專利名稱：基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫脂質(zhì)體，特別涉及一種基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體，還涉及該免疫脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是發(fā)病率高、預(yù)后差的惡性疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。繼手術(shù)、放療、化療后，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療中的重要手段。當(dāng)前，腫瘤生物治療策略主要有腫瘤相 關(guān)基因或腫瘤抑制基因的靶向治療、腫瘤相關(guān)抗原的免疫治療等，但這些方法由于技術(shù)的 成熟性、有效性、經(jīng)濟(jì)性及伴隨的副作用等問題，在實際應(yīng)用中受到一定限制。研究表明，所有人類腫瘤中90%以上為實體瘤，而實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要新生血管形成，抑制腫瘤血管形成能夠有效阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)支持，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移， 因此是腫瘤生物治療中的一個重要補(bǔ)充策略。該策略不僅具有良好的腫瘤特異性，而且不 受腫瘤類型的限制，更重要的是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種基因穩(wěn)定的細(xì)胞。過去十年中，人 們在抑制腫瘤血管生成方面主要致力于各種血管生成抑制劑的研究，但至今尚未取得令人 滿意的療效。Isthmin是從后腦組織中鑒定出的一種分子量約60kDa的分泌性蛋白，目前功能未知。在神經(jīng)元發(fā)育階段，Isthmin在中腦到后腦的分界峽部組織高度表達(dá)，此外在軸旁的 中胚葉神經(jīng)褶發(fā)育的晚期階段也有表達(dá)。Isthmin的中部具有凝血栓蛋白-II型重復(fù)序列 (thrombospondin-1 type 1 repeat, TSR)，羧基末段具有黏附相關(guān)蛋白區(qū)域。TSR由3組 重復(fù)的備解素序列組成，最初被證明是凝血栓蛋白-I(TSP-I)的重要結(jié)構(gòu)域，在TSP-I抑制 血管生成中發(fā)揮重要作用；隨后的研究發(fā)現(xiàn)，TSR在分泌性或跨膜性蛋白中存在，功能與細(xì) 胞黏附、通訊和組織重建相關(guān)。脂質(zhì)體是由一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的球狀體，可以包裹多種物質(zhì)(如藥物、核酸等)并將其轉(zhuǎn)入多種類型的細(xì)胞中，具有延長包裹物的作用時間、增加細(xì) 胞對包裹物的攝取量、提高療效、減少毒副作用等特點，但其缺乏主動靶向性。免疫脂質(zhì)體 則是一種表面結(jié)合有抗體或抗體片段等物質(zhì)的脂質(zhì)體，其借助抗體或抗體片段與靶細(xì)胞表 面抗原的特異性結(jié)合，可以特異性識別并結(jié)合靶細(xì)胞，使脂質(zhì)體在靶區(qū)釋放包裹物，具有主 動靶向功能。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體，可以主動靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞中釋放出Isthmin重組真核表達(dá)載體并表達(dá) Isthmin，從而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用，具有高效、低毒等優(yōu)點；目的之二在于提供所述 基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體的制備方法，操作簡便易行；目的之三在于提供所述基于 Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
1、基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體，由包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì) 體與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體共價結(jié)合而成。進(jìn)一步，所述Isthmin重組真核表達(dá)載體是將核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的 Isthmin基因插入真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點中而得到；進(jìn)一步，所述脂質(zhì)體由卵磷脂和膽固醇組成。2、所述基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟a、Isthmin重組真核表達(dá)載體的制備提取小鼠脾臟組織血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3 所示的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Not I和Xba I雙酶切，再 與同樣經(jīng)Not I和Xba I雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14在T4DNA連接酶的作用 下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性 克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，在p3xFLAG-CMV-14的Not I和Xba I位點之間插入了核苷酸序 列如SEQID No. 1所示的Isthmin基因的陽性克隆質(zhì)粒即為Isthmin基因重組真核表達(dá) 載體 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；將含有 p3xFLAG-CMV_14/Isthmin 的大腸桿菌 DH5 α 接種 于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，大量抽提質(zhì)粒，用超純水溶解，即得 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 溶液；b、Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體包封將卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中， 減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，在42°C水浴和 干冰中反復(fù)凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器，未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解，再用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離除去被 核酸酶降解的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；C、包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆 抗體的連接將抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包裹Isthmin基因 重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去游離的抗 第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體，即得基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體。進(jìn)一步，步驟a中PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件參數(shù)為95°C預(yù)變性10分鐘，然后94°C變 性1分鐘、58 °C退火1分鐘、72 °C延伸4分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。3、所述基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體在制備抗腫瘤血管生成的藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述腫瘤為結(jié)腸癌。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將Isthmin重組真核表達(dá)載體有效地包封在脂 質(zhì)體中形成納米級顆粒，并且與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體相連接，制成免疫脂質(zhì) 體。第VIII因子相關(guān)抗原(VWF)主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是血管生成標(biāo)志性抗原。因此， 本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體可以主動靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞中釋放出Isthmin重組 真核表達(dá)載體并表達(dá)Isthmin，從而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用，具有高效、低毒、制備方法 簡單等優(yōu)點，可以用于制備抗腫瘤血管生成的藥物，在抑制腫瘤血管生成方面具有良好的 應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測Isthmin基因的PCR產(chǎn)物；圖2為Western blot檢測包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體；圖3為透射電子顯微鏡觀察基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體；
圖4為各組細(xì)胞的增殖抑制率；圖5為各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線；圖6為各組荷瘤裸鼠的平均生存率；圖7為免疫組化法檢測各組荷瘤裸鼠的腫瘤新生血管密度。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體(Anti-vWF-Lip-Isthmin)的制備1、Isthmin重組真核表達(dá)載體的制備與檢測(1) Isthmin重組真核表達(dá)載體的制備取小鼠脾臟組織，加入液氮充分研磨后，稱取IOOmg置無RNA酶的離心管中，采用 RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提取血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書操作。根據(jù)GenBank登錄號為NM_001126490的Isthmin基因序列設(shè)計1對特異性引物， 在每條引物的5’端加上保護(hù)堿基，再在其后引入限制性內(nèi)切酶識別序列，引物序列如下 上游引物5，-gcggccgcatggtgcgcctggctgc-3，(SEQ ID No. 2)，下劃線部分為 Not I 酶切 位點；下游引物5，-tctagattagtactctctggcttcttgg-3，(SEQ IDNo. 3)，下劃線部分為 Xba I酶切位點；設(shè)計的引物委托上海生工公司進(jìn)行合成。采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa公司)將血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄 為cDNA，再以該cDNA為模板，采用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照試劑盒說明書操作； PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件參數(shù)為95°C預(yù)變性10分鐘，然后94°C變性1分鐘、58°C退火1分鐘、 72°C延伸4分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物用濃度為10g/L的瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行鑒定(如圖1所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為PCR產(chǎn)物，可見1 泳道在約1400bp處有一特異性條帶，與目的片段的分子量大小相符)，再用膠回收試劑盒 (TIANGEN公司)切膠回收純化目的片段，按照試劑盒說明書操作，即得兩端帶有Not I和 Xba I酶切位點的Isthmin基因。將兩端帶有Not I和Xba I酶切位點的Isthmin基因用Not I和Xba I (TaKaRa 公司)雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，與同樣經(jīng)Not I和Xba I雙酶切的真核表達(dá)載體 p3xFLAG-CMV-14 (Sigma-Aldrich公司)在T4DNA連接酶(TaKaRa公司)的作用下連接，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (TIANGEN公司)感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(AMP)的LB平板 篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中，溫度37°C振搖培 養(yǎng)12小時，用質(zhì)粒小量提取試劑盒(TIANGEN公司)提取質(zhì)粒，按照試劑盒說明書操作，所 得質(zhì)粒采用雙酶切法和PCR法鑒定并委托上海生工公司進(jìn)行測序驗證，在p3xFLAG-CMV-14 的Not I和Xba I位點之間插入有與SEQ ID No. 1所示核苷酸序列完全一致的DNA片段的陽性克隆質(zhì)粒即為Isthmin重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14/Isthmin。取含有p3xFLAG-CMV_14/Isthmin的大腸桿菌DH5 α (陽性克隆)，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中，溫度37°C振搖培養(yǎng)過夜，待培養(yǎng)液的光吸收值0D490nm達(dá)到1 1.5 時，采用超純質(zhì)粒抽提試劑盒(TIANGEN公司)大量抽提質(zhì)粒，按照試劑盒說明書操作，所得質(zhì)粒用超純水溶解，即得p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，用紫外分光光度計測定其A260值和A280值，根據(jù)A260/A280值估算其純度約1. 0，根據(jù)A260值計算其質(zhì)量濃度約1. Omg/
mLo(2) Isthmin重組真核表達(dá)載體的檢測Western blot檢測將cos_7細(xì)胞接種于6孔板中，用PRIM 1640培養(yǎng)基在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5 %的條件下培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞融合率達(dá)到約80 %時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 將 p3xFLAG_CMV_14/Isthmin 轉(zhuǎn)染入 cos_7 細(xì)胞，按照試劑說明書操作，同時設(shè)空載體對照，轉(zhuǎn)染4小時后，將培養(yǎng)液更換為I3RIM 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清液，采用His Bind融合蛋白純化試劑盒純化帶有His標(biāo)簽的Isthmin，按照試劑盒說明書操作。取純化蛋白溶液，采用質(zhì)量百分濃度為5%的濃縮膠、質(zhì)量百分濃度為12.5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后電轉(zhuǎn)印PVDF膜，用脫脂奶封閉1小時后，加入兔抗小鼠Isthmin多克隆抗體，37°C孵育1小時，PBST洗膜后，再加入羊抗兔IgG，37°C孵育1小時，PBST洗膜后，再加入發(fā)光底物，37°C孵育1分鐘，暗室中用X光片曝光，顯影，定影，觀察p3XFLAG-CMV-14/Isthmin在真核細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果見圖2，其中1泳道為從p3xFLAG-CMV-14/Isthmin轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞中提取并純化的蛋白溶液，2泳道為從p3xFLAG-CMV-14轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞中提取并純化的蛋白溶液；從圖可知，1泳道有一特異的蛋白質(zhì)條帶，與Isthmin的預(yù)期分子量大小一致，而2泳道無相應(yīng)條帶，表明p3xFLAG-CMV-14/Isthmin可以在真核細(xì)胞中正確表達(dá)Isthmin。2、包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體(Lip-Isthmin)的制備與檢測(I)Lip-Isthmin 的制備采用逆向蒸發(fā)法制備將卵磷脂2g和膽固醇0. 4g溶解于乙醚60mL中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲5分鐘，再加入濃度為0. 5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液20mL，在42°C水浴和干冰中反復(fù)凍融，并連續(xù)數(shù)次通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器(上海光健公司)，未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III (上海亞培公司)于37°C作用1小時后用乙二胺四乙酸終止反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠CL-4B柱(北方偉業(yè)公司)分離Lip-Isthmin和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin(由于脂質(zhì)體比p3xFLAG-CMV-14/Isthmin大，因此可通過凝膠過濾色譜將二者分離)。(2) Lip-Isthmin 的檢測透射電鏡觀察將Lip-Isthmin用濃度為3g/L的磷鎢酸溶液負(fù)染后，滴至專用銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干，置透射電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑分布。結(jié)果如圖3所示，所得Lip-Isthmin為球形或近球形小囊泡，粒徑分布范圍為50 120nm，平均粒徑低于 IOOnm0瓊脂糖凝膠電泳檢測將相同質(zhì)量的p3XFLAG-CMV-14/ISthmin、經(jīng)反復(fù)凍融的脂質(zhì)體、通過IOOnm薄膜擠出器的脂質(zhì)體以及經(jīng)核酸酶消化的脂質(zhì)體同時進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，可見經(jīng)核酸酶Dnase I和exonuclease III處理后，未包封入脂質(zhì)體的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin已經(jīng)被降解，而脂質(zhì)體能夠抵抗核酸酶的降解。同時通過Gel pro analyzer 4. O software軟件比較凝膠圖中DNA的條帶亮度，計算總DNA量和未包封入脂 質(zhì)體的DNA量，再根據(jù)公式包封率=[(總DNA量-未包封入脂質(zhì)體的DNA量)/總DNA 量]X 100%，計算得到 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 的包封率約為 82. 3%。3, Anti-vffF-Lip-Isthmin 的制備與檢測(l)Anti-vffF-Lip-Isthmin 的制備將小鼠抗人vWF單克隆抗體(SantaCruz公司)經(jīng)巰基化修飾后，與Lip-Isthmin 在室溫下輕搖連接過夜，用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離Anti-vWF-Lip-Isthmin和未連接的抗 vWF單克隆抗體(由于免疫脂質(zhì)體比抗體大，因此可通過凝膠過濾色譜將二者分離)。(2)Anti-vWF-Lip-Isthmin 的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測分別向收集到的Anti-vWF-Lip-Isthmin和未連接的抗 vWF單克隆抗體中，加入濃度為5g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(SDS能破壞脂質(zhì)體 的膜表面結(jié)構(gòu)，從而使脂質(zhì)體釋放內(nèi)部的包裹物)，同時設(shè)置不加入SDS的空白對照，混 勻靜置，取上清液進(jìn)行濃度為5g/L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，可見加入SDS的 Anti-vWF-Lip-Isthmin有一明亮的DNA條帶，而加入SDS的抗vWF單克隆抗體無相應(yīng)條帶 出現(xiàn)。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測將收集到的Anti-vWF-Lip-Isthmin和未連接的抗 vWF單克隆抗體分別包被96孔板，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為一抗做 直接ELISA實驗，以確定脂質(zhì)體表面是否已連接上抗體，結(jié)果Anti-vWF-Lip-Isthmin和未 連接的抗vWF單克隆抗體都呈陽性反應(yīng)，說明脂質(zhì)體表面已連接上抗體。二、基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體抗腫瘤血管生成作用檢測1、體外抗血管生成作用MTT比色法檢測分別將處于指數(shù)生長期的正常細(xì)胞DC2. 4和人臍靜脈血管內(nèi)皮 細(xì)胞HUVEC用含有濃度為100g/L的新生牛血清的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為1 X 106/mL的 懸液，接種至96孔板，每孔100 μ L，分成兩組對照組和實驗組，每組設(shè)3個復(fù)孔，對照組每 孔加入完全培養(yǎng)液100 μ L ；實驗組每孔加入終濃度為1 μ g/mL的基于Isthmin基因的免疫 脂質(zhì)體100 μ L ；在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)72小時，每孔再加入 濃度為5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，吸去上清，每孔再加入二甲基亞砜150 μ L，輕 搖10分鐘，用酶標(biāo)儀在波長490nm處測定各孔OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果如圖4所示，基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體對DC2. 4細(xì)胞的增殖抑制率為 9%，對HUVEC細(xì)胞的增殖抑制率為74%，表明本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體能夠有效抑制血管內(nèi)皮 細(xì)胞的增殖。2、體內(nèi)抗血管生成作用將荷瘤(結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26)裸鼠隨機(jī)分為三組對照組I、對照組II和實驗組， 對照組I尾靜脈注射生理鹽水；對照組II尾靜脈注射包封有P3XFLAG-CMV-14的免疫脂質(zhì) 體；實驗組尾靜脈注射基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體；每次100 μ L，每周1次，連續(xù)給藥 3次；觀察60天內(nèi)各組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；同時，取小鼠體內(nèi)腫 瘤組織，用免疫組化法檢測腫瘤新生血管密度(以抗⑶31單克隆抗體為一抗)。
各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線如圖5所示，第30天時，對照組I和對照組II 的小鼠腫瘤體積分別為2000mm3和1800mm3，而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為 1200mm3 ；各組荷瘤裸鼠的生存率如圖6所示，對照組I和對照組II的小鼠分別于第30天 和第35天全部死亡，而實驗組小鼠60天的生存率為60%，與對照組I和對照組II相比，實 驗組小鼠生存率高；各組荷瘤裸鼠的腫瘤新生血管密度檢測結(jié)果如圖7所示，第30天時，對 照組I和對照組II的小鼠⑶31陽性細(xì)胞數(shù)為35個，而實驗組小鼠的⑶31陽性細(xì)胞數(shù)為 12個，與對照組I和對照組II相比，實驗組小鼠的腫瘤新生血管密度低。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于由包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體共價結(jié)合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于所述Isthmin 重組真核表達(dá)載體是將核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的Isthmin基因插入真核表達(dá)載體 p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點中而得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體 由卵磷脂和膽固醇組成。
4.權(quán)利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括 以下步驟a、Isthmin重組真核表達(dá)載體的制備提取小鼠脾臟組織血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn) 錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3所示 的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Not I和Xba I雙酶切，再與同 樣經(jīng)Not I和Xba I雙酶切的真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-14在T4DNA連接酶的作用下連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克 隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，在p3xFLAG-CMV-14的Not I和Xba I位點之間插入了核苷酸序 列如SEQID No. 1所示的Isthmin基因的陽性克隆質(zhì)粒即為Isthmin基因重組真核表達(dá) 載體 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；將含有 p3xFLAG-CMV_14/Isthmin 的大腸桿菌 DH5 α 接種 于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，大量抽提質(zhì)粒，用超純水溶解，即得 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 溶液；b、Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體包封將卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中，減壓 蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，在42°C水浴和干 冰中反復(fù)凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器，未包封入脂質(zhì)體的p3xFLAG-CMV-14/ Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解，再用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離除去被 核酸酶降解的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；c、包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體 的連接將抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體經(jīng)巰基化修飾后，與包裹Isthmin基因重組 真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去未連接的抗第 VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體，即得基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于 步驟a中PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件參數(shù)為95°C預(yù)變性10分鐘，然后94°C變性1分鐘、58°C退 火1分鐘、72 °C延伸4分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
6.權(quán)利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體在制備抗腫瘤血管生成的藥物中 的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體的應(yīng)用，其特征在于所述 腫瘤為結(jié)腸癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于Isthmin基因的免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，該免疫脂質(zhì)體由包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體和抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體共價結(jié)合而成；其制備方法包括Isthmin重組真核表達(dá)載體的制備、Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體包封、包封有Isthmin重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體與抗第VIII因子相關(guān)抗原單克隆抗體的連接共3個步驟；該免疫脂質(zhì)體可以主動靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞中釋放出Isthmin重組真核表達(dá)載體并表達(dá)Isthmin，從而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用，具有高效、低毒、制備方法簡單等優(yōu)點，可用于制備抗腫瘤血管生成的藥物。
文檔編號A61K9/127GK101797229SQ20101010295
公開日2010年8月11日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)