化療或放療患者、癌癥高危險族群等。本發明的組合物具有高度安全性，不會對人體造成影響，可長期作為飲食補充品。本發明提供了一種三七乳酸發酵液及其制備方法，本發明的三七乳酸菌發酵液具有抑制癌細胞、B型肝炎表面抗原(HBsAg)的能力，且對正常細胞的毒性較小。此外，還可額外添加其它物質，以增加本發明發酵產物的生物活性，如抗氧化能力等。實施例1、三七培養液的制備將三七磨碎后，以120篩網取得三七粉未，將10g三七粉末加入90ml水中，以高溫滅菌釜滅菌20分鐘，獲得三七培養液。2、以乳酸菌發酵三七將乳酸菌接種至實施例1的三七培養液中，乳酸菌分別為嗜熱唾液鏈球菌(Streptococcussalivariussubsp.thermophilus(BCRC12268))、^)士享L酸4干菌(Lactobacillushelveticus(BCRC14092))、雷曼氏乳酸桿菌(LactobacillusrhamnosusGG.(BCRC16000))、嗜酸性乳酸菌(Lactobacillusacidophilus(BCRC10695))、菲德氏-隆根菌(Bifidobacteriumlongum(BCRC14602))、鏈雙歧桿菌(Bifidobacteriumcatenulatum(BCRC14667))、短比非德氏菌(Bifidobacteriumbreve(BCRCl1846)),初始菌數為104cfu/ml,在37。C下培養24或120小時后，以高溫滅菌中止發酵，離心過濾菌體和碳氮源固形物，取得發酵產物，并測試1000pg/ml的發酵產物對Hep3B和HepG2細胞的影響。以未經發酵的三七培養液作為對照組。請參照圖la-lb,所有的三七乳酸發酵產物都具有抑制Hep3B或HepG2細胞的能力，其中以瑞士乳酸桿菌(Lactobacillushelveticus)的效果較佳。3、單一乳酸菌和混合菌的對比本實施例的發酵流程與實施例2類似，但增加雙叉乳酸桿菌(Bifidobacteriumbifidum(BCRC14615))和8種混合乳酸菌發酵，并測試200嗎/ml的發酵產物對Hep3B和HepG2細胞的影響。請參照圖2a-2b,混合乳酸菌的抑制能力較單一乳酸菌高。4、發酵溫度對抑制癌細胞的影響本實施例的發酵流程與實施例2類似，僅改變發酵溫度。發酵溫度分別為32°C、37°C、42°C,并測試不同濃度的發酵產物(100嗎/ml、200嗎/ml、300嗎/ml)對H印3B和H印2G細胞的影響。請參照圖3a-3b,發酵溫度為32。C時，發酵2天的發酵物有最佳效果；請參照圖3c-3d,發酵溫度為37。C時，發酵3天的發酵物有最佳效果；請參照圖3e-3f,發酵溫度為42。C時，發酵3天的發酵物有最佳效果。5、酸堿值對抑制癌細胞的影響本實施例的發酵流程與實施例2相同，僅改變發酵時的酸石成值。發酵酸石成值分別為pH3.5、pH4.5、pH5.5，并測試不同濃度的發酵產物(l00pg/ml、200pg/ml、300嗎/ml)對Hep3B和Hep2G細胞的影響。請參照圖4a-4d,當pH值為3.5和4.5時，發酵2天的發酵物有最佳效果。請參照圖4e-4f，當pH值為5.5時，發酵物則不具有任何抗癌效果。6、黑豆粹取液對抗氧化的影響本實施例的發酵流程和實施例2相同，僅改變三七培養液的組成。組成分別為1/4三七粉+3/4黑豆粉、1/2三七粉+1/2黑豆粉、3/4三七粉+1/4黑豆粉、4/4三七粉，并測試發酵產物對Hep3B和Hep2G細胞的影響，且將維生素E的抗氧化能力設定為100。請參照圖5所示，發酵物抗氧化的能力隨著黑豆粉的i曾力口而i曽力口。7、熱處理三七培養液對抑制癌細^^的影響本實施例的發酵流程和實施例2相同，4叉在發酵前預先對三七培養液加熱。分別以121。C加熱20、60、120、180分鐘，測試發酵產物對H印3B和Hep2G細胞的影響，并以不加熱做為對照組。請參照圖6a和6b所示，加熱可增加發酵物的抗癌效果。8、三七發酵液對正常肝細胞的影響本實施例的發酵流程和實施例2相同，發酵天數為1天。以發酵產物處理小鼠的初代肝細胞(primaryhepatocyte),并以MTT分析法測定細胞存活率。請參照圖7,若發酵物的濃度為200|ig/ml時，初代肝細胞的存活率在80%以上，且LDso為976昭/ml。9、三七發酵液對B型肝炎表面抗原的影響本實施例的發酵流程和實施例2相同，分別取發酵l、3、5、7天的三七發酵液處理Hep3B細胞，并測定發酵產物對Hep3B的B型肝炎表面抗原的抑制效果。請參照圖8，抑制效果隨著發酵時間的增加而增加，發酵7天的三七發酵液具有80%以上的抑制率。10、動物實-驗取18-22克的SCID小鼠，分為5組，每組10只。首先，接種Hep3B/T2癌細胞于小鼠的腋下部位，接著喂食不同劑量的三七發酵物，連續35天，每3-4天測量一次腫瘤大小，并在停止喂食后，分別測量小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及肺瘤重量。此實施例的三七發酵物制備條件為10。/。(w/w)的三七粉未和90。/。(w/w)的蒸餾水，以上述8種混合菌，在37。C下發酵48小時。三七發酵物的劑量分別為1000嗎/ml(高劑量組)、400(ig/ml(中劑量組)和200jng/ml(低劑量組)，正控制組為腹腔注射5-FU，負控制組為喂食磷酸緩沖液，對照組為不接種Hep3B/T2細胞。請參照圖9，正對照組(5-FU)的腫瘤最小，其次為高劑量組(1000pg/ml),表示高劑量的三七發酵物具有延緩腫瘤生成的效果。此外，正對照組(5-FU)的肺瘤最輕，其次為高劑量組(1000ng/ml)，詳細結果如表l所示。表l小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肺瘤的重量(mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>雖然本發明已結合具體實施方式和附圖揭露如上，但其并非用以限定本發明。任何本領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可以對本發明作出修改或變更。因此，本發明的保護范圍當以權利要求所界定為準。權利要求1.一種發酵三七的方法，其包括以一培養基活化乳酸菌；將乳酸菌接種至三七培養液中發酵，以獲得發酵液；離心發酵液，取得上清液。2、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述方法進一步包括添加黑豆萃取液于所述三七培養液中。3、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述方法進一步包括預先熱處理所述三七培養液。4、根據權利要求3所述的發酵三七的方法，其特征在于所述熱處理溫度在75。C以上。5、根據權利要求3所述的發酵三七的方法，其特征在于所述熱處理時間在IO分鐘以上。6、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述乳酸菌為嗜熱唾液《連i求菌(Streptococcussalivariussubsp.Thermophilus(BCRC12268))、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillushelveticus(BCRC14092))、雷曼氏乳酸桿菌(LactobacillusrhamnosusGG(BCRC16000))、嗜酸性乳酸菌(Lactobacillusacidophilus(BCRC10695))、菲德氏-隆根菌(Bifidobacteriumlongum(BCRC14602))、鏈雙歧桿菌(Bifidobacteriumcatenulatum(BCRC14667))、短比非德氏菌(Bifidobacteriumbreve(BCRC11846))、雙叉乳酸桿菌(Bifidobacteriumbifidum(BCRC14615))或其組合。7、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述培養基為MRS或消化蛋白-酵母萃取液(peptone-yeastextractbase)培養基。8、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述三七培養液包括10-15。/。(w/w)的三七粉末和85-90。/。(w/w)的水。9、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述發酵時間為1至7天。10、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述發酵的溫度在25至4(TC。11、根據權利要求1所述的發酵三七的方法，其特征在于所述發酵的pH值在3至5之間。12、一種三七乳酸菌發酵液，由權利要求1所述的方法制備，具有抑制癌細胞生長的能力。13、根據權利要求12所述的三七乳酸菌發酵液，其特征在于所述三七乳酸菌發酵液具有抑制B型肝炎表面抗原的能力。14、根據權利要求12所述的三七乳酸菌發酵液，其特征在于所述癌細胞包括乳癌細胞、前列腺癌細胞、血癌細胞、直腸癌細胞、子宮癌細J包、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、子宮頸癌細胞、睪丸癌細胞、淋巴癌細胞、橫紋肌肉瘤細胞、神經母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞、肺癌細胞、腦部胂瘤細"包、皮膚癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、腎臟癌細胞或鼻咽癌細胞。15、根據權利要求12所述的三七乳酸菌發酵液，其特征在于所述癌細胞為肝癌細胞。16、根據權利要求12所述的三七乳酸菌發酵液，其特征在于所述三七乳酸菌發酵液具有60%以上的抗癌效果。17、一種預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其包括有效量的三七乳酸菌發酵液，由權利要求1所述的方法制備；以及一種藥學上可接受的載體或賦形劑。18、根據權利要求17所述的預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其特征在于所述癌癥包括乳癌、前列腺癌、血癌、直腸癌、子宮癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、淋巴癌、4黃紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦部腫瘤、皮膚癌、胃癌、肝癌、腎臟癌或鼻咽癌。19、根據權利要求17所述的預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其特征在于所述癌癥為肝癌。20、根據權利要求第17所述的預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其特征在于所述醫藥組合物具有60%以上的抗癌效果。21、根據權利要求17所述的預防和/或治療癌癥的醫藥組合物，其特征在于所述醫藥組合物為口服或注射劑型。全文摘要本發明涉及一種三七發酵液及其制備方法。本發明發酵三七的方法包括活化乳酸菌；將乳酸菌接種至三七培養液中發酵，以獲得發酵液；離心發酵液，取得上清液。經離心取得的上清液即為本發明的三七發酵液，其具有抑制癌細胞的效果。文檔編號A61P35/00GK101269098SQ200710089730公開日2008年9月24日申請日期2007年3月23日優先權日2007年3月23日發明者路孔明申請人:中天生物科技股份有限公司