專利名稱：誘導免疫細胞產生干擾素和活化toll樣受體的中草藥萃取物及其制備方法
誘導免疫細胞產生干擾素和活化Toll樣受體的中草藥萃取物及其制備方法技術領域：
本發(fā)明有關于一種中草藥萃取物，特別是有關于一種誘導免疫細胞產 生干擾素及活化Toll樣受體的中草藥萃取物及其制備方法。
先前技術
干擾素(IFN)是第一個被發(fā)現(xiàn)的細胞間素，因其具有"干擾"病毒復制 的能力而命名。干擾素是1957年由英國Alick Isaacs和Jean Undenmann兩 位研究人員所發(fā)現(xiàn)，當細胞受到病毒感染時，會立即制造出千擾素以抵抗病 毒，并同時警告鄰近正常的細胞，提高警覺，以防病毒入侵。干擾素主要分 成二大類I型及II型。I型的干擾素包括干擾素-a、干擾素-P、干擾素-(d、 干擾素-t，大部分的細胞都可以表達干擾素-a及干擾素-(3; II型的干擾素包 括千擾素-Y,只表達在部分的免疫細胞，例如天然殺傷(NK)細胞、CD4+輔助 性T淋巴細胞1 (Th1)和CD8+細胞毒性T淋巴細胞。
在病毒感染期間，I型的千擾素可以快速的被誘導產生，接著會與靶細 胞上的I型干擾素受體結合，啟動Jak-S丁AT信號途徑,開啟千擾素刺激基 因(IFN-stimulated gene， ISG)表達。干擾素刺激基因蛋白質產物是千擾素對抗 病毒最主要策略，目前有超過五百多種的千擾素刺激基因蛋白質被定義出 來，這些分子參與的范圍非常廣泛，從抗病毒(anti-virus)、細胞凋亡 (apoptosis)、蛋白質降解(protein degradation)、炎性細月包應答(inflammatory cell response)至脂質代謝(lipidmetabolism)，涵蓋多種功能。最廣為人知的千擾素 剌激基因蛋白質包括蛋白激酶R (PKR)、作用于RNA的腺苷脫氨酶 (adenosine deaminase acting on RNA, ADAR)、 2',5，曙寡聚腺苷酸合成酶(oligo adenylate synthetase, OAS)、 RNA酶L及Mx蛋白。PKR會借著抑制真核起 始因子(eukaryotic initiation factor 2， elF2)而阻斷病毒蛋白的合成，ADAR會 抑制病毒RNA編輯(RNA editing), OAS、 RNA酶L會降解病毒RNA， Mx 蛋白則能抑制病毒復制。
除了能直接對抗病毒外，I型的干擾素還參與了免疫調控(immunomodulatory),在先天性及后天性免疫反應中扮演著重要角色。除了 能夠產生IL-15驅動天然殺傷細胞的存活與增殖，同時也能刺激MHC、 CD80、 CD86及CD40分子的表達，進而促進樹突細胞成熟，此外，I型的 干擾素也能誘導類漿樹突細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)分化為成熟 的抗原呈遞細胞。在后天免疫方面，I型的干擾素在CD8+細胞毒性T淋巴細 胞的活化、CD4+輔助性T淋巴細胞1 (Th1)和CD8+細胞毒性T淋巴細胞的存 活、B淋巴細胞分化與增殖上扮演著重要角色。
由于I型的千擾素具有抗病毒、細胞生長調控及免疫調節(jié)的能力，目前 已成功的運用于臨床治療上，經美、英、日、德等先進國家批準的適應癥包 括(l)病毒所引起的疾病，例如，慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、菜花(尖 頭濕疣)、艾滋病患常見的卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)等；(2)血液疾病， 例如，毛狀細胞白血病、慢性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、低級非何杰金 氏淋巴瘤等；(3)其它腫瘤，例如，黑素瘤、腎細胞癌、基底細胞癌等。
目前研究發(fā)現(xiàn)，千擾素的產生是由于免疫系統(tǒng)的傳令兵Toll樣受體 (Toll-like receptor, TLR)活化而誘導其產生。Toll是1988年左右在果蠅體內 先發(fā)現(xiàn)的，隨后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)與Toll相似度極高的受體，稱為Toll 樣受體。當外來物入侵時，Toll樣受體藉由識別來自病原體的病原體相關分 子圖案(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，經j言號傳導^各徑，開啟 下游基因表達，包括細胞間素(I型千擾素、IL-l、 IL-12、干擾素-a)、化學 趨化物質、MHC及共刺激分子(co-stimulatory molecule),此外，也可誘導誘 導型氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)及抗微生物肽表達，直 接破壞外來病原體。除了啟動先天性免疫第一道防線，Toll樣受體還可借著 誘導抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)成熟，活化后天性免疫反應。當微生物 侵入體內時，樹突細胞本身的Toll樣受體會識別病原體，再借著MHC分子 將抗原呈遞在其表面，進而活化天然的T淋巴細胞，由Toll樣受體誘導產生 的IL-12，會進一步使活化的T淋巴細胞分化為Thr淋巴細胞，啟動后天性 免疫反應，協(xié)助抵抗慢性病毒感染，達到清除病毒的最終目的，在防御機制 上，提供更強大、更專一的保護。
目前所知的Toll樣受體共有10種，分別從Toll樣受體1到Toll樣受 體IO,可以識別各種不同的外來物，包括細菌、病毒、霉菌及原生動物。 Toll樣受體在結構上包含兩部分:(l)胞外富含亮氨酸的重復序列(extracellular
6leucine-rich repeat, LRR)，其負責外來物的識別；(2)胞內Toll-白介素1受體 (intracellular Toll-interleukin-l receptor, TIR)結構域，其與下游的銜接蛋白 (adaptor protein)作用，例如，骨髓分化因子88 (myeloid differentiation factor-88: MyD88)、 TIR相關蛋白(TIRAP/MAL)、誘導IFN-卩的含Toll/IL-1受體結構 域的銜接物(adaptor) (TRIF/TICAM-1)及Toll 受體相關分子 (TRAM/TIRP/TICAM-2)，進而活化胞外信號調控的激酶(ERK)、 p38、 c-JimN-末端激酶及NF-kB，誘導促炎細胞因子IL-1、 IL-6、千擾素-a及I型千擾 素產生。
在哺乳動物中，第一個被發(fā)現(xiàn)的是Toll樣受體4，表達在很多的免疫 細胞上B淋巴細胞、樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞及T淋巴細 胞，可以識別許多的外來病毒呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、 C型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)及小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV),并且借著MyD88與TIRAP的作用，誘導大 量的千擾素產生。
在所有的Toll樣受體中，Toll樣受體2認識最多種的PAMP，大部分 來自細菌，包括脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)、脂多糖 (lipopolysaccharide， LPS)、脂磷壁酸(lipoteiehoic acid, UFA)、肽聚糖 (peptidoglycan， PGN)及其它的脂蛋白(lip叩rotein)、糖脂(glycolipid)、糖蛋白 (glycoprotein)。 Toll樣受體2也能識別病毒的入侵麻滲病毒(measles vims， MV)、人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)、 C型肝炎病毒，在 防御機制上扮演了很重要的角色。
Toll樣受體7在免疫細胞單核細胞、B淋巴細胞及樹突細胞中高度表 達， 一旦識別出外來物質的入侵后，可以產生非常大量的I型干擾素，特別 是干擾素-(x，其在先天性免疫上扮演著重要的關鍵角色。Toll樣受體7主要 是偵測來自病毒的富含G/U的ssRNA，包括人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)及VSV，在病毒的清除上，有著不可忽視的影 響力。
在藥物發(fā)展方面，目前已進入臨床試驗階段的Toll樣受體9拮抗劑， 可以刺激樹突細胞產生IL-12及非常高量的干擾素-ct，并且誘導B淋巴細胞 增殖及抗體分泌，在千擾素'a治療失敗的HCV病人上有很好的療效。Toll 樣受體7拮抗劑則可產生非常廣泛的抗病毒應答(antiviral response),釋放出多種細胞間素，尤其是千擾素-a，在不同HCV基因型的病人身上有明顯的
病毒清除率。
近年來已有多種抗病毒藥物被研發(fā)出來，并廣泛使用于臨床的治療上。 例如利巴韋林(ribavirin)，其為一種核苷類似物，在實驗上可抑制多種病毒 的生長，如呼吸道合胞病毒、流感病毒(influenza virus)、腺病毒(adenovirus)、 HIV及HCV等；金剛烷胺(amantadine)，其作用為抑制流感A病毒的M2膜 蛋白，因而使流感A病毒無法順利脫去外殼，進而不能進行后續(xù)的復制工作； 齊多夫定(zidovudine, AZT)、地達諾新(didanosine， ddl)、扎西他濱(zalcitabine， ddc)、司他夫定(stavudine, d4T)及拉米夫定(lamivudine， 3TC)等則可抑制HIV 的逆轉錄酶，使得病毒的RNA無法反轉錄成DNA，因而中斷DNA的繼續(xù) 合成。
雖然許多的抗病毒藥物陸續(xù)被有效使用于臨床，但近年來抗藥性病毒 也曰見浮現(xiàn)。抗藥性產生的原因主要是病毒的基因產生突變而使得抗病毒藥 物喪失其作用的靶物所致。茲舉數(shù)例說明如下HSV的胸苷激酶基因發(fā)生突 變，無法將阿昔洛韋(acyclovir)及更昔洛韋(ganciclovir)等在細胞內轉化成有 效的成份，因此對該些藥物產生抗藥性；流感A病毒的M2蛋白基因突變， 則會對金剛烷胺或金剛乙胺(rimantadine)產生抗藥性；HIV逆轉錄酶或蛋白 酶基因的變異亦是導致抗藥性產生的主因；HCV的非結構性5A及包膜基因 2-糖蛋白的基因變異會使HCV對干擾素產生抗藥性。
現(xiàn)今有越來越多的藥物發(fā)展，朝著免疫調控的方向邁進，借著刺激宿 主先天性及后天性反應達到清除外來微生物的目的。免疫調節(jié)是中草藥治療 的優(yōu)勢，其雙向調節(jié)(又或是免疫調節(jié))作用主要表現(xiàn)在對正常機體無明顯 影響，而對免疫失調機體卻有顯著作用者，來糾正機體過低或過亢的免疫狀 態(tài)，使之重新恢復和維持免疫穩(wěn)定，既可增強正常機體的免疫能力，又可祛 除^t病因素。
中草藥保持其天然結構和活性，是經過幾千年篩選后，留下來確實有 療效的藥物。
病毒性疾病的種類繁多，例如B型肝炎、C型肝炎、流行性感冒、流 行性腮腺炎、流行性腦膜炎、病毒性肺炎、腸病毒、AIDS病毒等，其致病 性、潛伏期及感染途徑多所不同。從臨床實驗中發(fā)現(xiàn)，很多中草藥用于治療 病毒性疾病療效顯著。例如在美國專利USP6,787，165中，金銀花、連翹的超臨界萃取及水萃 與黃荅水萃的萃取物具有抗流感病毒作用；在USP 6，696，094中，由白花蛇 舌草(Hedyotis diffUse)等十四種藥材所制備的注射劑和膠嚢劑，在五人次臨 床試驗中顯示有抗AIDS病毒的作用；在USP 6,214,350中指出，中藥復方 HHT888-4包括金銀花、甘草、龍葵等組成，在體外實驗中，可抑制人體淋 巴細胞內百分之九十八以上的艾滋病毒活性作用;而在USP 6,426,098中， 姜黃、黃耆、桑寄生、虎杖的中草藥萃取物,臨床試驗顯示對于C型肝炎治 療有顯著效果。
此外，中草藥亦應用于搭配西藥療程的輔助療法。例如USP 2003/0211180 Al專利中，由大棗等所組成的PHY906,則用于^^配化療藥物 及病毒性疾病治療上的使用，可以提高治療效果、增進生活品質及降低毒性 和副作用，已于美國進入第二期臨床試驗;中國臺灣專利1 258,373中指出, 一種C型肝炎輔助治療藥物，由冬蟲夏草及黃耆組成，用以搭配C型肝炎 復合療法(干擾素和利巴韋林)以治療C型肝炎，其臨床試驗顯示持續(xù)病毒清 除率達70%以上，除可以提高治療效果并降低治療后的復發(fā)率。
更進一步從免疫系統(tǒng)的角度探討，誘發(fā)干擾素的產生，對于治療病毒
性肝炎有極高度的指標性意義。在世界專利WO 02102395 Al中，以夾竹桃
及甘草萃取物以感染小鼠腦脊髓炎病毒(encephalo-myocarditis virus; EMCV)
的人類鱗狀癌細胞(HEp-2)進行抗病毒測試，可以有效降低病毒，在體外實
驗中也得到誘導千擾素-Y產生的結果。
在人體免疫系統(tǒng)中已知10種Toll樣受體，當人體受到體內外病原(病毒、
細菌或霉菌)的威脅時，這些個別TLR將會辨別并啟動對應的免疫反應。不同 來源的病原分子會與特定的TLR結合，誘發(fā)一連串反應藉以保護細胞免受病 原的侵害。TLR治療法便是應用TLR對應免疫反應具高度特異性的原理，對 于特定治療的病癥施予刺激物(激動劑)或阻斷物(拮抗劑)，經由自身免疫調 控達到治療病癥的效果。而有別于其它應用免疫系統(tǒng)的治療方法，TLR治療 法因對亍治療疾病具有高度專一性，除了可以有效并持續(xù)抑制病原，還減少 因非專一性活化先天免疫系統(tǒng)所產生的副作用或其它病癥。
如日前Coley Pharmaceutical Group公司發(fā)展一種TLR治療藥物Aetilon， 即以合成的短鏈寡核苷酸(ODN)調控TLR-9。 ODN是類似DNA序列的短鏈化 合物，其仿照在病原侵入時TLR-9所接受到病原中的CpG結構。TLR-9在被
9表達后經免疫系統(tǒng)內一連串的信號傳遞，可誘發(fā)千擾素的產生，以用于治療
如C型肝炎等的病毒性疾病，目前正在進行Ib期臨床試驗階段。另夕卜，Anadys Pharmaceutieal公司所發(fā)展的ANA245及ANA975 (口服劑)，則用以表達 TLR-7，目前已分別進行到Ib期及Ia期臨床試驗階段。
此外，在TLR治療法的研究中，亦有使用天然萃取物進行試驗。WO 04093518 A2專利中指出，以紫錐花等草藥的Melanin萃取物，進行體外/單 核細胞測試系統(tǒng)(NF-KB/螢光素酶)的試驗，可以誘發(fā)TLR2及TLR4的表達。
為了克服病毒抗藥性的問題，本發(fā)明結合多種中草藥，發(fā)展出復方， 其原理為同時使用作用于相同病毒靶物的多種不同藥物或作用在病毒不同 部位的多種藥物一起治療，除有相加或加成效果外，亦可當病毒對其中一種 藥物產生抗藥性時，仍有另外一種有效的藥物存在,可增加治療的成功率。 加上中草藥保持其天然結構和活性，是經過幾千年篩選后，留下來確實有療 效的藥物，遂根據(jù)其多效性、雙向調節(jié)、溫和無毒性及顯著的免疫增強作用 等優(yōu)勢，開發(fā)出對病毒疾病有療效的中草藥萃取物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個實施例，提供一種誘導免疫細胞產生千擾素及活化Toll 樣受體的中草藥萃取物，由下列原料萃取而成，其原料包括有效量的甘草 (G丄yCTi / /f/Z45 i^Z)ZY)、柴胡(B(/尸丄5L^/ 以及黃芩
0SCCT五i:i^及"5 WZ)/^),其中甘草、柴胡與黃茶的重量比大體介于1 5: 1~5:卜5或1~2: 1~2: 1~2。
甘草包括生甘草或炙甘草。柴胡包括北柴胡或高氏柴胡。黃芩包括枯 黃茶或條黃茶。
本發(fā)明中草藥萃取物原料還包括五味子(SCH/5^iVZ)iL^ i^t/C7I/5)及 芍藥(iM五CWX^及C/5il4iL4DZY)。甘草、柴胡、黃芩、五味子與芍藥的重量 比大體介于1~5: 1~5: 1 5: 1~3: 1 3或1 2: 1 2: 1~2:卜2: 1 2。五味 子包括北五味子或南五味子。芍藥包括赤芍、白芍或牡丹。
本發(fā)明中草藥萃取物活化多種Toll樣受體,包括Toll樣受體2、 Toll 樣受體4或Toll樣受體7。
本發(fā)明中草藥萃取物可強化免疫調控,用于治療病毒感染性疾病。
本發(fā)明的另 一個實施例，提供一種誘導免疫細胞產生干擾素及活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方法，包括:提供包含有效量甘草、柴胡及黃 芩的中草藥組合物，其中甘草、柴胡與黃芩的重量比大體介于1 5: 1~5: 1~5或1~2: 1 2: 1~2;以溶劑萃取該中草藥組合物，以獲得萃取液；濃縮 該萃取液，以獲得濃縮產物；對該濃縮產物進行干燥；加入賦形劑進行調方； 以及制作成特定劑型。
該有效量甘草、柴胡及黃芩的中草藥組合物還包括五味子及芍藥。甘 草、柴胡、黃芩、五味子與芍藥的重量比大體介于1~5: 1 5: 1~5: 1 3: 1 3或1 2: 1~2: 1 2: 1 2: 1 2。五味子包括北五味子或南五味子。芍藥 包括赤芍、白芍或牡丹。
該溶劑包括水或濃度0.1-95%的乙醇，且該溶劑與該中草藥組合物的重 量比大體介于6: 1 10: 1。該濃縮產物的固體含量大體介于10-30%。本發(fā) 明干燥方法包括真空千燥、冷凍干燥、噴霧干燥或流動床千燥。該賦形劑包 括淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、硬酯酸鎂、二氧化硅、微晶纖維素、 羧甲基纖維素或滑石粉。制作成的該特定劑型包括膠嚢劑、錠劑、散劑或液 劑。
為讓本發(fā)明的上述目的、特征及優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉其實施 例，并配合所附圖
式，作詳細說明如下
圖式簡單說明
第1A圖為本發(fā)明中草藥萃取物對嗜中性白細胞的細胞毒性。 第1B圖為本發(fā)明中草藥萃取物對T淋6細胞的細胞毒性。 第2A圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物可促進天然殺傷細胞及T淋巴細胞表 達IFN-y。
第2B圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物可促進天然殺傷細胞表達IFN-a。 第2C圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物可促進及T淋巴細胞表達IFN-a。
第3圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物可促進活體動物表達IFN-Y。
第4A 41圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
第5A 5I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
第6A~6I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體(TLR)表達的影響。
第7A~7I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
第8A~8I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
第9A 9I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
第10A-10I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
第11A 11I圖顯示本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體 (TLR)表達的影響。
實施方式
本發(fā)明的一個實施例，提供一種誘導免疫細胞產生干擾素及活化Toll 樣受體的中草藥萃取物，由下列原料萃取而成，其原料包括有效量的甘草、 柴胡以及黃芩。
中草藥萃取物原料中，甘草、柴胡與黃芩的重量比大體介于1 5: 1 5:
卜5或1 2: 1~2:卜2。
上述中草藥萃取物原料還包括五味子及芍藥。甘草、柴胡、黃芩、五
味子與芍藥的重量比大體介于1 5: 1 5: 1 5: 1 3: 1 3或1 2: 1 2: 1 2: 1 2: 1 2。
甘草可包含生甘草或炙甘草。柴胡可包含北柴胡或高氏柴胡。黃茶可 包含枯黃茶或條黃芩。五味子可包含北五味子或南五味子。芍藥可包含赤芍、 白芍或牡丹。
上述中草藥萃取物可活化多種Toll樣受體，例如Toll樣受體2、 Toll 樣受體4及Toll樣受體7。
本發(fā)明的另 一個實施例，提供一種誘導免疫細胞產生干擾素及活化Toll 樣受體的中草藥萃取物的制備方法,包括下列步驟。首先，提供包含有效量 甘草、柴胡及黃芩的中草藥組合物。甘草、柴胡與黃芩的重量比大體介于1 5: 1 5: 1 5或1 2: 1~2: 1 2。之后，以溶劑萃取中草藥組合物，以獲得萃取 液。使用的溶劑可包括水或濃度0.1-95%的乙醇，其與中草藥組合物的重量比大體介于6: 1~10: 1。接著，濃縮萃取液，以獲得濃縮產物。濃縮產物的 固體含量大體介于10-30%。之后,對濃縮產物進行干燥。對濃縮產物進行 干燥的方法可包括真空千燥、冷凍干燥、噴霧干燥或流動床千燥。接著，加 入賦形劑進行調方。添加的賦形劑可包括淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、木糖 醇、硬酯酸鎂、二氧化硅、微晶纖維素、羧甲基纖維素或滑石粉。最后，制 作成例如膠嚢劑、錠劑、散劑或液劑的特定劑型。
取上述若干重量百分比的柴胡、甘草、黃芩、北五味子及赤芍等五方 藥材為原料，并以重量比6至IO倍的0,l-95。/。乙醇進行一次或多次萃取，接 著，進行濃縮，濃縮終點的固體含量控制在10-30%之間。接著，添加萃取 物含量0-100%的賦形劑，并進行濃縮混合液的冷凍干燥，所得干品的含水 量控制在2-10%之間，并研磨得粉末的粒徑大小控制低于35網目以下。最 后，將中草藥萃取物的千品粉末充填于硬膠嚢中，每顆膠嚢劑的充填量相當 約1.35士0.09克藥材，其藥材濃縮比為2-3倍。
本發(fā)明以嗜中性細胞(neutrophil)、 T淋巴細胞及天然殺傷細胞為測試主 體，觀察干擾素產出及Toll樣受體2、 Toll樣受體4、 Toll樣受體7表達， 作為藥物篩選的依據(jù)。
實施例
本發(fā)明中草藥萃取物的制備實施例1
分別取黃芩4千克、北柴胡4千克、甘草4千克、芍藥4千克、北五味 子4千克(藥材重量比1: 1: 1: 1: 1)，及30°/。乙醇溶液200千克，以回流 裝置加熱萃取1小時，共進行二萃。所得的萃耳又液以100目篩網進行過濾， 再經減壓濃縮，濃縮終點的固體含率控制約為15%。接著添加2千克麥芽糖 糊精并進行冷凍千燥。所得千品粉末的粒徑大小控制低于35網目以下，并 混入120克二氧化硅及60克硬脂酸鎂。最后，將干品混合粉末充填于第0 號硬膠嚢中，所得每顆膠嚢劑的充填量為565士40毫克，相當約1.35士0.09克 藥材。
實施例2
分別取黃芩2.5克、北柴胡2.5克、甘草2.5克、芍藥7.5克、北五味 子7.5克(藥材重量比1: 1: 1: 3: 3)，及30%乙醇溶液250克，以回流裝置加熱萃取l小時，共進行二萃。所得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經 減壓濃縮后進行冷凍干燥，得千燥粉末。實施例3
分別取黃茶12,5克、北柴胡6.25克、甘草6.25克(藥材重量比2: 1: 1)，及30%乙醇溶液250克，以回流裝置加熱萃取l小時，共迸行二萃。所 得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經減壓濃縮后進行冷凍千燥，得千燥 粉末。
實施例4
分別取黃芩6.25克、北柴胡12.5克、甘草6.25克(藥材重量比1: 2:
1) ,及30%乙醇溶液250克，以回流裝置加熱萃取l小時，共進行二萃。所 得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經減壓濃縮后進行冷凍干燥，得干燥 粉末。
實施例5
分別取黃芩6.25克、北柴胡6,25克、甘草12.5克(藥材重量比1: 1:
2) ，及30°/。乙醇溶液250克，以回流裝置加熱萃取l小時，共進行二萃。所 得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經減壓濃縮后進行冷凍干燥，得千燥 粉末。
實施例6
分別取黃芩5克、北柴胡5克、甘草5克、芍藥5克、北五味子5克(藥 材重量比l: 1: 1: 1: 1),及純水250克，以回流裝置加熱萃取1小時，共 進行二萃。所得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經減壓濃縮后進行冷凍 千燥，得干燥粉末。實施例7
分別取黃芩5克、北柴胡5克、甘草5克、芍藥5克、北五味子5克(藥 材重量比l: 1: 1: 1: 1),及50%乙醇溶液250克，以回流裝置加熱萃取l 小時，共進行二萃。所得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經減壓濃縮后 進行冷凍千燥，得千燥粉末。實施例83
分別取黃茶5克、北柴胡5克、甘草5克、芍藥5克、北五味子5克(藥 材重量比l: 1: 1: 1: 1)，及95%乙醇溶液250克，以回流裝置加熱萃耳又l 小時，共進行二萃。所得的萃取液以100目篩網進行過濾，再經減壓濃縮后進行冷凍干燥，得千燥粉末。
本發(fā)明中草藥萃取物對嗜中性細胞及T淋巴細胞的細胞毒性實施例9
首先，將細胞接種于96孔的平板中。然后，加入本中草藥萃取物(由實 施例1所制備)，再加入lOjal的Alamarblue染料，置于37°C培養(yǎng)箱達16小 時，測量其在570mn及600nm的吸光值。其結果如第1A及1B所示，中草 藥萃取物對嗜中性細胞及T淋巴細胞并無明顯的細胞毒性。
本發(fā)明中草藥萃取物誘導免疫細胞表面產生干擾素的試驗實施例10
首先，取外周血分離的T淋巴細胞及天然殺傷細胞細胞抹(NK92)。加 入本中草藥萃取物(由實施例1所制備)24小時后，收取上層液，并以ELISA 測定干擾素含量。結果顯示隨著中草藥萃取物濃度的增加，其干擾素-y表達 量也會隨之增加而呈現(xiàn)劑量效應，如第2A圖所示。而這樣的現(xiàn)象，無論在 T淋巴細胞及天然殺傷細胞抹(NK92)皆有相類似的趨勢。此外以PC-IL-12 為正對照組并以相同方式測定干擾素-a含量，結果顯示中草藥萃取物在 ,g/ml就可以誘導天然殺傷細胞抹(NK92)產生較高的干擾素-a，而以外周 血分離的T淋巴細胞為系統(tǒng)進行誘導試驗發(fā)現(xiàn)在250-1000|ag/ml可顯著誘導 出干擾素-a，如第2B及2C圖所示。實施例11
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例3所制備)進行干擾素，y誘導活性測 試。結果顯示，樣品濃度在500ug/ml可誘導免疫細胞產生千擾素-Y達 94.3±15，7pg/ml (以IL-12做為正對照組，在40ng/ml的濃度下可誘導免疫細 胞產生干擾素-Y達50±2.04pg/ml)。實施例12
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例5所制備)進行干擾素，誘導活性測 試。結果顯示，樣品濃度在500ug/ml可誘導免疫細胞產生干擾素-Y達 129.1±8.5pg/ml (以IL-12做為正對照組，在40ng/ml的濃度下可誘導免疫細 胞產生干擾素-y達50±2.04pg/ml)。實施例13
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例6所制備)進行干擾素-Y誘導活性測 試。結杲顯示，樣品濃度在1,000ug/ml可誘導免疫細胞產生千擾素-Y達
1595,2±15.7pg/ml (以IL-12做為正對照組，在40ng/ml的濃度下可誘導免疫細 胞產生干擾素-y達50±2.04pg/ml)。實施例14
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例7所制備)進行干擾素-y誘導活性測 試。結果顯示，樣品濃度在l,000ug/ml可誘導免疫細胞產生干擾素-Y達 1363.6±44.9pg/ml (以IL-12做為正對照組，在40ng/ml的濃度下可誘導免疫 細胞產生千擾素，y達50±2.04pg/ml)。實施例15
取若千千品(由實施例8所制備)進行干擾素，y誘導活性測試。結果顯示， 樣品濃度在500ug/ml可誘導免疫細胞產生千擾素-y達80.2±24.6pg/ml (以 IL-12做為正對照組，在40ng/ml的濃度下可誘導免疫細胞產生干擾素-y達 50±2.04pg/ml)。
本發(fā)明中草藥萃取物誘導大鼠產生千擾素的試驗實施例16
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例1所制備)進行活體內千擾素-y誘導活 性試驗。將連續(xù)喂食28天的Wistar大鼠對照組(水)、媒介組(喂食中草藥 萃取物5g/kg)及高劑量組(喂食中草藥萃取物10g/kg)，于第29天抽血測定血 中IFNy產生情形。結果顯示，本中草藥萃取物可以明顯誘導動物體內的IFNy 的產生，且在雌性大鼠中有更優(yōu)異的表達。如第3圖所示。 本發(fā)明中草藥萃取物對PBMC/T細胞的Toll樣受體(TLR)表達的影響實施例17
取若千本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例1所制備)進行TLR2、 TLR4及 TLR7的活性表達測試。利用TLR2、 TLR4及TLR7抗體進行細胞表面標記 染色后，直接以熒光流體技術儀(FACS)分析之。結果顯示，在低劑量250ug/ml 時不論TLR2、 TLR4或TLR7皆可誘導75%以上的表達。請參閱第4A 41 圖。
實施例18
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例2所制備)進行TLR2、 丁LR4及TLR7 的活性表達測試。結果請參閱笫5A-5I圖所示，當測試濃度在500ug/ml時， 可誘導65%以上的TLR表達。實施例19取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例3所制備)進行TLR2、 TLR4及TLR7 的活性表達測試。結果請參閱第6A 61圖所示，當測試濃度在低劑量 250ug/ml即可誘導60%以上的TLR表達。實施例20
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例4所制備)進行TLR2、 TLR4及TLR7 的活性表達測試。結果請參閱第7A 71圖。當測試濃度在低劑量250ug/ml 時，即可誘導85。/。以上的TLR表達。實施例21
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例5所制備)進行TLR2、 TLR4及TLR7 的活性表達測試，結果請參閱第8A-8I圖。當測試濃度在低劑量250ug/ml 時，即可誘導80%以上的TLR表達。實施例22
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例6所制備)進行TLR2、 TLR4及TLR7 的活性表達測試，結果請參閱第9A~9I圖所示，當測試濃度在低劑量 250ug/ml時，即可誘導85。/。以上的TLR表達。實施例23
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例7所制備)進行TLR2、 TLR4及TLR7 的活性表達測試，結果請參閱第10A 10I圖，當測試濃度在低劑量250ug/ml 時，即可誘導94。/。以上的TLR表達。實施例24
取本發(fā)明中草藥萃取物(由實施例8所制備)進行TLR2、 TLR4及TLR7 的活性表達測試，結果請參閱第11A 11I圖，當測試濃度在低劑量250ug/ml 時，即可誘導75%以上的TLR高度表達。
雖然本發(fā)明已以其實施例^:露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何
熟習此項技術者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，當可作更動與潤飾，因
此本發(fā)明的保護范圍當視所附的權利要求所界定者為準。
權利要求
1.一種誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物，由下列原料萃取而成，其原料包括有效量的甘草、柴胡以及黃芩，其中甘草、柴胡與黃芩的重量比大體介于1～5∶1～5∶1～5。
2. 如權利要求1所述的誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物， 其中甘草、柴胡與黃芩的重量比大體介于1~2: 1 2: 1~2。
3. 如權利要求1所述的誘導免疫細胞產生千擾素的中草藥萃取物， 其原料還包括五味子及芍藥。
4. 如權利要求3所述的誘導免疫細胞產生千擾素的中草藥萃取物， 其中甘草、柴胡、黃芩、五味子與芍藥的重量比大體介于1 5:卜5:卜5: 1 3: 1 3。
5. 一種誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物的制備方法，包括提供包含有效量甘草、柴胡及黃芩的中草藥組合物，其中甘草、柴胡 與黃茶的重量比大體介于1~5: 1 5: 1 5;以溶劑萃取該中草藥組合物，以獲得萃取液； 濃縮該萃取液,以獲得濃縮產物; 對該濃縮產物進行干燥； 加入賦形劑進行調方；以及 制作成特定劑型。
6. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生千擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中該中草藥組合物還包括五味子及芍藥。
7. 如權利要求6所述的誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中甘草、柴胡、黃芩、五味子與芍藥的重量比大體介于1 5:1 5: 1 5: 1 3: 1 3 。
8. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中該溶劑包括水或濃度0.1-95%的乙醇。
9. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中該溶劑與該中草藥組合物的重量比大體介于6: 1 10: 1。
10. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生千擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中該濃縮產物的固含量大體介于10-30%。
11. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生千擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中對該濃縮產物進行干燥的方法包括真空千燥、冷凍干燥、噴 霧千燥或流動床干燥。
12. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中該賦形劑包括淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、硬酯酸 鎂、二氧化硅、微晶纖維素、羧甲基纖維素或滑石粉。
13. 如權利要求5所述的誘導免疫細胞產生干擾素的中草藥萃取物的 制備方法，其中該特定劑型包括膠嚢劑、錠劑、散劑或液劑。
14. 一種活化Toll樣受體的中草藥萃取物,由下列原料萃取而成,其 原料包括有效量的甘草、柴胡以及黃芩，其中甘草、柴胡與黃芩的重量比大 體介于1~5: 1~5: 1~5。
15. 如權利要求14所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物，其中該 中草藥萃取物活化Toll樣受體2、 Toll樣受體4及Toll樣受體7。
16. 如權利要求14所迷的活化Toll樣受體的中草藥萃取物，其中甘 草、柴胡與黃芩的重量比大體介于1~2: 1~2: 1~2。
17. 如權利要求14所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物，其原料 還包括五味子及芍藥。
18. 如權利要求17所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物,其中甘 草、柴胡、黃芩、五味子與芍藥的重量比大體介于1 5: 1 5: 1 5: 1~3: 1~3。
19. 一種活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方法，包括 提供包含有效量甘草、柴胡及黃芩的中草藥組合物，其中甘草、柴胡與黃茶的重量比大體介于l 5: 1 5: 1~5;以溶劑萃取該中草藥組合物，以獲得萃取液； 濃縮該萃取液，以獲得濃縮產物； 對該濃縮產物進行千燥； 加入賦形劑進行調方；以及 制作成特定劑型。
20. 如權利要求19所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方法，其中該中草藥組合物還包括五味子及芍藥。
21. 如權利要求20所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方法，其中甘草、柴胡、黃芩、五味子與芍藥的重量比大體介于1 5: 1 5: 1 5: 1 3: 1 3。
22. 如權利要求19所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方 法，其中該溶劑包括水或濃度0.1-95%的乙醇。
23. 如權利要求19所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方 法，其中該溶劑與該中草藥組合物的重量比大體介于6: 1 10: 1。
24. 如權利要求19所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方 法，其中該濃縮產物的固體含量大體介于10-30%。
25. 如權利要求19所迷的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方 法，其中對該濃縮產物進行干燥的方法系包括真空干燥、冷凍干燥、噴霧干 燥或流動床干燥。
26. 如權利要求19所迷的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方 法，其中該賦形劑包括淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、硬酯酸鎂、二 氧化硅、微晶纖維素、羧甲基纖維素或滑石粉。
27. 如權利要求19所述的活化Toll樣受體的中草藥萃取物的制備方 法，其中該特定劑型包括膠嚢劑、錠劑、散劑或液劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導免疫細胞產生干擾素和活化Toll樣受體的中草藥萃取物及其制備方法。本發(fā)明提供一種誘導免疫細胞產生干擾素及活化Toll樣受體的中草藥萃取物及其制備方法，所述中草藥萃取物包含有效量的甘草、柴胡、黃芩、五味子以及芍藥。
文檔編號A61P31/12GK101590105SQ20081009871
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月30日 優(yōu)先權日2008年5月30日
發(fā)明者呂居勛, 姚心然, 李連滋, 楊雅燕, 林宸萱, 沈欣欣, 潘一紅, 陳志隆, 陳明豐 申請人:財團法人工業(yè)技術研究院