專利名稱：日本柳杉cor基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種日本柳杉COR (CjCOR)基因及其用途。
背景技術(shù)：
擴(kuò)增共有序列遺傳標(biāo)記(AmplifiedConsensus Genetic Markers, ACGM),是建立在親緣關(guān)系比較近的物種之間存在著編碼序列的高度保守，而非編碼序列具有潛在多態(tài)性的基礎(chǔ)上的一種標(biāo)記體系。通過在編碼序列的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計引物，就可以開發(fā)出近緣物種 的ACGM標(biāo)記。這種標(biāo)記最大的優(yōu)點是不需要被開發(fā)植物任何基因組序列信息，且克隆得到的片段為基因編碼區(qū)的一部分，有利于快速的進(jìn)行基因克隆。抗凍蛋白最早發(fā)現(xiàn)于極區(qū)生長的魚類的血清中，以后相繼在昆蟲、植物、微生物中展開了相關(guān)研究。有關(guān)魚類抗凍蛋白抗凍機(jī)制已經(jīng)提出多種假說，就目前研究來看，吸附抑制機(jī)制比較合理，得到大多數(shù)學(xué)者贊同。其機(jī)制的模型為一般晶體生長垂直于晶體表面，假如雜質(zhì)分子吸附于冰晶生長通途的表面，那么需要外加推動力促使冰在雜質(zhì)間生長。抗凍蛋白的吸附使曲率增大，促使邊緣的表面積也增加。由于表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態(tài)發(fā)生改變，從而冰點下降。植物中的第一個afp基因是Worrall等于1998年在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)的，對于植物的抗凍研究具有重要意義。最近幾年相繼在多種植物中發(fā)現(xiàn)了 AFP。但是，絕大多數(shù)已經(jīng)研究過的植物材料中AFP的活性大大低于魚類AFP的活性。胚胎發(fā)育后期富集蛋白是一些在種子(胚胎)發(fā)育后期產(chǎn)生的小分子多肽，一般認(rèn)為，LEA蛋白的生理功能與種子耐脫水性形成有關(guān)。通常它們伴隨種子成熟過程而形成，在種子萌發(fā)時很快消失，受發(fā)育階段、脫落酸和脫水信號調(diào)節(jié)。LEA蛋白分子量較小，約10 30KDa,富含甘氨酸和其它親水氨基酸，疏水氨基酸含量很少，具有高親水性和熱穩(wěn)定性。其高級結(jié)構(gòu)由非周期性無規(guī)線團(tuán)和少量兼性α螺旋構(gòu)成，無熱力學(xué)優(yōu)勢態(tài)。LEA蛋白最初發(fā)現(xiàn)于棉花胚成熟后期，后來發(fā)現(xiàn)正生長的植物在逆境的條件下也會誘導(dǎo)類似蛋白質(zhì)表達(dá)。Dure等(1989)將LEA蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為三類第一類是成熟蛋白的基因產(chǎn)物(Em);第二類是RAB (responsive to ΑΒΑ)和脫水素(dehydrin)基因的產(chǎn)物；第三類包括其它基因產(chǎn)物。目前研究較多的是脫水素(蛋白)。脫水蛋白區(qū)別于其它蛋白質(zhì)的最主要特征在于其保守性。首先，它有一個富含賴氨酸的片段，即EKKGMDKIKEKLPG，稱為K片段(K segment)。由K片段可以形成一個兼性的(amphypathiC)a螺旋。不同的脫水蛋白具有I 11個K片段拷貝。其次，許多脫水蛋白有一個絲氨酸束(track),稱為S片段(S segment)。最后,脫水蛋白還有一個保守的Y片段(V/T)DEYGNP，它存在于多數(shù)脫水蛋白氨基酸序列C端。通過K片段形成的兼性α螺旋，為脫水蛋白的親脂性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，所以脫水蛋白的K片段的一個功能也許在于可以與部分變性蛋白質(zhì)及膜的疏水鍵相互作用，防止蛋白質(zhì)和膜進(jìn)一步變性。大多數(shù)脫水蛋白富含甘氨酸及其它帶電荷極性氨基酸。用圓二色譜分析G50 (17.80ku)得出其無序化部分占了 75%。這也許可以用來解釋脫水蛋白的熱穩(wěn)定性和高溶解性，因其內(nèi)部缺少折疊區(qū)，受熱也就難使其凝聚，這樣脫水蛋白就可以利用K片段兼親性特性與其它的蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)而保護(hù)其它蛋白質(zhì)。Close等(1990)認(rèn)為，從代謝和進(jìn)化的角度來看，脫水蛋白是植物對干旱脫水脅迫的一種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)。首先脫水蛋白的產(chǎn)生需要mRNA的轉(zhuǎn)譯，這需要能量和氨基酸，而不僅僅是某種蛋白質(zhì)降解的殘余產(chǎn)物；其次，脫水蛋白的合成出現(xiàn)在大多數(shù)蛋白質(zhì)降解的時期，其合成的優(yōu)先性表明它很可能起一種積極作用；另外各種不同植物脫水蛋白氨基酸序列具有高度的保守性并有著類似的表達(dá)調(diào)控，因此脫水蛋白很可能在植物干旱脫水適應(yīng)上起積極作用。已有的研究表明，脫水素是一種低分子量無規(guī)則多肽，是植物在胚胎發(fā)生晚期或受到干旱、高鹽、低溫等失水環(huán)境脅迫時大量表達(dá)的一類蛋白。脫水素是一種低分子量無規(guī)則多肽，是植物在胚胎發(fā)生晚期或受到干旱、高鹽、低溫等失水環(huán)境脅迫時大量表達(dá)的一類蛋白。迄今研究表明轉(zhuǎn)脫水素基因發(fā)現(xiàn)牽牛花的保水和抗低溫能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因煙草的抗低溫能力明顯高于野生型。杉科植物是古老的孑遺物種，而且經(jīng)歷了第四紀(jì)冰期，因此低溫相關(guān)基因與其它植物相關(guān)基因在進(jìn)化上經(jīng)歷了重大的低溫變遷，因此低溫相關(guān)基因可能對低溫脅迫有更重要的意義。因此克隆杉科植物脫水素基因并用于基因工程研究，有助于培育抗低溫植株，具有潛在的市場應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種日本柳杉COR基因及其用途。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種日本柳杉COR基因，該COR基因為SEQ IDNO: I所示的序列。本發(fā)明還同時提供了編碼日本柳杉COR基因的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為SEQ ID NO: 2所示的序列。本發(fā)明還同時提供了日本柳杉COR基因的克隆方法利用模式植物擬南芥的數(shù)據(jù)庫與日本柳杉的EST序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大規(guī)模序列聯(lián)配，根據(jù)聯(lián)配結(jié)果設(shè)計引物，然后進(jìn)行電子PCR過程設(shè)計出杉科的ACGM標(biāo)記；在設(shè)計出的ACGM標(biāo)記中選擇出能夠擴(kuò)增日本柳杉COR基因保守區(qū)片段的引物，弓丨物序列為TA41F 5' GGACGCCAAGAGAAGAAAGA 3’TA41R 5' ACACACCACGCATACAATCC 3’進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出250bp左右的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，確定產(chǎn)物單一明亮后,測序(例如送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序)；以獲得的序列為靶序列，用3’ RACR和5’ RACE試劑盒(Takara)分別對其3’和5’末端未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計全長引物，擴(kuò)增出基因全長；引物序列如下表I所示表I
權(quán)利要求
1.日本柳杉COR基因，其特征是該COR基因為SEQID NO: I所示的序列。
2.編碼如權(quán)利要求I所述日本柳杉COR基因的蛋白質(zhì)，其特征是該蛋白質(zhì)為SEQIDNO:2所示的序列。
3.如權(quán)利要求I所述的日本柳杉COR基因的克隆方法利用模式植物擬南芥的數(shù)據(jù)庫與日本柳杉的EST序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大規(guī)模序列聯(lián)配，根據(jù)聯(lián)配結(jié)果設(shè)計引物，然后進(jìn)行電子PCR過程設(shè)計出杉科的ACGM標(biāo)記； 在設(shè)計出的ACGM標(biāo)記中選擇出能夠擴(kuò)增日本柳杉COR基因保守區(qū)片段的引物，引物序列為TA41F :5’ GGACGCCAAGAGAAGAAAGA 3’TA41R :5’ ACACACCACGCATACAATCC 3’ 進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出250bp左右的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，確定產(chǎn)物單一明売后，測序； 以獲得的序列為靶序列，用3’ RACR和5’ RACE試劑盒分別對其3’和5’末端未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計全長引物，擴(kuò)增出基因全長；引物序列如下 3GSP1 AGGAAGATTACGGTCATGG 3’ RACE 3GSP2 TGAGAAGAAGGGCCTGATG 3’ RACE 5GSP1 CCATGACCGTAATCTTCCT5’ RACE 5GSP2 CATCAGGCCCTTCTTCTC5’ RACE QCF ATGGCGGAAGAAAATGCACC 全長 QCR TCAGTCTTTCCATGACCGTA 全長。
4.一種陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA-2300-CajC0R，其特征是將日本柳杉COR基因(回收的CjCOR基因片段)插入pCAMBIA-2300質(zhì)粒中，陽性重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA-2300_CajC0R。
5.如權(quán)利要求I所述的日本柳杉COR基因的用途，其特征是增強(qiáng)植物的耐低溫能力。
6.如權(quán)利要求I所述的日本柳杉COR基因的用途，其特征是通過轉(zhuǎn)基因獲得具有耐低溫能力的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的日本柳杉COR基因的用途，其特征是所述植物為水稻、玉米、棉花、大豆、煙草、油菜、大麥、小麥或高粱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本柳杉COR基因，該COR基因為SEQ ID NO:1所示的序列。本發(fā)明還同時公開了編碼上述COR基因的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為SEQ ID NO:2所示的序列。本發(fā)明還同時公開了上述日本柳杉COR基因的克隆方法。本發(fā)明還同時公開了一種陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA-2300-CajCOR，將日本柳杉COR基因(回收的CjCOR基因片段)插入pCAMBIA-2300質(zhì)粒中，陽性重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA-2300-CajCOR。本發(fā)明還同時公開了上述日本柳杉COR基因的用途，通過轉(zhuǎn)基因獲得具有耐低溫能力的植物，從而增強(qiáng)植物的耐低溫能力。
文檔編號C12N15/63GK102965380SQ20121045491
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者盧泳全, 賈慶, 童再康 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)