專(zhuān)利名稱(chēng)：Egcg在制備治療ⅱ型糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，特別涉及EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率在全界范圍內(nèi)急劇增加。有關(guān)推測(cè)表明，到2025年，全世界糖尿病成人患者的數(shù)量將由1995年的1.35億增加至3億。印度、中國(guó)和美國(guó)是世界上糖尿病發(fā)病率最高的國(guó)家。目前，大約90%的糖尿病患者得有與生活習(xí)慣以及肥胖密切相關(guān)的II型糖尿病，其主要特征為胰島素抵抗。很多研究都表明，胰島素抵抗與線粒體的功能異常密切相關(guān)，認(rèn)為線粒體的功能異常至少是造成胰島素抵抗的部分因素。綠茶作為一種可以普遍消費(fèi)的飲料，被認(rèn)為具有顯著的促進(jìn)健康的效果。人們相信綠茶能夠預(yù)防和治療很多疾病，并且養(yǎng)成喝綠茶的習(xí)慣與長(zhǎng)壽也是密切相關(guān)的。近年來(lái)，人們對(duì)綠茶的研究越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)綠茶能夠促健康主要是因?yàn)樗缓瓒喾雍克斐傻模貏e是黃烷醇和黃酮醇，大約占干茶葉30%的重量。兒茶素是黃烷醇的主要形式，它由(-)-印igallocatechin-3-gallate (EGCG)，EGC, ECG和EC所組成，其中最重要的成分為 EGCG0EGCG占綠茶毛重的9%-13%，是綠茶主要的活性和水溶性成份，具有極強(qiáng)的抗
i I'.1.
氧化活性。EGCG的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式為U ‘. 分子式為C22H18O11,分子量為458. 4
克/摩爾。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以降低癌癥，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病和糖尿病的發(fā)病率。由于糖尿病相關(guān)的肥胖成為人們健康最大的威脅之一，而EGCG可以有效的降低體重以及脂肪含量。對(duì)大鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射70-92毫克/公斤體重的EGCG，可在2_7天內(nèi)降低20 % -30 %的體重；用EGCG長(zhǎng)期喂養(yǎng)SD雄性大鼠，可以減少40 % -70 %的皮下脂肪以及 20% -35%的腹部脂肪。因此，研究EGCG調(diào)控體重以及糖尿病的機(jī)制是非常重要的。在體內(nèi)，含有EGCG的抗高血糖藥物的作用是由一系列復(fù)雜的事件所構(gòu)成的。2004 年，在日本的一群年輕健康的志愿者中進(jìn)行了綠茶對(duì)于葡萄糖耐受量的急性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，口服葡萄糖20分鐘后再服用1. 5克的綠茶提取物能夠顯著降低血液里的糖含量。Hase 等發(fā)現(xiàn)，連續(xù)服用12周的綠茶兒茶素會(huì)減少葡萄糖和胰島素水平，這表明長(zhǎng)時(shí)間服用綠茶會(huì)提高胰島素敏感性。實(shí)驗(yàn)表明，EGCG喂養(yǎng)的SD大鼠血清中，蛋白質(zhì)，脂肪酸和甘油的含量都沒(méi)有變化，但糖含量顯著減少。在高脂飼養(yǎng)的小鼠中也發(fā)現(xiàn)了相似的變化，低水平的血糖含量會(huì)減少氧化應(yīng)激和滲透壓，從而減緩糖尿病的并發(fā)癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供EGCG在治療糖尿病中的新用途，EGCG能有效的恢復(fù)心臟線粒體功能，抑制自噬和減少由氧化應(yīng)激上調(diào)引起的二相酶表達(dá)增加；在用高糖處理的心肌細(xì)胞H9c2中，EGCG能夠有效減少ROS產(chǎn)生，抑制R)X01調(diào)控的自噬，恢復(fù)線粒體功能， 降低高糖對(duì)所造成的胰島素抵抗。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，EGCG抑制由自噬引起的心臟線粒體功能的失調(diào)。EGCG還用于抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的自噬上調(diào)。EGCG還用于抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的氧化應(yīng)激的活化。EGCG還用于恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的線粒體功能紊亂。EGCG還用于降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的胰島素抵抗。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次研發(fā)出EGCG在治療II型糖尿病方面的新的用途。(2)揭示了 FoxOl所調(diào)控的自噬在II型糖尿病中的重要作用。(3)闡述了心肌細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器線粒體在II型糖尿病中的重要變化以及 EGCG對(duì)其的恢復(fù)作用。


圖1是EGCG恢復(fù)GK大鼠心臟線粒體功能的柱狀示意圖。其中，圖IA為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中線粒體復(fù)合物以及VDACl蛋白變化的蛋白免疫印跡示意圖；圖IB為EGCG 喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中線粒體呼吸鏈復(fù)合體I，III以及a-酮戊二酸脫氫酶活性的柱狀示意圖。數(shù)據(jù)來(lái)源于6組大鼠，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示；+P < 0. 05，++P < 0. 01，+++P
<0. OOlvs. Wistar 對(duì)照組；*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001 vs. GK 對(duì)照組。圖2是EGCG降低GK大鼠心臟中二相酶蛋白表達(dá)升高的蛋白免疫印跡示意圖。+P
<0. 05，+++P < 0. OOlvs. Wistar 對(duì)照組；*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs. GK 對(duì)照組。圖3是EGCG對(duì)GK大鼠心臟中線粒體生成以及線粒體動(dòng)態(tài)學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)影響的蛋白免疫印跡示意圖。其中，圖3A為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中線粒體生成相關(guān)蛋白表達(dá)降低的蛋白免疫印跡示意圖；圖3B為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中線粒體動(dòng)態(tài)學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白免疫印跡示意圖。數(shù)據(jù)來(lái)源于6組大鼠，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示； +P < 0. 05，++P < 0. 01，+++P < 0. OOlvs. Wistar 對(duì)照組；*P < 0. 05，**P < 0· 01，***P
<0. OOlvs. GK 對(duì)照組。圖4是EGCG抑制GK大鼠心臟中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白免疫印跡示意圖。其中，圖4A，圖4B為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中自噬標(biāo)志分子表達(dá)降低的蛋白免疫印跡示意圖；圖4C為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中調(diào)控自噬上游蛋白表達(dá)降低的蛋白免疫印跡示意圖。數(shù)據(jù)來(lái)源于6組大鼠，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示；+P < 0. 05, ++P < 0. 01，+++P
<0. OOlvs. Wistar 對(duì)照組；*P < 0. 05，**P < 0· 01，_P < 0. OOlvs. GK 對(duì)照組。圖5是EGCG能有效恢復(fù)心肌細(xì)胞H9c2中由高糖誘導(dǎo)所產(chǎn)生的胰島素抵抗，自噬上調(diào)，線粒體損失以及氧化應(yīng)激增加的柱狀示意圖。其中圖5A為EGCG能有效阻止高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中胰島素抵抗相關(guān)蛋白磷酸化降低的蛋白免疫印跡示意圖；圖5B，圖5C為 EGCG能有效阻止高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)的蛋白免疫印跡示意圖；圖5D為EGCG能有效阻止高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中線粒體數(shù)目相關(guān)蛋白表達(dá)減少以及二相酶相關(guān)蛋白表達(dá)增加蛋白免疫印跡示意圖；圖5E為EGCG能有效阻止高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中ROS產(chǎn)生增加的柱狀示意圖；圖5F，圖5G為EGCG能減少高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中自噬泡形成的激光共聚焦示意圖；圖5H為EGCG處理能降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中自噬泡活性的免疫熒光染色示意圖。圖A-E，H9c2細(xì)胞用20ymol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用 25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)檢測(cè)活性氧產(chǎn)生的變化；最后用lOOnmol/L胰島素處理10分鐘，收集蛋白用于免疫印跡分析。數(shù)據(jù)來(lái)源于5個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。+P < 0. 05，++P < 0. 01，+++P < 0. OOlvs.正常對(duì)照組，*P < 0. 05，**P < 0. Olvs. 高糖處理組。圖F-G，H9c2細(xì)胞用EGFP-LC3轉(zhuǎn)染12個(gè)小時(shí)后，先用20 μ mol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬泡的形成。圖 H，H9c2細(xì)胞用20 μ mol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)，然后通過(guò)MDC染色的方法鑒定自噬泡的變化。圖6是在高糖作用下，心肌細(xì)胞H9c2通過(guò)R)x01來(lái)調(diào)控自噬的蛋白免疫印跡示意圖。其中，圖6A，圖6B為R)x01 RNA干擾后能抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中自噬上調(diào)的蛋白免疫印跡示意圖；圖6C，圖6D為FoxOl過(guò)表達(dá)后通過(guò)非轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式增加H9c2細(xì)胞自噬的蛋白免疫印跡示意圖。數(shù)據(jù)來(lái)源于3個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。*P < 0. 05，**P < 0. 01，***P < 0. 001 vs.對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)闡述。I、材料與方法1、材料EGCG((-)-epigallocatechin-3-gallate),葡萄糖(Glucose)，胰島素 (Insulin)，輔酶 Ql (CoQl)，癸泛醌(decylubiquinone)，細(xì)胞色素 C (Cytochrome C), 2, 6-Dichlorobenzenone-indophenol (DCIP)，2- (P-碘苯基)-3 (P-硝基苯基)-5-苯基四氮唑氯(2- (p-iodophenyl) -3 (p-nitrophenyl) -5-phenyl tetrazolium chloride, INT),輔酶 A(CoASH),焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate), monodansylcadaverine (MDC)以及針對(duì)I\ibulin，GAPDH的一抗來(lái)自西格瑪奧德里奇公司(Sigma，St Louis, M0)。L-DMEM 培養(yǎng)基，青霉素(penicillin)，鏈霉素(str印tomycin)，2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯 (2 ‘，7' -dichlorodihydrof luorescein diacetate，H2DCFDA)，胰蛋白酶(trypsin)以及針對(duì) OxPhos Complexes I，II，III and IV 的一抗來(lái)自 Invitrogen 公司(Carlsbad, USA)；針對(duì) NQ01，HO-I, S0D2, VDACl, PGCl, mtTFA, DRP1, Mfnl, Mfn2, OPAl 和 Ac-FoxOl 的一抗來(lái)自 Santa Cruz 公司(Heidelberg, Germany)；針對(duì) Fox03a, FoxOl, p-Fox01 (Thr24), Atg5, Atg7, Beclin 1，LC3B, p-Akt (Ser 473)，Akt，ρ-AMPK α (Thrl72)，p_GSK3 β，AMPK α， p-mT0R(Ser2448)，mT0R 的一抗來(lái)自 Cell Signaling iTechnologyag (Beverly，MA，USA)； 辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的針對(duì)鼠/兔/山羊的二抗購(gòu)自杰克遜免疫研究實(shí)驗(yàn)室(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc)；胎牛血清購(gòu)自 PAA Laboratories GmbH(Linz, Austria)；細(xì)胞裂解液購(gòu)自江蘇海門(mén)碧云天生物技術(shù)公司。其他試劑購(gòu)自本地供銷(xiāo)商。2、實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物飼養(yǎng)四周大的雄性糖尿病GK大鼠以及相應(yīng)大小的非糖尿病Wistar大鼠購(gòu)自SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Shanghai, China).按照NIH動(dòng)物飼養(yǎng)原則飼養(yǎng)大鼠，所有老鼠分為三組，Wistar對(duì)照組，GK對(duì)照組以及EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠組，EGCG的喂養(yǎng)量為IOOmg/ kg/day，對(duì)照組給予相應(yīng)體積的鹽。飼養(yǎng)三個(gè)月后，收取心臟組織用以實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，生長(zhǎng)在含10%胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基中，并被置于恒溫(37°C )恒濕的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，2天換液一次，所有細(xì)胞處于10代以內(nèi)。蛋白免疫印跡分析收集心臟組織(IOOmg)或者處理過(guò)的H9c2細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于冰上孵育30 分鐘。17，OOOg離心15分鐘，收集上清，蛋白定量，并將上清保存于_20°C。取約20yg蛋白通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至NC膜上，NC膜用5%脫脂奶粉(溶解于TBST) 封閉1小時(shí)，接著用一抗室溫孵育1小時(shí)，TBST漂洗3次15分鐘，然后二抗室溫孵育1小時(shí)，TBST漂洗3次15分鐘，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物HRP反應(yīng)，使用感光膠片記錄光亮度的變化。線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶I，III以及a_酮戊二酸脫氫酶活性的檢測(cè)線粒體抽提。將剪碎的大鼠心臟組織用預(yù)冷的A液(120mM NaCl, 20mM HEPES, 2mM MgC12, ImM EGTA，and 5g/l bovine serum albumin ；pH 7.4)重懸，于冰上靜置 5 分鐘后用勻漿器將其勻漿，將組織勻漿于600g離心10分鐘。收集得到的上清再于17000g離心10 分鐘。線粒體沉淀用A液重懸后，于7000g離心10分鐘，沉淀用B液(300mM sucrose, 2mM HEPES, 0. ImM EGTA ；pH7. 4)重懸，并于3500g離心10分鐘，得到的線粒體沉淀用B液重懸后進(jìn)行蛋白定量。以上所有操作都在4°C進(jìn)行。所得到的線粒體保存于-80°C直至酶活檢測(cè)。NADH-CoQ 氧化還原酶(complex I)反應(yīng)體系為50mmol/LTris-HCl pH8. 1,0. 05mmol/L DCIP，0. ；35 % 牛血清白蛋白(BSA)，lymol/L 抗霉素 A(antimycin A)，0. 2mmol/L 疊氮鈉(NaN3)，0. 05mmol/L 輔酶 Ql (coenzyme Ql)，通過(guò)200 μ mol/L還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)啟動(dòng)反應(yīng)，然后在30°C條件下讀取600nm處吸光值的變化2分鐘。CoQ-cytochrome c 還原酶(complex III)反應(yīng)體系為50mmol/LTris-HCl pH 7. 8，0. 2mmol/L 疊氮鈉(NaN3)，0. 05 % 吐溫-20(Tween-20)，0. 01%牛血清白蛋白(BSA)，0. 05mmol/L 細(xì)胞色素 C(Cytochrome C)，通過(guò)0. 05mmol/Ldecylubiquinol啟動(dòng)反應(yīng)，然后在30°C條件下讀取550nm處吸光值的變化2分鐘。a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(a-KGDH)反應(yīng)體系為35mmol/L 磷酸鉀緩沖液(potassium phosphate buffer ρΗ7· 25)， 2mmol/L 疊氮鈉(NaN3), 0. 5mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，2. 5 μ mol/L 魚(yú)藤酮(rotenone)， 5mmol/L氯化鎂(MgCl2)，0. 5mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，0. 2mmol/L焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate), 2mmol/L a_ 酮戊二酸(a-Ketoglutarate)，通過(guò) 0. 04mmol/
6L輔酶A(CoASH)啟動(dòng)反應(yīng)，然后在30°C條件下讀取340nm處吸光值的變化2分鐘。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的測(cè)定按600，000/孔的比例，將心肌細(xì)胞H9c2種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，靜置待細(xì)胞貼壁恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，使用20μπιΟ1/1 EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M 小時(shí)，摒棄培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍，然后加入溶解在無(wú)血清的L-DMEM培養(yǎng)基中的&DCFDA 于37°C培養(yǎng)箱中孵育0. 5小時(shí)，接著去除H2DCFDA溶液，用PBS清洗一遍，加入細(xì)胞裂解液 (10mmol/L Tris, 150mmol/L NaCl，0. lmmol/L EDTA,0. 5% Triton X-100，pH 7.5)，離心 (15000g，10min，4°C)得到上清液用熒光分析儀檢測(cè)(激發(fā)光485nm，發(fā)射光538 nm)，同時(shí)用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，最終以熒光OD值/蛋白含量表示活性氧的變化情況。自噬泡(自噬小體和自噬溶酶體)的觀察H9c2細(xì)胞用EGFP-LC3轉(zhuǎn)染12個(gè)小時(shí)后，先用20ymol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)，摒棄培養(yǎng)基，用多聚甲醛固定15分鐘后，于激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬泡的形成。H9c2細(xì)胞用20 μ mol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)后，摒棄培養(yǎng)基，加入無(wú)血清的L-DMEM培養(yǎng)基，用MDC染色30分鐘，接著去除MDC溶液， 用PBS清洗一遍，然后在熒光顯微鏡下觀察藍(lán)白色熒光的變化并拍照記錄。FoxOl siRNA干擾和過(guò)表達(dá)按照150000/孔的比例，將H9c2細(xì)胞接種于6孔板中，第二天按照脂質(zhì)體2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將 FoxOl 的 siRNA (序列為 5，-UGAAUAGCAAGGUGUCUGCTT-3，)轉(zhuǎn)入 H9c2 細(xì)胞，24小時(shí)后，用25mmol/L葡萄糖再處理M小時(shí)，收集蛋白用于免疫印跡分析。按照脂質(zhì)體2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將FoxOl野生型表達(dá)載體 pCDNA3-Fox01-FLAG以及磷酸化位點(diǎn)突變的表達(dá)載體pCDNA3_Fox01 (3A) -FLAG轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞H9c2中，48個(gè)小時(shí)后，收集蛋白用于免疫印跡分析。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得出的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件的單向方差分析方法(ANOVA)中的Fisher' s LSD方法進(jìn)行結(jié)果的差異顯著性分析。差異顯著性按如下說(shuō)明+P < 0. 05，++P < 0. 01，+++P < 0. 001 ；*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。實(shí)施例一EGCG對(duì)GK大鼠心臟中線粒體功能紊亂的治療效果分別從正常Wistar大鼠，糖尿病GK大鼠和EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中提取蛋白質(zhì)及線粒體，然后用蛋白免疫印跡的方法來(lái)檢測(cè)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖1A，GK 大鼠心臟中線粒體呼吸鏈復(fù)合體以及VDACl的表達(dá)量都有所下降，而EGCG對(duì)其有很好的恢復(fù)作用；用酶活測(cè)定的方法來(lái)檢測(cè)線粒體相關(guān)酶的酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖1B，EGCG對(duì)于增加GK 大鼠心臟中粒體呼吸鏈復(fù)合體酶(I，III)以及酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體酶的酶活性有著顯著的作用。實(shí)施例二EGCG對(duì)GK大鼠心臟中二相酶表達(dá)上調(diào)的恢復(fù)效果。二相酶的表達(dá)量是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要指標(biāo)，它的升高也能從側(cè)面反應(yīng)體內(nèi)的氧化應(yīng)激增加。分別從正常Wistar大鼠，糖尿病GK大鼠和EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中提取蛋白質(zhì)，用蛋白免疫印跡的方法來(lái)檢測(cè)二相酶的表達(dá)量。從圖2中可以看出，糖尿病GK大鼠心臟中的二相酶(NQ01，HOl，MnSOD)表達(dá)量相對(duì)于Wistar大鼠有著顯著的上調(diào)，而EGCG 的飼養(yǎng)能夠有效的減少二相酶的表達(dá)量。實(shí)施例三EGCG對(duì)GK大鼠心臟中線粒體生成及動(dòng)態(tài)學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。我們發(fā)現(xiàn)GK大鼠心臟中線粒體有著功能紊亂以及數(shù)目減少的現(xiàn)象，推測(cè)這些現(xiàn)象可能與線粒體生成及動(dòng)態(tài)學(xué)的變化有關(guān)。從圖3A可以看出，GK大鼠心臟線粒體生成相關(guān)蛋白的表達(dá)量有所增加，EGCG的飼養(yǎng)對(duì)其有恢復(fù)作用；從圖:3B可以看出，GK大鼠心臟線粒體融合相關(guān)蛋白沒(méi)有變化，但分裂相關(guān)蛋白Drpl有所減少，EGCG則能夠恢復(fù)其到正常大鼠Wistar的表達(dá)水平。實(shí)施例四EGCG對(duì)GK大鼠心臟中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量上調(diào)的抑制效果。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測(cè)GK大鼠心臟中線粒體功能障礙的現(xiàn)象是由于自噬增加所引起的，EGCG對(duì)自噬可能有一定的抑制作用從而達(dá)到恢復(fù)線粒體功能的效果。我們用蛋白免疫印跡的方法來(lái)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖4A，B，EGCG對(duì)于GK大鼠心臟中的自噬上調(diào)(LC3B，Atg家族蛋白表達(dá)量的增加)有著明顯的抑制效果。而從圖4C中可以看出在胰島素的作用下控制自噬的兩條通路中，mTOR無(wú)明顯變化，而R)x0s家族蛋白量在 GK大鼠心臟中的表達(dá)量升高會(huì)被EGCG所抑制。實(shí)施例五EGCG能抑制心肌細(xì)胞H9c2中由高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗，自噬增加，氧化應(yīng)激上調(diào)以及線粒體數(shù)目減少。H9c2細(xì)胞用20 μ mol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)，最后用lOOnmol/L的胰島素處理10分鐘，蛋白免疫印跡雜交檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量。 如圖5A所示，ρ-ΑΚΤ和p-GSK3 β是胰島素抵抗的兩個(gè)標(biāo)志分子，高糖處理組中ρ_ΑΚΤ和 P-GSK3 β有著明顯的下降，說(shuō)明25mmol/L葡萄糖能夠誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，而 20 μ mol/L EGCG預(yù)處理則能夠有效預(yù)防胰島素抵抗的發(fā)生；從圖5B可以看出，EGCG對(duì)于高糖誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白i^oxOl，F(xiàn)ox03a, Atg7，Atgl2_Atg5和LOB的表達(dá)升高都有著明顯的抑制效果；LC3-II/LC3-I的比值代表著自噬的強(qiáng)度，圖5C說(shuō)明EGCG能有效的抑制H9c2細(xì)胞中由高糖引起的自噬上調(diào)；線粒體功能紊亂與胰島素抵抗密切相關(guān)，從圖5D可以看出， 高糖誘導(dǎo)可造成H9c2細(xì)胞中線粒體成分Complex III，Complex IV和VDACl的減少，EGCG 則可以阻止這種現(xiàn)象的發(fā)生；活性氧主要是由于線粒體氧化磷酸化過(guò)程中電子滲漏造成的，圖5D，E說(shuō)明EGCG可以抑制由高糖引起的活性氧產(chǎn)生以及相應(yīng)的二相酶上調(diào)；當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的LC3會(huì)聚集起來(lái)，形成自噬泡，用EGFP-LC3轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞12小時(shí)后，先用 20 μ mol/L EGCG預(yù)處理M小時(shí)，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬泡的形成，如圖F，G，EGCG處理組細(xì)胞中的LC3斑點(diǎn)明顯少于高糖誘導(dǎo)組；MDC常常被用于自噬途徑通暢的檢測(cè)。從圖5H中可以看到，H9c2細(xì)胞經(jīng)20 μ mol/L EGCG處理M 小時(shí)后，熒光強(qiáng)度變?nèi)酰馕吨允膳萑狈φ９δ艿乃嵝原h(huán)境。實(shí)施例六
FoxOl所調(diào)控的自噬在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中起重要作用。動(dòng)物試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞自噬的上調(diào)與R)x01有關(guān)，我們用R)X01 siRNA轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，隨后用25mmol/L葡萄糖處理M小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R)x01干擾的H9c2細(xì)胞中自噬下調(diào)，同時(shí)線粒體成分Complex IV和VDACl都有所上升，說(shuō)明R)x01在高糖誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的自噬上調(diào)中起重要作用，如圖6A，B ；FoxOl野生型表達(dá)載體ρ⑶NA3-Fox01-FLAG以及磷酸化位點(diǎn)突變的表達(dá)載體ρ⑶NA3-Fox01 (3A) -FLAG轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞H9c2，結(jié)果表明磷酸化位點(diǎn)突變的i^oxOl過(guò)表達(dá)并不能引起自噬的增加，說(shuō)明FoxOl過(guò)表達(dá)后通過(guò)非轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式增加H9c2細(xì)胞自噬，如圖6C，D0由上述結(jié)果可見(jiàn)，EGCG可以有效的預(yù)防和治療II型糖尿病及其所伴隨的線粒體功能障礙，自噬增加以及氧化應(yīng)激上調(diào)，并且提示 ^οχΟΙ可能作為一個(gè)EGCG的治療靶點(diǎn)，在調(diào)控自噬中起了非常重要的作用。此次發(fā)現(xiàn)對(duì)于有效的理解EGCG在糖尿病預(yù)防上的作用機(jī)制有非常好的提示作用。
權(quán)利要求
1.EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，EGCG抑制由自噬引起的心臟線粒體功能的失調(diào)。
2.EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，EGCG用于抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的自噬上調(diào)。
3.EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，EGCG用于抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的氧化應(yīng)激的活化。
4.EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，EGCG用于恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的線粒體功能紊亂。
5.EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，EGCG用于降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2的胰島素抵抗。
全文摘要
本發(fā)明為EGCG在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，涉及生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，其目的在于提供EGCG在治療II型糖尿病中的用途，其技術(shù)特征主要在于，EGCG可以有效的預(yù)防和治療II型糖尿病及其所伴隨的心肌細(xì)胞中線粒體功能障礙，自噬增加以及氧化應(yīng)激上調(diào)，并且提示EGCG對(duì)于胰島素抵抗的抑制作用可能是通過(guò)抑制FoxO1對(duì)于自噬的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的，提示FoxO1可能是一個(gè)治療糖尿病的靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102526023SQ201210009960
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者嚴(yán)炯, 馮智輝, 劉健康, 劉甲, 劉靜, 龍建綱 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)