專利名稱：一種空心核殼結構復合納米粒子及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物可降解高分子材料領域和藥物釋放領域，特別是涉及一種生物相容具有空心核殼結構的復合納米粒子的制備。
背景技術：
自從人們發現通過RNA干擾可以有效的抑制某些特定基因的活動以后，合成小片段的干擾RNA(siRNA)-干擾RNAi已經成為治療很多疾病的希望所在。然而，siRNA到達靶向細胞是否安全和有效嚴重阻礙了它的廣泛應用。由于聚陰離子性和大分子特性，未經修飾的siRNA不能很便利的穿過細胞膜因此需要特定的釋放載體去促進細胞吸收并實現細胞間的活性傳遞。研究者也希望利用這些載體來提高siRNA的藥理學特性，如降低其血清核酸的感應性、減少腎吸收、降低被單核巨噬吸收的機會。在大部分已發展的RNAi釋放載體中，陽離子脂質體與聚合物能高效的與siRNA自組裝形成納米復合體(脂質體或聚陽離子體)，而且表現出很好的釋放siRNA的潛能。然而， 這些材料中的大部分都會引起很多問題，例如毒性、免疫或炎癥反應及血漿不穩定性。在體內環境中，為了更好的保護siRNA和復合體，最理想的方法是將siRNA包裹到一種具有中性表面的納米粒子中。為此，已經實施了幾種方法，包括納米復合物的聚乙二醇化(例如鍵合聚乙二醇)和聚陽離子的脂質體包封(形成聚脂質體)。

發明內容
本發明針對現有技術的問題，開發出一種簡單且強有效的用于釋放siRNA的納米粒子，同時具有聚乙醇化脂質體和PLGA納米粒子的特性。不同于之前報道的雜化脂質體-聚合物體系，本發明提出一種具有四種不同組分的帶有區域化電荷的空心核/殼脂質體-聚合物-脂質體雜化納米結構及其制備方法。本發明的目的之一在于提供一種空心核殼結構復合納米粒子，所述納米粒子由內到外依次為陽離子脂質體、PLGA、中性脂質體以及最外層的可生物降解聚合物。所述納米粒子包埋有siRNA。帶有正電荷的脂質體層形成內層空的核，中間層是疏水的PLGA層，再外面一層是相對中性的脂質體，最外面一層是PEG。最外面一層連接脂質體的PEG層的目的是使得粒子可避開免疫系統，提高粒子在整個過程中的穩定性，減慢聚合物降解速率和藥物釋放速率。 中間的PLGA聚合物層是為了形成一個屏障使得siRNA可以持久釋放同時還可以裝載一些不溶水的藥物。最里層由陽離子脂質體組成的正電荷核，能夠比單獨使用PLGA具有更高的裝載siRNA的效率。本發明所述的脂質體(liposome)是一種人工膜。在水中磷脂分子親水頭部插入水中，脂質體疏水尾部伸向空氣，攪動后形成雙層脂分子的球形脂質體，直徑25 IOOOnm 不等。脂質體可用于轉基因，或制備的藥物，利用脂質體可以和細胞膜融合的特點，將藥物送入細胞內部。生物學定義當兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相時，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結構的封閉囊泡，稱為脂質體。藥劑學定義系指將藥物包封于類脂質雙分子層內而形成的微型泡囊體。本發明所述陽離子脂質體優選1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸。所述中性脂質體優選卵磷脂、DPPC、DPPE中的一種或幾種，優選卵磷脂。本發明所述PLGA是一種可降解的功能高分子有機化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域。 乳酸比乙醇酸疏水性強，相對而言，乳酸含量較大的PLGA親水性弱，吸水少，降解更加緩慢。PLGA的降解速度很大程度上取決于乳酸和乙醇酸的摩爾比。本發明PLGA特性粘度 0. 20-0. 74dL/g，鏈段摩爾比 L G = 90 10 40 60。所述可生物降解聚合物為PEO、PVA、PVAc、PLA、PCL、PEG、DSPE-PEGm中的一種或幾種,其重均分子量為10萬 150萬。所述DSPE-PEGm中PEG的重均分子量為500 5000。本發明的另一目的在于提供一種空心核殼結構復合納米粒子的制備方法，包括以下步驟(1)第一步乳化首先將PLGA和陽離子脂質體分別按質量體積比1 10%、0. 5 5%溶解到揮發性有機溶劑中形成有機溶液A ；同時制備siRNA質量體積比為0. 5 5%的水溶液B;按體積比1 5 1 15將水溶液B逐滴加入有機溶液A中，進行乳化形成乳液；(2)第二步乳化將可生物降解聚合物和中性脂質體分別按質量體積比1 5%、 0. 5 4%制成水溶液C ；按體積比1 10 5 2將(1)中得到的乳液加入水溶液C中， 進行乳化形成雙乳液D ；C3)粒子固化按體積比1 1 1 25將雙乳液D與水溶液C混合攪拌至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。所述的步驟( 后任選進行(4)粒子的后處理和收集對得到的粒子進行清洗， 清洗后將粒子收集到緩沖溶液中；所述的緩沖溶液優選磷酸鹽緩沖溶液。清洗過程可以將未揮發完全的溶劑和游離分子清洗徹底。本發明所述的清洗采用離心式過濾器進行，截留分子量設為lOOKDa。本發明所述步驟(3)中至少攪拌3小時。本發明所述的揮發性有機溶劑為二氯甲烷、丙酮、氯仿、四氫呋喃、乙醚中的一種或幾種，優選為二氯甲烷。超聲乳化是利用強超聲波作用使液體中的不溶固體(或其他液體)粉碎成微粒并與周圍液體充分混合形成乳化液的技術。本發明所述的乳化優選超聲乳化。本發明所述的質量體積比是指溶質質量(g)與溶劑體積(mL)的比值。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果該方法新穎簡單且易操作，屬于物理包埋方法，因此對包埋的SiRNA基本不產生任何損害。得到的納米粒子在磷酸鹽緩沖溶液中直徑為025士8)nm，而細胞培養液中的納米粒子尺寸增加到062士 10)nm，粒子在兩種溶液中尺寸都能保持恒定。制備該方法制備的載體包埋量大(每毫克PLGA大約為364-383pmolSiRNA)且包埋率高(78-82% )，在藥物釋放領域具有很廣泛的應用前景。下面對本發明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，并不代表或限制本發明的權利保護范圍，本發明的權利范圍以權利要求書為準。
具體實施例方式為更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下實施例一(1)第一步乳化首先將PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸分別按質量體積比2%、1. 5%溶解到二氯甲烷中形成有機溶液A ；同時制備siRNA 質量體積比為2%的水溶液B;按體積比1 5 1 10將水溶液B逐滴加入有機溶液A 中，進行超聲乳化形成乳液；(2)第二步乳化將DSPE-PEGm和卵磷脂分別按質量體積比3%、1. 5%制成水溶液 C;按體積比3 5將(1)中得到的乳液加入水溶液C中，進行超聲乳化形成雙乳液D ；所述 DSPE-PEGm中PEG的重均分子量為500 5000。(3)粒子固化按體積比1 5將雙乳液D與水溶液C混合攪拌3小時至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。實施例二 (1)第一步乳化首先將PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸分別按質量體積比1%、5%溶解到丙酮中形成有機溶液A ；同時制備siRNA質量體積比為3%的水溶液B;按體積比1 5將水溶液B逐滴加入有機溶液A中，進行超聲乳化形成乳液；(2)第二步乳化將PCL和DPPC分別按質量體積比5%、4%制成水溶液C ；按體積比1 10將(1)中得到的乳液加入水溶液C中，進行超聲乳化形成雙乳液D ；(3)粒子固化按體積比1 25將雙乳液D與水溶液C混合攪拌10小時至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。(4)粒子的后處理和收集對得到的粒子進行清洗，清洗后將粒子收集到磷酸鹽緩沖溶液中。實施例三(1)第一步乳化首先將PLGA和1，2_二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸分別按質量體積比10%、0. 5%溶解到四氫呋喃中形成有機溶液A ；同時制備SiRNA 質量體積比為0.5%的水溶液B;按體積比1 15將水溶液B逐滴加入有機溶液A中，進行超聲乳化形成乳液；(2)第二步乳化將PVAc和卵磷脂分別按質量體積比1%、2. 5%制成水溶液C ；按體積比5 2將(1)中得到的乳液加入水溶液C中，進行超聲乳化形成雙乳液D ；(3)粒子固化按體積比1 1將雙乳液D與水溶液C混合攪拌5小時至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。(4)粒子的后處理和收集對得到的粒子進行清洗，清洗后將粒子收集到磷酸鹽緩沖溶液中。實施例四(1)第一步乳化首先將PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸分別按質量體積比6%、1%溶解到乙醚中形成有機溶液A ；同時制備siRNA質量體積比為5%的水溶液B;按體積比1 12將水溶液B逐滴加入有機溶液A中，進行超聲乳化形成乳液；(2)第二步乳化將PEO和DPPE分別按質量體積比3. 2%,0. 5%制成水溶液C ；按體積比1 1將(1)中得到的乳液加入水溶液C中，進行超聲乳化形成雙乳液D ；C3)粒子固化按體積比1 13將雙乳液D與水溶液C混合攪拌15小時至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。實施例五(1)第一步乳化首先將PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸分別按質量體積比5. 5%、4%溶解到氯仿中形成有機溶液A ；同時制備siRNA質量體積比為3%的水溶液B;按體積比1 7將水溶液B逐滴加入有機溶液A中，進行超聲乳化形成乳液；(2)第二步乳化將PEG和卵磷脂分別按質量體積比1. 5%、3%制成水溶液C ；按體積比3 2將(1)中得到的乳液加入水溶液C中，進行超聲乳化形成雙乳液D ；(3)粒子固化按體積比1 15將雙乳液D與水溶液C混合攪拌8小時至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。(4)粒子的后處理和收集對得到的粒子進行清洗，清洗后將粒子收集到磷酸鹽緩沖溶液中。本發明所述可生物降解聚合物的重均分子量為10萬 150萬，所述PLGA特性粘度0. 20-0. 74dL/g，鏈段摩爾比L G = 90 10 40 60，均可實現其相應功能。申請人:聲明，所屬技術領域的技術人員在上述實施例的基礎上，將上述實施例某組分的具體含量點值，與發明內容部分的技術方案相組合，從而產生的新的數值范圍，也是本發明的記載范圍之一，本申請為使說明書簡明，不再羅列這些數值范圍。申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的制備方法，但本發明并不局限于上述制備方法，即不意味著本發明必須依賴上述制備方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用的具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
權利要求
1.一種空心核殼結構復合納米粒子，其特征在于，所述納米粒子由內到外依次為陽離子脂質體、PLGA、中性脂質體以及最外層的可生物降解聚合物。
2.如權利要求1所述的納米粒子，其特征在于，所述納米粒子包埋有siRNA。
3.如權利要求1或2所述的納米粒子，其特征在于，所述陽離子脂質體優選1， 2- 二 _(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基膽堿磷酸。
4.如權利要求1-3之一所述的納米粒子，其特征在于，所述PLGA特性粘度 0. 20-0. 74dL/g，鏈段摩爾比 L G = 90 10 40 60。
5.如權利要求1-4之一所述的納米粒子，其特征在于，所述中性脂質體優選卵磷脂、 DPPC、DPPE中的一種或幾種，優選卵磷脂。
6.如權利要求1-5之一所述的納米粒子，其特征在于，所述可生物降解聚合物為ΡΕ0、 PVA, PVAc, PLA、PCL、PEG、DSPE-PEGm中的一種或幾種，其重均分子量為10萬 150萬。
7.如權利要求6所述的納米粒子，其特征在于，所述DSPE-PEGm中PEG的重均分子量為 500 5000。
8.—種如權利要求2-7之一所述的納米粒子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)第一步乳化首先將PLGA和陽離子脂質體分別按質量體積比1 10%、0.5 5% 溶解到揮發性有機溶劑中形成有機溶液A ；同時制備siRNA質量體積比為0. 5 5%的水溶液B;按體積比1 5 1 15將水溶液B逐滴加入有機溶液A中，進行乳化形成乳液；(2)第二步乳化將可生物降解聚合物和中性脂質體分別按質量體積比1 5%、 0.5 4%制成水溶液C;按體積比1 10 5 2將(1)中得到的乳液加入水溶液C中， 進行乳化形成雙乳液D ；(3)粒子固化按體積比1 1 1 25將雙乳液D與水溶液C混合攪拌至二氯甲烷揮發完全，固化得到復合納米粒子。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)后任選進行(4)粒子的后處理和收集對得到的粒子進行清洗，清洗后將粒子收集到緩沖溶液中；所述的緩沖溶液優選磷酸鹽緩沖溶液。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中至少攪拌3小時。
全文摘要
本發明涉及一種空心核殼結構復合納米粒子及其制備方法，所述納米粒子由內到外依次為陽離子脂質體、PLGA、中性脂質體以及最外層的可生物降解聚合物。其制備通過先兩步乳化、再對粒子進行固化、清洗等后處理，最終將制得的納米粒子收集于緩沖溶液中儲存。該方法新穎簡單且易操作，屬于物理包埋方法，因此對包埋的siRNA基本不產生任何損害，粒子尺寸能保持恒定。該方法制備的載體包埋量大且包埋率高(78-82％)，在藥物釋放領域具有很廣泛的應用前景。
文檔編號A61K47/28GK102362861SQ201110346669
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者許杉杉, 韓志超 申請人:無錫中科光遠生物材料有限公司