專利名稱：一種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及顯微成像(micro CT)領域，更具體地講，涉及ー種新型的微血管造影劑。
背景技術：
CT (Computed Tomography)技術利用的原理是當X射線透過樣本吋，樣本的各個部位對X射線的吸收率不同，最終在檢測器上成像。顯微CT(micro computed tomography, 微計算機斷層掃描技術)，是ー種非破壞性的3D成像技木，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內部顯微結構。它與普通CT最大的差別在于分辨率極高，可以達到微米 (μπι)級別，因此具有良好的“顯微”作用。顯微CT可用于醫學、藥學、生物、考古、材料、電子、地質學等各個領域的研究。近年來，顯微CT (micro CT)技術在醫學上的應用發展十分迅速。由于其極高的空間分辨率，使得對組織、器官、甚至微血管網絡的研究提供了更加直觀的呈現。在腫瘤學領域，利用微血管造影技術辨別是否存在血管生成，從而為病情的確診提供依據。與普通CT 技術不同，直接使用顯微CT造影難以提供足夠的對比度來分辨血管。因此，在成像過程中造影剤的使用尤其重要。造影剤(又稱對比劑，contrast media)是為增強影響觀察效果而注入到組織或器官的化學制品。這些制品的密度高于或低于周圍的器官、組織，可將形成的對比用圖像顯示。X射線觀察常用的造影剤有碘制劑、硫酸鋇等。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是ー種生物活性陶瓷材料，它在近代生物醫學工程學領域受到越來越廣泛的關注。其組成和結構與脊椎動物骨骼、牙齒中的無機成分相似，具有優良的生物相容性和生物活性。重金屬元素鋇具有較強的X射線吸收能力，目前已經比較成熟地應用于造影剤的合成(如醫用硫酸鋇)；同時，鋇元素與鈣同處于元素周期表第二主族，具有相似的外層電子結構；因此，它們的化學性質類似，可以用羥基磷灰石的合成方法來制備納米鋇磷灰石。目前還沒有采用納米級鋇的磷灰石用作微血管造影剤方面的研究報道。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供ー種成像清晰、細胞毒性較低、不易沉淀等特點的基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤及其制備方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤，其特征在干，該造影劑為以硝酸鋇和磷酸氫ニ銨為原料合成的納米級磷灰石，所述的硝酸鋇和磷酸氫ニ銨的摩爾比為(1-2) 1。所述的反應物硝酸鋇和磷酸氫ニ銨的摩爾比為1.67 1。一種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將硝酸鋇溶液加入磷酸氫ニ銨溶液中攪拌混合，在混合過程中用氨水調節混合液的PH值維持在9-10，并添加1，1，1-三羥基乙烷，以提供羥基環境，在90°C下反應M小吋，所得沉淀物老化M小時以提高均一性并改善晶型，然后使用超聲波清洗，并用乙醇調節至中性，離心分離、收集粉體沉積物，最后將產物冷凍干燥即得產品。所述的1，1，1_三羥基乙烷的添加量為使其在混合液中的濃度為lwt%。所述的硝酸鋇溶液為硝酸鋇的超純水溶液，所述的磷酸氫ニ銨為磷酸氫ニ銨的超純水溶液。與現有技術相比，本發明通過鋇元素的磷酸化，合成ー種鋇的磷灰石。另外將其制備為納米級別顆粒，使其在水溶液中能均勻分散并穩定存在。本發明擬將納米級鋇的磷灰石用作微血管造影剤，主要是利用重金屬鋇對X射線的強吸收以及其磷灰石結構優良的生物相容性；與此同時，將鋇的磷灰石合成為納米結構，也從一定程度上減少了因造影劑沉積 (如硫酸鋇)而導致的對比度失真，為微血管造影剤的選擇提供了新方法。本納米級鋇的磷灰石具有成像清晰、細胞毒性較低、不易沉淀等特點，為微血管造影剤的發展，提供ー種新的應用可能。本發明所得顯影劑獲得的小鼠腦血管成像能清晰呈現傳統造影剤難以進入的穿枝動脈等微小血管，整體成像清晰，分辨率高。


圖1為共沉淀法合成的鋇磷灰石(Ba-apatite)紅外吸收光譜；圖2為共沉淀法合成的鋇磷灰石(Ba-aprtite)X射線衍射譜圖，圖中標識了三個主要特征峰的晶面指數；圖3為納米級的鋇磷灰石(Ba-apatite)的掃描電鏡(SEM)總體視圖；圖4為納米級的鋇磷灰石(Ba-apatite)的掃描電鏡(SEM)局部成像，其中片狀薄層厚度為40. 1納米；圖5為聯合掃描電鏡使用的能量散射X射線譜圖(EDS)，圖中標識出Ba、P、0元素的存在峰；圖6為納米級鋇磷灰石對3T3細胞系毒性檢測，用不同濃度的鋇磷灰石(10，50， 250yg/mL)孵育ー小時后，再用無菌的PBS溶液沖洗，然后換上新鮮的培養基(含10% FBS)繼續孵育24h、48h和72小時；圖7為使用納米級鋇磷灰石做顯影劑灌注后，小鼠腦部的整體Micro CT血管造影圖像；圖8為使用納米級鋇磷灰石做顯影劑灌注后，小鼠大腦中動脈供血區域部分的放大圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例一、所用原材料和設備1、原材料硝酸鋇，純度> 99.5% (上海化專實驗ニ廠)；磷酸氫ニ銨，純度> 99.0% (國藥基團藥業股份有限公司)。氨水(聯試化工試劑有限公司，其中NH3含量 25% -28. 0% )。三羥甲基乙烷(TME，分析純AR)。DMEM干粉培養基(高糖)、胎牛血清、非必需氨基酸、青-鏈霉素、0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液、四甲基偶氮哇藍(MTT)，96孔板等生物試劑及材料購自Corning Costar公司。2、主要設備掃描電鏡形貌分析在上海交大分析測試中心電鏡室進行，電鏡型 FEI Siron 200 (20kV, 1. Oam)場發射掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)，并配套使用INCA X-Max80能譜儀(牛津儀器)。使用德國Bruker公司的EQUINOX 55型傅立葉變換紅外光譜儀測定FIlR光譜，樣品掃描范圍4000到400CHT1，掃描模式為透射譜。電感耦合等離子體發射光譜儀采用美國Thermo公司的kientific iCAP6300ICP Spectrometer，用于樣品中的金屬元素檢測。X射線衍射儀采用德國Bruker公司的D8advance diffractometer,輻射源為Cr靶。使用上海交通大學Med-X研究院的Micro-CT (美國)(radia公司，Micro)(CT-200) 進行小鼠腦部血管顯微成像。ニ、本發明造影剤的制備及其動物實驗1.納米級鋇磷灰石的制備納米級鋇的磷灰石采用共沉淀法合成。整個實驗過程中均采用超純水。向圓底燒瓶中加入溶質為0.0334mol Ba(NO3)2的溶液，然后緩緩加入同樣體積、溶質為 0. 02mol (NH4) 2ΗΡ04的溶液。同吋，用氨水調節溶液的PH值，并使之維持在9到10。添加濃度為(wt)的1，1，1_三羥基乙烷作助劑，以提供羥基環境。以上過程均在劇烈攪拌中進行。反應溫度90°C下反應對小吋。將反應后所得沉淀物老化M小時以提高均一性并改善晶型，然后使用超聲波清洗，并用乙醇調節至中性，最后將產物冷凍干燥。2、細胞培養3T3細胞系培養在有10%胎牛血清的DMEM培養液(含200u/mL青霉素、鏈霉素) 中。復蘇的細胞按常規培養操作置于37°C、5%C02(相対濕度90%)培養箱中培養，約2至 3天更換一次培養液。3、細胞毒性鋇磷灰石的相對細胞毒性通過使用MTT法檢測正常的3T3細胞系而獲得。取對數生長期的細胞接種于96孔培養板，每孔含介質200微升，細胞個數為8 X IO3個。培養M小時后，再向每個孔中加入50微升的磷酸鹽緩沖液(PBS)，繼續培養M小吋。之后，每孔加入 20微升含5mg/ml四甲基偶氮哇藍(MTT)原液的磷酸鹽緩沖液(PBS)。接下的操作在暗室中進行繼續培養4小時后，移除孔中與未反應的四甲基偶氮哇藍(MTT)相結合的介質，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)仔細沖洗三次。黃色的四甲基偶氮哇藍(MTT)溶液在活細胞的線粒體中被還原為紫色的甲臜。向每孔中加入200微升的ニ甲基亞砜(DMSO)并振蕩十分鐘，以溶解所獲得的甲臜晶體。使用美國Biotek ELxSOO光吸收酶標儀測量吸光度，波長選擇為 490納米。4、小鼠腦部Micro CT成像六只成年雄性ICR小鼠經腹腔注射過量水合氯醛處死后，打開胸腔。夾閉腹主動脈后剪開右心耳。以總量為Iml的羥基磷酸鋇懸濁液經左心室灌注。取腦后馬上進行 micro-CT (Xradia,MicroXCT-200)造影。選擇χ射線的能量為40kvp，單張圖片的曝光時間為2秒。三、實驗結果和討論本實例使用紅外光譜(FTIR)和X射線衍射儀(XRD)表征所合成的產物成分。同吋，使用掃描電鏡(SEM)確認產物的納米結構，并結合X射線能譜儀鑒定樣品表面的元素成分。在細胞毒性實驗中，采用MTT法并結合酶標儀檢測。最后以此產物(鋇磷灰石)作顯影劑，進行小鼠腦部的Micro CT血管成像。FIlR光譜是鑒別功能基團的重要方法，因此，采用FIlR來分析樣品表面基團的成分。圖1是通過紅外光譜測定納米級鋇磷灰石的結構特征3427(3!^1的寬峰是-OH的峰； 996cm—1處的強峰以及緊鄰的1093cm—1中強峰是P043—的伸縮振動造成的，同時561cm—1處磷酸根變形振動的尖峰也證實了 P043_的存在。1409CHT1處出現的清晰峰表明樣品表面存在與羥基結合的C032—，說明大氣中的ニ氧化碳對晶格中的羥基造成了影響。圖2是鋇磷灰石的X射線衍射圖譜(XRD)。譜圖中標識出三個清晰的強峰，分別位于 2Θ = 28.08°C，31.95°C 和 38. 52°C 處，晶格常數分別為(015), (110)以及(009)。根據 PDF衍射卡(PDF 25-00 ),峰形接近磷酸鋇，這表明產物可能形成ー種鋇的磷灰石。使用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定合成物的元素成分，結果顯示，產物中存在Ba、P兩種金屬元素，且其原子比值為1.47(磷酸鋇中Ba P比為1. 5)。另外，采用熱重分析法研究鋇磷灰石的熱穩定性。在溫度從274攝氏度上升至890攝氏度過程中， 樣品質量損失為2. 88%，這是由于溫度上升造成鋇磷灰石中羥基的丟失。鋇磷灰石表面的形貌呈現以及元素分析使用掃描電鏡(SEM)并配套能譜儀(EDS) 進行測定。圖3展示了鋇磷灰石樣品的整體ニ維視圖，顆粒大小由0. 2微米至2微米不等。 通過圖4可以得出，樣品為片狀的納米結構，圖中標識出的薄片厚度為40. 1納米。能量彌散X射線(EDS)譜圖見圖5，結果確認了樣品中Ba、P、0元素的存在。結合以上分析可以得出，合成的產物為鋇的磷灰石，并且已經達到片狀的納米結構。細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于凋亡或壞死的細胞死亡機理。由于鋇的磷灰石與鈣磷灰石具有一定的形態相似性，同時羥基磷酸鈣又具有較好的生物相容性，因此本實例通過小鼠的胚胎成纖維細胞系(ΝΙΗ/3Τ;3)檢測鋇磷灰石的細胞毒性。MTT法經常用于檢測化學物質對細胞增增值數量和細胞代謝活動的影響， 因此使用MTT法檢測鋇磷灰石對細胞的增值代謝過程的影響。如圖6所示，對于添加10 μ g/ mL鋇磷灰石的3T3細胞系，與對照組相比，在孵化M小時后細胞毒性已經顯現，細胞數量存在一定量的減少。這種趨勢隨著孵化時間的延長和劑量的加大而更加明顯。結果表明，對于3T3細胞系，鋇磷灰石在高劑量和長時間孵化的情況下，存在較高的細胞毒性；短時間孵化和小劑量使用的情況下，細胞毒性較小。本實例使用鋇磷灰石作為造影剤具有清晰的血管成像效果。圖7為使用鋇磷灰石灌注后小鼠的腦部整體視圖，圖中主要血管以及威爾斯環清晰可辨。大腦中動脈供血區域的部分放大圖見圖8，標尺為250微米，圖中可見清晰的皮層穿枝動脈(約為20微米)。四、結論本實例制備的納米級磷灰石合成エ藝簡便，造影剤懸浮度好，不易沉淀，能清晰顯影傳統硫酸鋇不能進入的穿枝動脈等微小血管；同時細胞毒性較低，不易沉淀，成像清晰； 由此推斷，納米級鋇的磷灰石在微血管造影剤的發展中具有較大的應用潛力。
權利要求
1.一種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤，其特征在干，該造影劑為以硝酸鋇和磷酸氫ニ銨為原料合成的納米級磷灰石，所述的硝酸鋇和磷酸氫ニ銨的摩爾比為(1-2) 1。
2.根據權利要求1所述的ー種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤，其特征在干，所述的硝酸鋇和磷酸氫ニ銨的摩爾比為1.67 1。
3.—種如權利要求1所述的基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將硝酸鋇溶液加入磷酸氫ニ銨溶液中攪拌混合，在混合過程中用氨水調節混合液的PH值維持在9-10，并添加1，1，1-三羥基乙烷，以提供羥基環境，在 90°C下反應M小吋，所得沉淀物老化M小時以提高均一性并改善晶型，然后使用超聲波清洗，并用乙醇調節至中性，離心分離、收集粉體沉積物，最后將產物冷凍干燥即得產品。
4.根據權利要求3所述的ー種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤的制備方法，其特征在于，所述的1，1，1_三羥基乙烷的添加量為使其在混合液中的濃度為lwt%。
5.根據權利要求3所述的ー種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影剤的制備方法，其特征在于，所述的硝酸鋇溶液為硝酸鋇的超純水溶液，所述的磷酸氫ニ銨為磷酸氫ニ銨的超純水溶液。
全文摘要
本發明涉及一種基于納米級鋇磷灰石的微血管造影劑及其制備方法，該造影劑為以硝酸鋇和磷酸氫二銨為原料合成的納米級鋇磷灰石，所述的硝酸鋇和磷酸氫二銨的摩爾比為(1-2)∶1。與現有技術相比，本發明造影劑細胞毒性較低，懸浮度高，不易沉淀，能清晰地顯影傳統造影劑難以進入的穿枝動脈等微小血管，為新型微血管造影劑的制備提供了一種新的選擇。
文檔編號A61K49/04GK102526768SQ201210007638
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者何琳, 朱新遠, 朱邦尚, 王永亭, 薄洋, 袁曉亞, 金承鈺, 馬曉飛 申請人:上海交通大學