專利名稱：人nob1基因的用途及其相關藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地涉及人NOBl基因的用途及其相關藥物。
背景技術：
RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA介導的序列特異性的轉錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術具有很高的轉錄后沉默效率和特異性，將RNAi技術應用于腫瘤基因治療是現(xiàn)階段研究的熱點(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。一般利用質粒或病毒載體操縱一段45-50nt的發(fā)夾結構RNA (short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達，shRNA在細胞內會自動被加工成為小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)，從而引發(fā)基因沉默或者表達抑制。具有攜帶基因片段容量大、轉染效率高、無毒性、不易誘發(fā)宿主免疫反應、可感染分裂細胞及終末分化細胞和非分裂細胞、可穩(wěn)定抑制靶基因的表達等優(yōu)點，已被廣泛應用于基因治療、疫苗生產(chǎn)以及科學研究等領域(Angaji SA,Hedayati SS, Poor RH, Madani S，Poor SS，Panahi S.Application of RNA interference in treating human diseases. J Genet. 2010 ；89 (4) :527-37. Ketting RF. The many faces of RNAi. Dev Cell. 2011 ；20 (2) :148-61.)。鋅指蛋白是人體中最大的蛋白家族，是識別核酸最常見的結構元件。研究發(fā)現(xiàn)人類基因的1%屬于鋅指蛋白基因家族。鋅指蛋白能夠通過靶定在基因啟動子區(qū)域而調節(jié)基因的表達，在組織細胞的生長、增殖和分化中均起重要作用，其異常表達可能導致許多疾病包括惡性腫瘤的發(fā)生(Yajima I，Kumasaka M，Thang ND，Yanagishita T，Ohgami N， Kallenberg D，Naito Y，Yoshikawa T，Sakashita N，Kato M. Zinc finger protein 28 as a novel melanoma—related molecule. J Dermatol Sci. 2009 ；55 :68-70.Oyanagi H， Takenaka K， Ishikawa S，Kawano Y，Adachi Y，Ueda K，Wada H，Tanaka F.Expression of LUN gene that encodes a novel RING finger protein is correlated with development and progression of non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2004 ；46 :21-28. Witkiewicz-Kucharczyk A，Bal W. Damage of zinc fingers in DNA repair proteins， a novel molecular mechanism in carcinogenesis.Toxicol Lett. 2006 ； 162 :29-42. Vendrell JA, Ghayad S， Ben-Larbi S，Dumontet C，Mechti N， Cohen PA. A20/TNFAIP3, a new estrogen-regulated gene that confers tamoxifen resistance in breast cancer cells. Oncogene. 2007 ；26 :4656-4667.)。鋅帶蛋白(zinc ribbon protein)是鋅指類蛋白的一種，作為轉錄因子結合核酸的結構域是RNA聚合酶II中通用轉錄因子的重要組成部分，在細胞生長、增殖過程中發(fā)揮作用，并與白血病、乳腺癌、胃腸惡性腫瘤的多藥耐藥和癌變進展有關(Hong LiPiao YiHan Y，Wang J，Zhang X,Du Y，Cao S，Qiao Τ, Chen Ζ, Fan D.Zinc ribbon domain-containing 1(ZNRDl)mediates multidrug resistance of leukemia cells through regulation of P-glycoprotein and Bcl-2. Mol Cancer Ther. 2005 ；4 (12) :1936-42. Shi Y, ZhangY, Zhao Y, Hong L, Liu N, Jin X, Pan Y, FanD. Overexpression of ZNRDl promotes multidrug-resistant phenotype of gastric cancer cells through upregulation of P-glycoprotein. Cancer Biol Ther. 2004 ；3 (4) :377-81. Wang LH, Yang XY, Zhang X, Mihalic K, Fan YX, Xiao W, Howard OM, Appella E, Maynard AT, Farrar WL. Suppression of breast cancer by chemical modulation of vulnerable zinc fingers in estrogen receptor. Nat Med. 2004 ； 10(1) :40-7. Hong L, Chen Z, Zhang X，Xia L, Han Z, Lu Y, Jin H, Song J, Qiao T, Fan D. Zinc ribbon domain containing 1 protein :modulator of multidrug resistance, tumorigenesis and cell cycle. Exp Oncol. 2006 ；28(4) 258-62.)。 NOBlp (Nin one binding protein)作為一種鋅帶蛋白，最早是利用^S蛋白酶體的 19S 調節(jié)亞基 p3K26S proteasome regulatory subunit p31，Rpnl2)通過酵母雙雜交方法在酵母中發(fā)現(xiàn)的，在溶酶體組裝、成熟以及核糖體RNA的形成過程中發(fā)揮重要作用(Tone Y, TanahashiN, Tanaka K, Fujimuro Μ, Yokosawa H, Toh_e A. NobIp, a new essential protein, associates with the 26S proteasome of growing saccharomyces cerevisiae cells. Gene. 2000 ；243 (1-2) :37-45.)。Noblp 在人類中的同源基因 NOBl 及其編碼產(chǎn)物于2005年從人腎臟的cDNA文庫中克隆。該基因定位于人染色體16q22. 1，包含九個外顯子和八個內含子，cDNA全長174bp。NOBl編碼412個氨基酸序列的、分子量為 46675Da的RNA結合蛋白，該蛋白的氨基端含一個RNase活性的PIN(PilT amino terminus) 結構域，羧基端含有保守的鋅帶蛋白結構域，用于與RNA結合Ghang Y,Ni J,Zhou G,Yuan J, Ren W, Shan Y, Tang W, Yu L, Zhao S. Cloning, expression and characterization of the human NOBl gene. Mol Biol Rep. 2005 ；32 (3) :185-9.)。通過檢測成年人正常組織中NOBl mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)NOBl主要分布于肝、肺、脾等組織；哺乳動物細胞株的檢測結果顯示NOBl蛋白定位于細胞核。NOBl的酵母同源蛋白參與核糖體小亞基和26S蛋白酶體的合成，在泛素依賴的蛋白水解過程中的重要作用(Fatica A，Oeffinger M, Dlakic M, Tollervey D. Noblp is required for cleavage of the 3' end of 18S rRNA. Mol Cell Biol. 2003 ；23 :1798-807. Tone Y. ,Toh-e A. Noblp is required for biogenesis of the 26S proteasome and degraded upon its maturation in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 2002 ;16 :3142-57.)。目前已發(fā)現(xiàn) c_myc、c_fos、p53 和 ElA 等核內原癌蛋白的降解依賴泛素-蛋白酶體途徑(Ciechanover A, Finley D，Varshavsky A. Ubiquitin dependence of selective protein degradation demonstrated in the mammalian cell cycle mutant ts85. Cell. 1984 ；37 :57-66. Ciechanover A,DiGiuseppe JA,Bercovich B, Orian A,Richter JD, Schwartz AL, Brodeur GM. Degradation of nuclear oncoproteins by the ubiquitin system in vitro.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 ；88 :139-43.)。因此推測NOBl可能參與某些原癌蛋白的降解。而核糖體小亞基和^S蛋白酶體的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和腫瘤抑制有關。因此，NOBl與腫瘤的發(fā)生具有一定的關系，有望成為腫瘤基因治療的一個新靶點。目前已有研究發(fā)現(xiàn)NOBlp在卵巢癌組織中的表達明顯上調，NOBlsiRNA可有效抑制卵巢癌細胞SK0V3和HEY的生長活性、增殖能力并阻滯細胞分裂，同時顯著抑制裸鼠的成瘤能力，提示NOBl與卵巢癌發(fā)生和發(fā)展相關(Lin Y，Peng S, Yu H，Teng H，Cui M. RNAi—mediated downregulation of NOBl suppresses the growthand colony—formation ability of human ovarian cancer cells. Med Oncol. 2011. PMID 2U87298.)。然而，目前尚未有NOBl調節(jié)卵巢癌以外其他腫瘤細胞增殖的相關研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于公開與人NOBl (Nin one binding protein)基因相關的治療方法及藥物。為了深入研究NOBl在腫瘤發(fā)生中的調節(jié)功能，本發(fā)明選取人胃癌SGC-7901細胞、肝癌SMMC-7721細胞、結腸癌RKO細胞、肺癌H1299細胞和胰腺癌Panc-I細胞為模型， 以RNAi為手段研究NOBl在上述腫瘤細胞的存活和凋亡命運中的作用。本發(fā)明第一方面，公開了將人NOBl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人 NOBl基因用于制備腫瘤診斷藥物。人NOBl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容其一，將人NOBl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將人 NOBl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將人NOBl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標具體是指將人 NOBl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞產(chǎn)生RNA干擾作用的靶標，從而能降低腫瘤細胞人 NOBl基因的表達水平。所述將人NOBl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指將人NOBl基因作為作用對象對藥物或制劑進行篩選，以找到可以抑制或促進人NOBl基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之后所述的人NOBl基因小分子干擾RNA即是以人NOBl基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將NOBl基因作為作用對象。所述將人NOBl基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將人NOBl基因表達產(chǎn)物作為一項腫瘤診斷指標應用于腫瘤診斷藥物的制備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細胞的增殖與人NOBl基因的表達相關的任一種腫瘤， 更進一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌。所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。進一步的，所述腫瘤治療藥物能降低人NOBl基因的表達水平從而抑制腫瘤細胞的增殖。采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人NOBl基因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療目的的。具體的，治療時，將能有效降低人NOBl基因表達水平的物質給藥于患者。進一步的，所述的能有效降低人NOBl基因表達水平的物質，包括能夠特異性沉默人NOBl基因表達的小分子干擾RNA (siRNA)。該小分子干擾RNA (siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內源NOBl基因的表達的作用。進一步的，所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1_20之任一的序列作為特異性沉默人NOBl基因表達的靶點序列。所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO 1_20之任一的序列作為特異性沉默人 NOBl基因表達的靶點序列是指該小分子干擾RNA能與SEQ ID NO 1-20中的任一種序列所編碼的mRNA片段特異性結合，并特異性沉默人NOBl基因的表達。
進一步的，所述能夠特異性沉默人NOBl基因表達的小分子干擾RNA(SiRNA)經(jīng)由慢病毒載體表達。具體而言，這個過程包括將編碼所述人NOBl基因小分子干擾RNA的DNA 片段克隆入慢病毒載體獲得人NOBl基因干擾慢病毒載體，進而利用該人NOBl基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞并最終表達所述siRNA。人NOBl基因干擾慢病毒載體為將編碼所述人NOBl基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人NOBl基因小分子干擾RNA。進一步的，所述的慢病毒載體可選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一種慢病毒載體，本發(fā)明實施例具體列舉了以PGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發(fā)明第二方面，公開了一種分離的人NOBl基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標片段，其序列為SEQ ID NO 1-20中任意一條序列。所述分離的人NOBl基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標片段可應用于人NOBl基因小分子干擾RNA的篩選與制備。本發(fā)明第三方面，公開了一種人NOBl基因小分子干擾RNA(SiRNA)，能夠特異性沉默人NOBl基因的表達。所述人NOBl基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO 1_20之任一的序列作為特異性沉默人NOBl基因表達的靶點序列。進一步的，所述人NOBl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段， 所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID NO :1_20中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條 RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15_27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。進一步的，所述人NOBl基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、莖環(huán)片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔；其中，正義RNA片段和反義RNA片段互補，正義RNA片段的序列選自SEQ ID NO 1-20之任一。所述莖環(huán)片段結構包括6個或9個堿基。進一步的所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本發(fā)明具體列舉了以 UUCAAGAGA 為莖環(huán)。如實施例列舉的，所述人NOBl基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO 21 =CCUG GAGCCAAUCUUCAAGAAUUCAAGAGAUUCUUGAAGAUUGGCUCCAGG。
本發(fā)明第四方面，公開了一種人NOBl基因干擾核酸構建體，包含編碼前述人NOBl 基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達前述人NOBl基因小分子干擾RNA。所述的人NOBl基因干擾核酸構建體可以是將編碼前述人NOBl基因小分子干擾 RNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述人NOBl基因干擾核酸構建體為人NOBl基因干擾慢病毒載體，為將編碼所述人NOBl基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人NOBl 基因小分子干擾RNA。所述慢病毒載體可以選自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構建的人NOBl基因干擾核酸構建體,命名為 pGCSIL-GFP-siNOBl。進一步的，編碼所述人NOBl基因小分子干擾RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO 1-20中之任一序列及其互補序列。本發(fā)明的人NOBl基因小分子干擾RNA可用于抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或制劑。人NOBl基因干擾核酸構建體則可用于制備所述人 NOBl基因小分子干擾RNA。當用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的人NOBl基因小分子干擾RNA 施用于哺乳動物。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。本發(fā)明第五方面，公開了一種人NOBl基因干擾慢病毒，由前述人NOBl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞并產(chǎn)生人NOBl基因小分子干擾RNA，從而抑制胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明第六方面，還公開了一種藥物組合物，含有治療有效量的人NOBl基因小分子干擾RNA或人NOBl基因干擾慢病毒。進一步的，所述藥物組合物含有1 99wt%如前所述的人NOBl基因小分子干擾 RNA或人NOBl基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑 (如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發(fā)明設計了針對人NOBl基因的20個RNAi靶點序列，構建相應的NOBlRNAi載體，其中編碼序列SEQ ID NO 20的RNAi載體pGCSIL-GFP-siNOBl能夠顯著下調NOBl基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-siNOBl能夠靶向地將針對NOBl基因的RNAi序列高效導入人胃癌SGC-7901細胞、肝癌SMMC-7721細胞、結腸癌RKO細胞、肺癌細胞H1299和胰腺癌Panc-I細胞，降低NOBl基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的NOBl基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術治療方式。本發(fā)明提供的SiRNA或者包含該SiRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人NOBl基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中NOBl 基因的表達，進而抑制胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌腫瘤細胞的生長，促進胃癌、肝癌、 結腸癌、肺癌和胰腺癌腫瘤細胞凋亡，在胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌腫瘤治療中具有重要意義。


圖1表示pGCSIL-GFP質粒DNA圖譜圖2表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人胃癌SGC-7901細胞、肝癌SMMC-7721 細胞、結腸癌RKO細胞、肺癌H1299細胞和胰腺癌Panc-I細胞5天后，NOBl mRNA的表達水平顯著降低。圖3表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人胃癌SGC-7901細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖4表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人肝癌SMMC-7721細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖5表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人結腸癌RKO細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖6表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人肺癌H1299細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖7表示siNOBl-Lentivirus慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I細胞5天后，顯著抑制細胞增殖。圖8使用nobl抗體在不同腫瘤組織組織樣本上的免疫組化檢測結果a、b為胰腺癌，c為肺癌，d為結腸癌，e、f為胃癌
具體實施例方式本發(fā)明基于鋅帶蛋白可能與腫瘤細胞的增殖、耐藥性和轉移等相關的研究，認為 NOBl作為一種鋅帶蛋白可能參與了除卵巢癌外其他惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明涉及了一組針對人NOBl基因的小分子干擾RNA(SiRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人NOBl mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-2 個堿基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構建表達上述siRNA的核酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內源NOBl基因的表達。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調人NOBl基因的表達后可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，這一研究成果表明NOBl基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發(fā)明人進一步合成和測試了多種針對NOBl基因的siRNA，篩選出了可有效抑制NOBl的表達進而抑制人胃癌 SGC-7901細胞、肝癌SMMC-7721細胞和結腸癌RKO細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一系列干擾人NOBl基因的小干擾RNA(SiRNA)序列，構建了可特異性沉默NOBl基因表達的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人NOBl基因設計的小干擾RNA及 RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調NOBl基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明表明NOBl基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過 RNAi方式沉默NOBl基因的表達，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設計思路為本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人NOBl基因RNAi慢病毒從Genbank中調取人NOBl基因序列；預測siRNA位點；合成針對NOBl基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構建表達NOBl 基因siRNA序列的RNAi質粒；將RNAi質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共轉染人胚腎細胞^3T，包裝表達NOBl基因的重組RNAi慢病毒顆粒。收集細胞培養(yǎng)上清中的慢病毒顆粒，純化濃縮，即制得純凈、穩(wěn)定表達NOBl siRNA的慢 ^ (siNOBl-Lentivirus)。基于上述方法，本發(fā)明提供了 20個干擾NOBl基因的有效靶點(具體如SEQ ID NO 1-20所示)，構建了特異干擾人NOBl基因的慢病毒。同時本發(fā)明還公開一種人NOBl基因RNAi慢病毒(NOBl-RNAi)及其制備與應用。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低NOBl基因在腫瘤細胞中的表達后，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，NOBl基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學功能，NOBl基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的NOBl基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京科學出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實施例1 針對人NOBl基因RNAi慢病毒的制備1.篩選針對人NOBl基因的有效的siRNA靶點從Genbank中選取人NOBl (ΝΜ_014062)基因的編碼區(qū)序列，每隔一個堿基起始獲得20個堿基的序列；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟件，以人NOBl mRNA序列為模板，確定20個有效的siRNA靶點序列(SEQ ID NO 1-20)，如表1所示表1靶向于人NOBl基因的siRNA靶點序列
權利要求
1.人NOBl基因在制備或篩選胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌的腫瘤治療藥物，或者在制備胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌之任一腫瘤診斷藥物中的用途。
2.一種分離的人NOBl基因小分子干擾RNA靶標片段，其序列為SEQ ID N0:l_20中任意一條序列。
3.一種人NOBl基因小分子干擾RNA，能夠特異性沉默人NOBl基因的表達，所述人NOBl 基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1_20之任一的序列作為特異性沉默人NOBl基因表達的靶點序列。
4.如權利要求3所述人NOBl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人NOBl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID NO 1-20中之任一序列編碼的RNA。
5.如權利要求4所述人NOBl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15-27個核苷酸。
6.如權利要求5所述人NOBl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人NOBl基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔。
7.如權利要求6所述人NOBl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如權利要求3所述人NOBl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人NOBl基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO :21。
9.一種人NOBl基因干擾核酸構建體，包含編碼權利要求3-8任一權利要求所述人 NOBl基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達人NOBl基因小分子干擾RNA。
10.如權利要求9所述人NOBl基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述人NOBl基因干擾核酸構建體為人NOBl基因干擾慢病毒載體。
11.如權利要求10所述人NOBl基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述慢病毒載體選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP, pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLK0-puro_IPTG-lxLac0、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、 pLP2, pLP/VSV-G, pENTR/U6, pLenti6/BL0CK-iT-DEST, pLenti6-Gff/U6-laminshrna, pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—種人NOBl基因干擾慢病毒，由權利要求9-11任一權利要求所述人NOBl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
13.一種藥物組合物，含有治療有效量的權利要求3-8任一權利要求所述人NOBl基因小分子干擾RNA或權利要求12所述人NOBl基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
14.如權利要求13所述藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療胃癌、肝癌、結腸癌、肺癌和胰腺癌之任一腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了人NOB1基因的用途及其相關藥物。本發(fā)明公開了人NOB1基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進一步構建了人NOB1基因小分子干擾RNA、人NOB1基因干擾核酸構建體、人NOB1基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人NOB1基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中NOB1基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
文檔編號A61K48/00GK102559895SQ201210005128
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權日2011年12月19日
發(fā)明者孫琴, 曹躍瓊, 朱向瑩, 李楊, 瞿紅花, 譚暢, 金楊晟 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司