專利名稱：人pbx1基因的用途及其相關藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及人PBXl基因的用途及其相關藥物。
背景技術：
核糖核酸干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA介導的序列特異性的轉錄后基因沉默現象。RNAi技術具有較高的轉錄后沉默效率和特異性，有望成為腫瘤疾病基因治療的工具(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。質粒或病毒載體可操縱一段 45_50nt 的發夾結構RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達，shRNA在細胞內會自動被加工成為小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，繼而引發基因沉默或者表達抑制。慢病毒載體具有攜帶基因片段容量大、轉染效率高、不易誘發宿主免疫反應、可穩定抑制靶基因的表達等優點，已被廣泛應用于基因治療、疫苗生產以及科學研究等領域 (SinnPL， Sauter SL, McCray PB.Gene therapy progress and prospects !development of improved lentiviral and retroviral vectors—design，biosafety，and production. Gene Ther 2005 ；12 :1089-98.)。前B 細胞白血病轉錄因子 I (pre-B-cell leukemia homeobox 1，PBX1)屬于具有調節胚胎發育功能的TALE(three amino acid loop extension)家族蛋白，可以和 H)X、Meis等家族蛋白一起結合到DNA的保守區5' -ATCAATCAA-Sr，調節許多重要基因的轉錄(Krosl J，Baban S，Krosl G，Rozenfeld S，Largman C，Sauvageau G. Cellular proliferation and transformation induced by H0XB4 and HOXB3 proteins involves cooperation with PBXl. Oncogene. 1998 ; 16(26) :3403-12. Pan L，Xie Y，Black TA， Jones CA，Pruitt SC，Gross KW. An Abd-B class H0X. PBX recognition sequence is required for expression from the mouse Ren-lcgene. J Biol Chem. 2001 ；276 (35) 32489-94. Moens CB，Selleri L. Hox cofactors in vertebrate development. Dev Biol. 2006 ；291 (2) :193-206. Knoepfler PS, Calvo KR，Chen H，Antonarakis SE，Kamps MP. Meis land pKnoxI bind DNA cooperatively with Pbxl utilizing an interaction surface disrupted in oncoprotein E2a-Pbxl. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 ；94(26) 14553-8. Okada Y，Nagai R，Sato T，Matsuura E，Minami T，Morita I，Doi T. Homeodomain proteins MEISl and PBXs regulate the lineage-specific transcription of the platelet factor 4 gene. Blood. 2003 ; 101 (12) :4748-56.)。PBXl 基因在調節血液細胞產生、維持造血干細胞和胚胎干細胞的自我更新過程中發揮重要功能(Chiba S. Homeobox genes in normal hematopoiesis and leukemogenesis. Int J Hematol. 1998 ；68 (4) 343-53. Chan KK，Zhang J，Chia NY,Chan YS,Sim HS，Tan KS,Oh SK,Ng HH，Choo AB. KLF4 and PBXl directly regulate NANOG expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2009 ；27 (9) :2114-25.)。與其它TALE家族蛋白類似，PBXl基因還在組織發育中發揮重要作用，如調節成骨形成，脾臟、腎臟的胚胎發育和泌尿生殖器官的分化等(CheungCL，Chan BY，Chan V，Ikegawa S，Kou I，Ngai H，Smith D，Luk KD,Huang QY,Mori S，Sham PC, Kung AW. Pre-B-cell leukemia homeobox I (PBXl) shows functional and possible genetic association with bone mineral density variation. Hum Mol Genet. 2009 ； 18(4) :679-87. Brendolan A，Rosado MM，Carsetti R，Selleri L, Dear TN. Development and function of the mammalian spleen. Bioessays. 2007 ；29 (2) :166-77. Yu J,McMahon AP, Valerius MT. Recent genetic studies of mouse kidney development. Curr Opin Genet Dev. 2004 ; 14(5) :550-7. Schnabel CA，Selleri L, Cleary ML. Pbxlis essential for adrenal development and urogenital differentiation. Genesis. 2003 ；37 (3) 123-30.)。該基因的表達缺失會導致胚胎致死和多種組織器官異常。 PBXl位于染色體Iq21_q24，處于II型糖尿病易感基因位點，與糖尿病的發生密切相關(Duesing K，Charpentier G，Marre M，Tichet J，Hercberg S，Balkau B， Froguel P，Gibson F. Evaluating the association of common PBXlvariants with type 2diabetes. BMC Med Genet. 2008 ；9 :14. Thameem F，Wolford JK, Bogardus C，Prochazka M. Analysis of PBXlas a candidate gene for type 2 diabetes mellitus in Pima Indians. Biochim Biophys Acta. 2001 ;1518 (1-2) :215-20.)。近年來，PBXl 基因在惡性腫瘤中的作用日益受到研究者的關注。在急性淋巴系白血病中經常發現TOXl基因和其它基因的融合突變，形成 E2A-PBX1、EWSR1-PBX1 等融合蛋白(Thorsteinsdottir U，Krosl J，Kroon E，Haman A，Hoang T，Sauvageau G. The oncoprotein E2A~Pbxla collaborates with Hoxa9 to acutely transform primary bone marrow cells. Mol Cell Biol.1999 ； 19(9) :6355-66. Monica K，LeBrun DP, Dedera DA, Brown R，Cleary ML. Transformation properties of the E2a~Pbxl chimeric oncoprotein fusion with E2a is essential， but the Pbxl homeodomain is dispensable. Mol Cell Biol. 1994 ; 14 (12) :8304-14. Aspland SE， Bendall HH， Murre C.The role of E2A-PBX1 in leukemogenesis. Oncogene. 2001 ;20 (40) :5708-17. Brandal P，Panagopoulos I, Bjerkehagen B, Gorunova L，Skjeldal S，Micci F，Heim S. Detection of a t (I ；22) (q23 ；ql2) translocation leading to an EWSR1-PBX1 fusion gene in a myoepithelioma. Genes Chromosomes Cancer. 2008 ；47 (7) :558-64.)。融合蛋白的產生主要是由于發生了染色體移位，這些融合蛋白可以調節許多下游癌基因的表達繼而導致白血病細胞的增殖，如可以促進Bmi-I 基因表達繼而降低下游INK4A-ARF基因表達(Smith KS, Chanda SK, Lingbeek M，Ross D T， Botstein D， van Lohuizen M， Cleary ML Bmi-I regulation of INK4A-ARF is a downstream requirement for transformation of hematopoietic progenitors by E2a-Pbxl.Mol Cell. 2003 ；12(2) :393-400.)。PBXl在人食管鱗狀細胞癌組織中表達異常上調(Liu DB，Gu ZD, Cao TL, Liu H，Li JY. Immunocytochemical detection of HoxD9and Pbxlhomeodomain protein expression in Chinese esophageal squamous cell carcinomas. World J Gastroenterol. 2005 ；11 (10) :1562-6.) 在前列腺癌中， PBXl的高表達促進雄激素非依賴性的前列腺癌細胞的增殖(Kikugawa T Kinugasa Y， Shiraishi K,Nanba D,Nakashiro K,Tanji N，Yokoyama M,Higashiyama S. PLZF regulates Pbxltranscription and Pbxl-HoxC8 complex leads to androgen-independent prostate cancer proliferation. Prostate. 2006 ；66 (10) : 1092-9.)。在卵巢癌中，PBXl 作為 Notch3的下游基因介導腫瘤細胞的存活(Park JT, Shih IeM, Wang TL. Identification of Pbxl, a potential oncogene,as a Notch3target gene in ovarian cancer. Cancer Res. 2008 ； 68(21) :8852-60.)?；谝陨螾BXl基因在人食管鱗狀細胞癌、前列腺癌和卵巢癌等腫瘤中的報道，推測PBXl有望成為腫瘤治療的靶點。然而，目前PBXl基因在肺癌、肝癌和乳腺癌發生和發展中的角色尚未闡明。因此，有必要深入研究PBXl在上述肺癌、肝癌和乳腺癌細胞惡性增殖中的作用以及影響腫瘤細胞的增殖的分子機制。

發明內容
本發明的目的在于公開與人PBXl (pre-B-cell leukemia homeobox I)基因相關的治療方法及藥物。為了深入研究PBXl在腫瘤發生中的調節功能，本發明選取人肺癌 H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞、人胃癌細胞SGC7901和人胰腺癌 Panc-I細胞為模型，以RNAi為手段研究PBXl在上述腫瘤細胞的存活和凋亡命運中的作用。本發明第一方面，公開了將人PBXl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人 PBXl基因用于制備腫瘤診斷藥物。人PBXl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容其一，將人PBXl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其；，將人 PBXl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將人PBXl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標具體是指將人 PBXl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞產生RNA干擾作用的靶標，從而能降低腫瘤細胞人 PBXl基因的表達水平。所述將人PBXl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指JfAPBXI基因作為作用對象對藥物或制劑進行篩選，以找到可以抑制或促進人PBXl基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之后所述的人PBXl基因小分子干擾RNA即是以人PBXl基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將PBXl基因作為作用對象。所述將人PBXl基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將人PBXl基因表達產物作為一項腫瘤診斷指標應用于腫瘤診斷藥物的制備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人PBXl基因的表達相關的任一種腫瘤， 更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自肺癌、肝癌和乳腺癌。所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。進一步的，所述腫瘤治療藥物能降低人PBXl基因的表達水平從而抑制腫瘤細胞的增殖。采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人PBXl基因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療目的的。具體的，治療時，將能有效降低人PBXl基因表達水平的物質給藥于患者。進一步的，所述的能有效降低人PBXl基因表達水平的物質，包括能夠特異性沉默人PBXl基因表達的小分子干擾RNA(siRNA)。該小分子干擾RNA(siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內源PBXl基因的表達的作用。
進一步的，所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1_29之任一的序列作為特異性沉默人PBXl基因表達的靶點序列。所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO : 1_29之任一的序列作為特異性沉默人 PBXl基因表達的靶點序列是指該小分子干擾RNA能與SEQ ID NO :1_29中的任一種序列所編碼的mRNA片段特異性結合，并特異性沉默人PBXl基因的表達。進一步的，所述能夠特異性沉默人PBXl基因表達的小分子干擾RNA(SiRNA)經由慢病毒載體表達。具體而言，這個過程包括將編碼所述人PBXl基因小分子干擾RNA的DNA 片段克隆入慢病毒載體獲得人PBXl基因干擾慢病毒載體，進而利用該人PBXl基因干擾慢病毒載體經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞并最終表達所述siRNA。人PBXl基因干擾慢病毒載體為將編碼所述人PBXl基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產生人PBXl基因小分子干擾RNA。進一步的，所述的慢病毒載體可選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP, pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、pLKO. l-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一種慢病毒載體，本發明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發明第；方面，公開了一種分離的人PBXl基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標片段，其序列為SEQ ID NO 1-29中任意一條序列。所述分離的人PBXl基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標片段可應用于人PBXl基因小分子干擾RNA的篩選與制備。本發明第三方面，公開了一種人PBXl基因小分子干擾RNA(SiRNA)，能夠特異性沉默人PBXl基因的表達。所述人PBXl基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO : 1_29之任一的序列作為特異性沉默人PBXl基因表達的靶點序列。進一步的，所述人PBXl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段， 所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID NO :1_29中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條 RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15_27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。進一步的，所述人PBXl基因小分子干擾RNA為發夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、莖環片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環片段分隔；其中，正義RNA片段和反義RNA片段互補，正義RNA片段的序列選自SEQ ID NO :1_29之任一。
所述莖環片段結構包括6個或9個堿基。進一步的所述莖環片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC。本發明具體列舉了以 UUCAAGAGA 為莖環。如實施例列舉的，所述人PBXl基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO 30 =GCAU CA⑶GCUAAUGGAG⑶UUUCAAGAGAAACCUCCAUUAGCACUGAUGC。本發明第四方面，公開了一種人PBXl基因干擾核酸構建體，包含編碼前述人PBXl 基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達前述人PBXl基因小分子干擾RNA。所述的人PBXl基因干擾核酸構建體可以是將編碼前述人PBXl基因小分子干擾 RNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述人PBXl基因干擾核酸構建體為人PBXl基因干擾慢病毒載體，為將編碼所述人PBXl基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產生人PBXl 基因小分子干擾RNA。所述慢病毒載體可以選自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP, pLKO.1-puro-CMV-tGFP, pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、pLKO. l-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635、pLKO. l-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本發明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構建的人PBXl基因干擾核酸構建體,命名為 pGCSIL-GFP-PBXI-shRNA。進一步的，編碼所述人PBXl基因小分子干擾RNA的基因片段的序列含有SEQ IDNO 1-29中之任一序列及其互補序列。本發明的人PBXl基因小分子干擾RNA可用于抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或制劑。人PBXl基因干擾核酸構建體則可用于制備所述人 PBXl基因小分子干擾RNA。當用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的人PBXl基因小分子干擾RNA 施用于哺乳動物。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。本發明第五方面，公開了一種人PBXl基因干擾慢病毒，由前述人PBXl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞并產生人PBXl基因小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本發明第六方面，還公開了一種藥物組合物，含有治療有效量的人PBXl基因小分子干擾RNA或人PBXl基因干擾慢病毒。進一步的，所述藥物組合物含有I 99wt%如前所述的人PBXl基因小分子干擾 RNA或人PBXl基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑 (如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發明設計了針對人PBXl基因的29個RNAi靶點序列，構建相應的 PBXlRNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO 27 的 RNAi 載體 pGCS IL-GFP-PBXI-shRNA 能夠顯著下調PBXl基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv) 作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCS IL-GFP-PBXI-shRNA能夠靶向地將針對PBXl基因的RNAi序列高效導入人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞、胃癌 SGC7901細胞和胰腺癌Panc-I細胞，降低PBXl基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的PBXl基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術治療方式。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人PBXl基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中PBXl 基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。


圖I表示pGCSIL-GFP質粒DNA圖譜。圖2表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞、胃癌SGC7901細胞和胰腺癌Panc-I細胞5天后，PBXlmRNA的表達水平顯著降低。圖3表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人肺癌H1299細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖4表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人肝癌SMMC-7721細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖5表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖6表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人胃癌SGC7901細胞5天后，顯著抑制細胞增殖圖7表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖8使用PBX-I抗體在腫瘤組織樣本上的免疫組化檢測結果a、b人乳腺癌，c胰腺癌，d、e肺癌，f、g、h、i胃癌
具體實施例方式本發明基于PBXl在人食管鱗狀細胞癌、前列腺癌和卵巢癌腫瘤組織中顯著高表達，認為PBXl還可能參與了人肺癌、肝癌和乳腺癌的發生和發展。本發明涉及了一組針對人PBXl基因的小分子干擾RNA(SiRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人PBXlmRNA編碼區序列作為siRNA的靶位點，根據靶位點中連續的10-30(優選15-27，更優選19-23)個堿基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克隆， 構建表達上述siRNA的核酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上述 siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內源PBXl基因的表達。發明人發現，采用RNAi方法下調人PBXl基因的表達后可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，這一研究成果表明PBXl基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發明人進一步合成和測試了多種針對PBXl基因的siRNA，篩選出了可有效抑制PBXl的表達進而抑制人肺癌H1299細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MCF-7細胞胃癌SGC7901和胰腺癌Panc-I細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發明。本發明提供了一系列特異性針對人PBXl基因的小干擾RNA(SiRNA)序列，構建了可特異性沉默PBXl基因表達的慢病毒。本發明研究發現，針對人PBXl基因設計的小干擾 RNA及RNAi慢病毒，穩定并特異地下調PBXl基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。 本發明表明PBXl基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且， 通過RNAi方式沉默PBXl基因的表達，可作為抑制腫瘤發展的有效手段。本發明的設計思路為本發明通過如下方法來篩選獲得一種人PBXl基因RNAi慢病毒從Genbank中調取人PBXl基因序列；預測siRNA位點；合成針對PBXl基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構建表達PBXl 基因siRNA序列的RNAi質粒；將RNAi質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共轉染人胚腎細胞293T，產生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默 PBXl基因的慢病毒?；谏鲜龇椒ǎ景l明提供了 29個干擾PBXl基因的有效靶點(具體如SEQ IDNO 1-29所示)，構建了特異干擾人PBXl基因的慢病毒。同時本發明還公開一種人PBXl基因RNAi慢病毒(PBXl-RNAi)及其制備與應用。本研究發現，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低PBXl基因在腫瘤細胞中的表達后，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，PBXl基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發生和發展中具有重要的生物學功能，PBXl基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的PBXl基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京科學出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實施例I :針對人PBXl基因RNAi慢病毒的制備I.篩選針對人PBXl基因的有效的siRNA靶點從Genbank調取PBXl (NM_002585)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟件Genechem設計針對PBXl基因的有效的siRNA靶點。在PBXl基因的編碼序列(CDS)區域內，每隔一個堿基起始獲得21個堿基的序列，表I列出了其中29條針對PBXl 基因的有效siRNA靶點序列。表I靶向于人PBXl基因的siRNA靶點序列
權利要求
1.人PBXl基因在制備或篩選肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌的腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌的藥物中的用途。
2.一種分離的人PBXl基因小分子干擾RNA靶標片段，其序列為SEQ ID N0:l_29中任意一條序列。
3.一種人PBXl基因小分子干擾RNA，能夠特異性沉默人PBXl基因的表達，所述人PBXl 基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1-29之任一的序列作為特異性沉默人PBXl基因表達的靶點序列。
4.如權利要求3所述人PBXl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人PBXl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID NO :1_29中之任一序列編碼的RNA。
5.如權利要求4所述人PBXl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15-27個核苷酸。
6.如權利要求5所述人PBXl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人PBXl基因小分子干擾RNA為發夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環片段分隔。
7.如權利要求6所述人PBXl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述莖環片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如權利要求3所述人PBXl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人PBXl基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO :30。
9.一種人PBXl基因干擾核酸構建體，包含編碼權利要求3-8任一權利要求所述人 PBXl基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達人PBXl基因小分子干擾RNA。
10.如權利要求9所述人PBXl基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述人PBXl基因干擾核酸構建體為人PBXl基因干擾慢病毒載體。
11.如權利要求10所述人PBXl基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述慢病毒載體選自pLK0. 1-pur。、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP, pLKO. l-puro-CMV_TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG-3xLac0> pLPl、 pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-iT_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、 pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—種人PBXl基因干擾慢病毒，由權利要求9-11任一權利要求所述人PBXl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
13.—種藥物組合物，含有治療有效量的權利要求3-8任一權利要求所述人PBXl基因小分子干擾RNA或權利要求12所述人PBXl基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
14.如權利要求13所述藥物組合物，其特征在于，所述腫瘤為惡性腫瘤，選自肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌之任一。
全文摘要
本發明公開了人PBX1基因的用途及其相關藥物。本發明公開了人PBX1基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發明還進一步構建了人PBX1基因小分子干擾RNA、人PBX1基因干擾核酸構建體、人PBX1基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人PBX1基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中PBX1基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
文檔編號A61K48/00GK102534003SQ201210005699
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2011年12月19日
發明者孫琴, 曹躍瓊, 沈浩, 瞿紅花, 金楊晟, 韓海雄, 顧雪峰 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司