專利名稱：一種西藏豚蝎抗人免疫缺陷病毒多肽的制作方法
一種西藏豚蝎抗人免疫缺陷病毒多肽技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高效抗病毒功能的多肽。具體地說，本發(fā)明涉及一種西藏豚蝎抗病毒多肽AHIVP及其對人免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒作用。
背景技術(shù)：
病毒分布廣泛，能引起各種人類疾病，難以治療，危害人類健康。比如HIV病毒引起的獲得性人類免疫缺陷癥(AIDQ，該病患者的免疫功能部分或完全喪失，CD4+細胞數(shù)目減少，繼而發(fā)生機會性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。該病傳播速度快、病死率高，且目前無法治愈。流感目前沒有藥物可以治愈，市面上的流感藥物只能夠減輕流感癥狀，通過人體自身的免疫能力對抗病毒。現(xiàn)在比較有效的方法是注射流感疫苗預(yù)防，有效率為70%至 90%。由于流感病毒極容易發(fā)生變異，每年流行的流感病毒類型不一樣，因此必須每年注射疫苗才能發(fā)揮作用。乙肝沒有辦法治愈，但是可以控制不發(fā)作，一旦感染，終生攜帶。病毒很難殺滅，是由于病毒使用了寄主的活動機制?，F(xiàn)有的抗病毒藥物一般為病毒遺傳物質(zhì)復(fù)制的抑制劑，這些抑制劑也會抑制人體的遺傳物質(zhì)復(fù)制，對人體也是具有毒性的，所以現(xiàn)在最積極的預(yù)防病毒的方法還是接種疫苗。但是有些病毒如流感、HIV，其自身遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定， 容易發(fā)生突變，從而使得在此之前的疫苗對這種新的突變病毒的預(yù)防作用降低或者完全失效。而陽離子防御肽的發(fā)現(xiàn)使人們看到了治療病毒疾病的新方法。
陽離子防御肽是一類由宿主生成，并且在天然免疫中特異性發(fā)揮防御性作用的一類小肽。這一類小分子多肽通常由10-50個氨基酸構(gòu)成，靜電荷從+2到+9不等，在生物體抵御微生物的入侵中發(fā)揮重要的作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差別，陽離子防御肽可以分為如下幾類 含有2-4個β片層的兩親性分子、兩親性α螺旋、卷曲結(jié)構(gòu)、以及含有高級結(jié)構(gòu)的分子。陽離子防御肽在體內(nèi)對細菌、真菌、寄生蟲、以及病毒的侵染均有有效的抵御作用。研究表明， 蜂毒溶血肽Melitiin和天蠶素Cecropins在亞毒性濃度下通過阻遏基因表達來抑制HIV-I 病毒的增殖，爪蟾抗菌肽Magainin-2對皰疹病毒HIV-I和HIV-2有一定的抑制效果，這些多肽都是α螺旋類陽離子防御肽。目前的研究表明，α螺旋類陽離子防御肽特異性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒進入的過程，或者是直接作用于病毒的包膜。例如，Dermas印tin就是通過作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，從而達到抗病毒的作用。所以，陽離子防御肽不再是傳統(tǒng)的疫苗防治，而是通過直接抑制病毒達到抗病毒的目的。
蝎子中陽離子防御肽的研究也已經(jīng)有多年的歷史。其中除了從淋巴系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的防御肽外，更多的是從蝎毒腺中分離到的防御肽，例如hadrurin，Scorpine，opistoporin， parabutoporin, ISCT，pandinin。這些肽的功能都已經(jīng)得到有效的鑒定。本室長期從事蝎毒素的研究，目前從文庫中篩選并鑒別系列陽離子多肽。
AHIVP是一種具有抗病毒能力陽離子防御肽，我們目前的研究結(jié)果顯示AHIVP抗病毒能力強，毒性低；加上AHIVP只有13個氨基酸，工業(yè)生產(chǎn)成本低，所以將陽離子抗病毒肽AHIVP應(yīng)用于抗病毒藥物具有廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種蝎毒抗病毒多肽，抗病毒活性高，該抗病毒肽含有13個氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。本發(fā)明還涉及所提供的蝎毒抗病毒多肽在制備預(yù)防和治療HIV感染的藥物中的應(yīng)用。所提供的蝎毒抗病毒多肽AHIVP具有抑制病毒感染的功能，抑制效果好，無副作用。為了實現(xiàn)上述目的，采用化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗病毒多肽AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽，抗病毒試驗結(jié)果表明，抗病毒多肽AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽對HIV有明顯的抑制作用。當(dāng)AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽的濃度達到10 μ g/mL時，AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽對 HIV的抑制率就可以100%抑制。本發(fā)明提供了一種西藏豚蝎抗HIV多肽。首先構(gòu)建高質(zhì)量西藏豚蝎毒腺組織cDNA文庫，具體包括蝎毒腺總RNA的分離和 mRNA純化，cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體(購自美國hvitrogen) 的連接和轉(zhuǎn)化，獲得蝎毒腺組織cDNA文庫。在構(gòu)建文庫的基礎(chǔ)上，進行規(guī)模文庫測序，序列分析發(fā)現(xiàn)了一個新的西藏豚蝎抗菌肽基因，命名為AHIVP。一種分離的多肽基因，其序列為 SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列aaagttccaatctgttgttccgatgcactctgaaacttaattaatg aaattttctcttcagaccttcctttttaattacgttttaaaactagcaatttcacaatcagaagctttcattcacaa aatttcacaccttctccacagaatttttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatcagaag ctagtttgagtgcagctgacttgagaaccttacaaagactaatggaaaattactgattattataattgaatatctct ataatgtttttagaaatatttttatacttttgaaaaaaaaaaa。AHIVP 的前體組織形式編碼 70 個氨基酸殘基，由三個部分組成，即信號肽(23個殘基)、成熟肽(13個殘基)和前體肽(34個殘基)。基于蝎毒素前體C末端殘基的加工規(guī)則，AHIVP末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶 (Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化(

圖1)。因此，本發(fā)明提供一個西藏豚蝎蝎毒抗菌肽:FIHKISHLLHRIF(SEQ ID NO 2)。本發(fā)明另一目的是公開了一組西藏豚蝎AHIVP多肽的同源結(jié)構(gòu)多肽。其序列為SEQ ID NO :3 22所示的氨基酸序列。根據(jù)AHIVP的成熟肽序列(FIHKISHLLHRIF)，使用在線 NPSOserver[DSC 法(Discrimination of protein Secondary structure Class)]對其進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并利用軟件AHTHEPR0T2000顯示其二級結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，AHIVP含有100%的α-Helix結(jié)構(gòu)，具有典型的兩親性 (amphiphilic) α -Helix結(jié)構(gòu)，含有大量帶凈正電荷的堿性殘基(His、Arg和Lys)。根據(jù)螺旋圖像，然后對AHIVP多肽序列FIHKISHLLHRIF進行大量點突變或缺失(表1)，發(fā)現(xiàn) FIX1X2IX3X4LLX5X6IF(X1、X2、X4、X5、X6為任意堿性氨基酸，X3為任意氨基酸)序列并不影響其雙親性的特征。因此，本發(fā)明提供了一組西藏豚蝎AHIVP多肽的同源結(jié)構(gòu)多肽(SEQ ID NO 3 22)。本發(fā)明提供的AHIVP多肽及其結(jié)構(gòu)同源多肽可以高效抗人免疫缺陷病毒。通過固相化學(xué)合成的辦法，得到了純度達98%以上的合成多肽AHIVP (圖2和圖 3)及其結(jié)構(gòu)同源多肽?？共《窘Y(jié)果表明合成多肽AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽對HIV增殖的高效抑制作用，在10 μ g/mL時，AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽對HIV的抑制率可以達到100%抑制 (表2、圖4、圖5)。
表1 西藏琵蝎抗HIV病毒多肽AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽多肽名稱氨基酸序列突變性質(zhì)a螺旋值A(chǔ)HIVPFIHKISHLLHRIF野生型100%AHIVP-MlFIHKISRLLKRIF堿性100%AHIVP-M2FIHKIARLLHRIF堿性100%AHIVP-M3FIRKIHRLLKRIF堿性100%AHIVP-M4FIRKIIRLLKRIF非極性100%AHIVP-M5FIRRIARLLKRIF非極性和堿性100%AHIVP-M6FIRRIRRLLKRIF堿性100%AHIVP-M7FIRKIAKLLKRIF非極性和堿性100%AHIVP-M8FIRKIAHLLKRIF非極性和堿性100%AHIVP-M9FIRKIDRLLHRIF非極性和酸性100%AHIVP--MlOFIRKIDRLLKRIF堿性和酸性100%AHIVP--MllFIRKILRLLRRIF非極性和堿性100%AHIVP--M12FIRKISHLLRRIF極性和堿性100%AHIVP--Ml 3FIRRISHLLKKIF極性和堿性100%AHIVP--M14FIRRIARLLKRIF極性和堿性100%AHIVP--Ml 5FIHKIHLLHRIF缺失100%AHIVP--Ml 6FIHKISHLHRIF缺失100%AHIVP--Ml 7FIHKISHLLHRF缺失100%AHIVP--Ml 8FHKISHLLHRIF缺失100%AHIVP--Ml 9FIHKIHLHRIF缺失100%AHIVP--M20FHKIHLLHRIF缺失100%
表2 西藏琵蝎多肽AHIVP及其結(jié)構(gòu)同源多肽抗HIV的IC5tl
權(quán)利要求
1.一種分離的西藏豚蝎抗病毒多肽AHIVP，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的基因，其核苷酸序列為SEQID N0:1所示。
3.—組以權(quán)利要求1所述多肽AHIVP為模版的結(jié)構(gòu)同源多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO 3"22 所示。
4.權(quán)利要求3所述多肽的一個或多個氨基酸殘基被甲基化、糖基化、磷酸化或乙?；揎椝玫降陌被嵝蛄小?br> 5.權(quán)利要求3所述多肽的一個或多個氨基酸殘基被缺失或取代所得到的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1所述的AHIVP多肽和權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)同源多肽在制備預(yù)防或治療 HIV感染的藥物上的應(yīng)用。
7.預(yù)防或治療HIV感染的藥物，其中含有權(quán)利要求1所述的AHIVP多肽或權(quán)利要求3 所述的結(jié)構(gòu)同源多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種西藏豚蝎抗HIV多肽。通過分子生物學(xué)和化學(xué)合成的方法，獲得西藏豚蝎抗人免疫缺陷病毒多肽AHIVP，然后采用抗體中和法測定了該蝎毒抗病毒多肽對人免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒活性，在低濃度可以有效抑制HIV病毒感染。西藏豚蝎活性多肽AHIVP在治療或預(yù)防由HIV病毒引起的疾病中，有很好的前景。本發(fā)明的抗病毒多肽對HIV活性良好，方法簡便，可用于制備抗HIV病毒藥物進一步開發(fā)利用。
文檔編號A61P31/18GK102516365SQ201110457978
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者吳英亮, 曹志賤, 李文鑫 申請人:武漢大學(xué)