專利名稱：一種靶向熱敏脂質體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向給藥系統，特別是涉及一種腫瘤歸巢肽修飾的靶向熱敏脂質體組合物。本發明還涉及所述靶向熱敏脂質體組合物的制備方法和所述靶向熱敏脂質體組合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
脂質體(liposomes)在過去四十年中作為化療藥物給藥系統的載體，尤其是在腫瘤治療方面，得到了廣泛的發展。近年來，結合了物理化學靶向和脈沖釋放性能的熱敏脂質體在抗腫瘤領域越來越引起重視。熱敏脂質體(thermosensitive liposomes, TSL)是一類由相變溫度略高于正常組織溫度的溫敏材料制成的，能在局部高溫條件下迅速將所載藥物釋放的脂質體。在正常的體溫下，脂質體膜呈致密排列的膠晶態，親水性藥物很難透過脂質體膜而擴散出來。當脂質體隨血液循環經過被加熱的靶器官時，局部的高溫使磷脂分子運動加強，脂質體膜的結構發生變化，原來排列整齊致密的膠晶態磷脂雙分子層在較高溫度下變成疏松混亂的液晶態，導致脂質體迅速釋放內含藥物。目前抗腫瘤藥物熱敏脂質體研究中的最大問題是如何提高其在腫瘤部位的濃度， 降低抗腫瘤藥物對內皮網狀系統及正常組織的毒性。雖然熱敏脂質體已經集被動靶向性 (從間隙比較大的腫瘤血管中泄漏進入腫瘤部位，實現在腫瘤中的蓄積)和物理化學靶向性(在高于相變溫度時，將所包封的藥物釋放于加熱部位)于一身，但是有文獻報道，這兩種靶向作用的效果在對抗腫瘤藥效的提高上并不明顯。因此，如何顯著提高熱敏脂質體的靶向性，增強熱敏脂質體的抗腫瘤效果，是本領域亟待解決的問題。腫瘤歸巢肽(tumor homing peptide)由于特異性強、生物相容性好、無毒、無免疫原性，是用于主動靶向的良好配體。所謂腫瘤歸巢肽，是一類由幾個到幾十個氨基酸組成的肽鏈序列，能以高度的親和力和特異性結合到腫瘤細胞或者腫瘤血管/淋巴管。除此之外， 很多腫瘤歸巢肽能被腫瘤細胞內化，在腫瘤細胞內以很高的濃度積累。CREKA(cys-arg-glu-lys-ala)是一種由半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸和丙氨酸組成的五肽，其作用于腫瘤微環境，對乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤等多種癌細胞均有靶向作用，沒有腫瘤選擇性。CREKA在體內發揮靶向作用的機制是1.識別腫瘤血管和間隙中特異性存在的凝固的血漿蛋白，選擇性歸巢到腫瘤部位；2、不僅歸巢到腫瘤部位，同時能夠自擴大化歸巢作用，即CREKA在腫瘤部位積累后，能夠誘導額外的局部凝固，因而產生出更多的CREKA結合位點，類似于血小板的自擴大效應。目前，國內外尚沒有利用CREKA對包含抗腫瘤藥物的熱敏脂質體進行修飾的報道。

發明內容
本發明的創新點在于將熱敏脂質體與主動靶向技術相結合，實現多種靶向技術的
3配合，以提高熱敏脂質體的靶向性，增強熱敏脂質體的抗腫瘤效果。為此，本發明的一個目的是提供一種靶向熱敏脂質體組合物，所述組合物包括表面修飾有腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的熱敏脂質體，所述熱敏脂質體中包含有抗腫瘤藥物。本發明的另一個目的是提供所述靶向熱敏脂質體組合物的制備方法。本發明的另一個目的是提供所述靶向熱敏脂質體組合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。本發明的技術方案和要點將在下面作詳細說明。本發明還涉及以下技術方案1、一種靶向熱敏脂質體組合物，其特征在于所述組合物包括表面修飾有腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的熱敏脂質體，所述熱敏脂質體中包含有抗腫瘤藥物。2、如項1所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、吡柔比星、阿柔比星、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬和甲氨蝶呤中的一種或多種。3、如項2所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中抗腫瘤藥物的藥脂比(藥物與脂材的質量比)為 1 10w/w 1 50w/w，例如 1 10w/w、l 20w/w、l 30w/w、l 40w/ w、l 50w/wo4、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、 熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物。5、如項4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述腫瘤歸巢肽導向化合物 DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段是通過將腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段與DSPE-PEG-馬來酰亞胺溶解于液體介質中，調節液體介質的pH 值至6. 0-8. O范圍內，持續攪拌反應，純化反應所得物，經冷凍干燥得到的腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。6、如項5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中調節液體介質的pH值至6. 5-7. 5范圍內，優選調節PH值至6. 8-7.2的范圍內，更優選調節pH值至6. 9-7. 1的范圍，最優選調節至PH值為7.0。7、如項5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述液體介質為可將腫瘤歸巢肽 CREKA與DSPE-PEG-馬來酰亞胺溶解于其中的任意種類的液體介質，例如水性溶劑和有機溶劑。8、如項5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述反應是在惰性氣體的保護下進行的。9、如項5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述反應是在環境溫度下進行的， 優選在15°C _35°C的溫度進行，更優選在20°C -30°C的溫度進行，最優選在25°C的溫度進行。10、如項5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述攪拌的時間為M小時以上。11、如項5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述純化反應所得物的步驟是通過對反應所得物進行透析的方法來實現的。12、如項4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述熱敏脂質體膜材包括DPPC和 DSPC。13、如項4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述熱敏脂質體膜材包括DPPC、 HSPC 禾口 CHOL014、如項4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述熱敏脂質體膜材包括DPPC和 MSPC。15、如項4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述熱敏脂質體膜材包括DPPC、 MSPC 禾口 DSPG016、如項4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述熱敏脂質體膜材包括DPPC和 MPPC017、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括 DPPC、DSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、DSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之間的摩爾比為 DPPC DSPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=60 100 25 5 0.2 10 0. 2 10，優選70 90 20 10 0.5 5 0.5 5，例如 80 19 0. 5 0. 5,80 18 1 1、80 17 1. 5 1. 5、 80 16 2 2、80 15 2.5 2. 5,80 14 3 3 和 80 10 5 5。18、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括 DPPC、HSPC, CHOL, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、HSPC, CHOL, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之間的摩爾比為DPPC HSPC CHOL DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA或 DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段=90 110 40 60 20 40 1 6 1 6，例如 95 105 45 55 25 35 2 5 2 5，優選 100 50 30 3 3。19、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括 DPPC、MSPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之間的摩爾比為 DPPC MSPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=80 120 0.5 20 0.2 5 0. 2 5，優選85 100 1 10 0.5 2. 5 0. 5 2. 5，更優選 86 10 2 2、90 10 2 2、95 5 2 2、 97. 5 2.5 2 2、99 :1:2: 2、89 10 2. 5 2. 5,90 10 2 2、 91 10 1.5 1. 5,92 10 1 1 禾口 93 10 0. 5 0. 5。20、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括 DPPC、MSPC, DSPG、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC, DSPG、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之間的摩爾比為DPPC MSPC DSPG DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA或 DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段=60 100 2 20 2 20 0. 5 5 0. 5 5，優選 70 90 6 10 8 12 1 3 1 3，更優選 82 8 10 2 2。21、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括 DPPC、MPPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MPPC、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段之間的摩爾比為DPPC MPPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的月太段=70 110 2 20 0.5 5 0. 5 5，優選80 100 8 12 1 3 1 3，更優選 90 10 2 2。22、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述的靶向熱敏脂質體組合物被進一步制成藥物劑型，例如注射劑、輸液、凍干粉針劑或噴霧劑。23、如項1所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，包括如下步驟以腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物為原料，采用薄膜分散法或逆向蒸發法制備靶向熱敏脂質體組合物。24、如項23所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述采用薄膜分散法制備靶向熱敏脂質體組合物包括下述步驟將DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物溶解于有機溶劑中；除去有機溶劑，以在容器壁上形成脂質薄膜；加入任選含有抗腫瘤藥物的緩沖液，進行水化處理，以形成粗脂質體混懸液；對粗脂質體混懸液進行超聲粉碎處理；對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化，從而得到靶向熱敏脂質體組合物。25、如項23所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述采用薄膜分散法制備靶向熱敏脂質體組合物包括下述步驟將DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物溶解于有機溶劑中；除去有機溶劑，以在容器壁上形成脂質薄膜；加入任選含有抗腫瘤藥物的緩沖液，進行水化處理，以形成粗脂質體混懸液；對粗脂質體混懸液進行超聲粉碎處理；對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化；將純化后的脂質體混懸液與抗腫瘤藥物的溶液進行恒溫共孵育，并對共孵育后的脂質體進行純化，從而得到靶向熱敏脂質體組合物。26、如項M或25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述除去有機溶劑是通過在一定溫度的水浴條件下(例如30-60°C )減壓旋轉蒸發來實現的。27、如項M或25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述水化處理是通過對緩沖液進行渦旋震蕩和/或超聲處理來實現的。28、如項M或25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述任選含有抗腫瘤藥物的緩沖液為任選含有抗腫瘤藥物的硫酸銨緩沖液或PH = 4的檸檬酸緩沖液。29、如項M或25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述對粗脂質體混懸液進行超聲粉碎處理是利用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機來實現的。30、如項M或25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化是通過將超聲粉碎處理后的脂質體混懸液通過kphadexG50柱，用磷酸鹽緩沖溶液(PBQ或漢克平衡鹽溶液(HBQ洗脫并收集脂質體部分來實現的。31、如項M或25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化是通過將超聲粉碎處理后的脂質體離心并收集上清部分來實現的。32、如項25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述恒溫共孵育是在 37度恒溫水浴震蕩器中進行的。33、如項25所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述對共孵育后的脂質體進行純化是通過將共孵育后的脂質體再次通a^phadex G50柱，除去未包封的抗腫瘤藥物并收集脂質體部分來實現的。34、如項23所述的靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，其中所述采用逆向蒸發法制備靶向熱敏脂質體組合物包括下述步驟將DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材和DSPE-PEG溶于有機溶劑(如氯仿、乙醚等)中，加入待包封的抗腫瘤藥物的水溶液，其中抗腫瘤藥物的水溶液與有機溶劑的體積比為抗腫瘤藥物的水溶液有機溶劑= 1 3 1 6 ；對上述步驟形成的溶液進行超聲，直至形成WO型乳劑；減壓蒸發溶劑至形成凝膠；繼續減壓蒸發，從而得到靶向熱敏脂質體組合物；或者在混勻器上機械振蕩，使凝膠塊破碎并轉變成液體，減壓蒸發揮去溶劑，從而得到靶向熱敏脂質體組合物。35、如項1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。36、如項35所述的用途，其中所述惡性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤。術語“CREKA(cys-arg-glu-lys-ala) ”表示一種由半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸和丙氨酸組成的腫瘤歸巢肽?！熬哂蠧REKA核心序列的肽段”表示核心序列為CREKA的腫瘤歸巢肽?？商峒暗膶嵗ǖ幌抻诃h狀CREKA-CREKA(通過二硫鍵相連)。在本發明中，“CREKA”或“具有 CREKA核心序列的肽段”用以修飾熱敏脂質體，實現熱敏脂質體的主動靶向。上述肽段是本領域的技術人員所容易設計和制備的。“DPPC”表示二棕櫚酰磷脂酰膽堿?！癕SPC”表示1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿。
“DSPG”表示二硬脂酰磷脂酰甘油。“MPPC”表示肉豆蔻酰磷脂酰膽堿?！癉SPC”表示二硬脂酰磷脂酰膽堿?！癏SPC”表示氫化大豆卵磷脂?！癈H0L”表示膽固醇?！癙BS”表示磷酸鹽緩沖溶液。
“HBS”表示漢克平衡鹽溶液。"DSPE-PEG-馬來酰亞胺”表示1，2_硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇_馬來酰亞胺。在本發明中，其用于與CREKA或具有CREKA核心序列的肽段反應構建腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段?！癉SPE-PEG”表示1，2_硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇，其是本領域用于對脂質體進行PEG化(即使脂質體表面修飾有親水性的PEG分子從而實現脂質體的長循環效應) 的常用物質?！澳敢骸北硎九渲朴谶m當溶劑中的抗腫瘤藥物的溶液?！八幹取北硎舅幬锱c脂材的質量比“ %，，如無相反指示，“ %，，表示質量體積百分比。詳細說明本發明的下列技術特征之間可以進行任意的組合，以形成不同的技術方案。本發明首先提供一種靶向熱敏脂質體組合物，其特征在于所述組合物包括表面修飾有腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的熱敏脂質體，所述熱敏脂質體中包含有抗腫瘤藥物。在一個實施方案中，所述抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、吡柔比星、阿柔比星、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、甲氨蝶呤等中的一種或多種。在一個實施方案中，制成所述熱敏脂質體的原料包括腫瘤歸巢肽導向化合物 DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物。在一個實施方案中，抗腫瘤藥物的藥脂比為1 lOw/w 1 50w/w，例如 1 10w/wU 20w/w、l 30w/w、l 40w/w、l 50w/w。在一個實施方案中，所述腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段是通過將腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段與 DSPE-PEG-馬來酰亞胺溶解于液體介質中，調節液體介質的pH值至6. 0-8. O范圍內，持續攪拌反應，純化反應所得物，經冷凍干燥得到的腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或 DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。其中，優選調節液體介質的pH值至6. 5-7. 5范圍內，更優選調節pH值至6. 8-7. 2 的范圍內，更優選調節PH值至6. 9-7. 1的范圍，最優選調節至pH值為7. O。 所述液體介質為可將腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG-馬來酰亞胺溶解于其中的任意種類的液體介質，例如水性溶劑和有機溶劑。適宜的溶劑是本領域的技術人員容易選擇和確定的。所述反應優選是在惰性氣體的保護下進行的。惰性氣體的實例包括但不限于氮氣、二氧化碳和惰性稀有氣體，例如氖、氬、氪和氙。所述反應優選是在環境溫度下進行的，更優選在15-35°C的溫度進行，更優選在 20-30°C的溫度進行，最優選在25°C的溫度進行。所述攪拌的時間優選為M小時以上。所述純化反應所得物的步驟優選是通過對反應所得物進行透析的方法來實現的。在一個實施方案中，所述熱敏脂質體膜材包括DPPC( 二棕櫚酰磷脂酰膽堿)和DSPC ( 二硬脂酰磷脂酰膽堿)。在一個實施方案中，所述熱敏脂質體膜材包括DPPC、HSPC(氫化大豆卵磷脂)和 CHOL(膽固醇)。在一個實施方案中，所述熱敏脂質體膜材包括DPPC及MSPC (1-肉豆蔻酰_2_硬脂酰磷脂酰膽堿)。在一個實施方案中，所述熱敏脂質體膜材包括DPPC、MSPC和DSPG ( 二硬脂酰磷脂酰甘油)。在一個實施方案中，所述熱敏脂質體膜材包括DPPC和MPPC(肉豆蔻酰磷脂酰膽堿)。在一個實施方案中，制成所述熱敏脂質體的原料包括DPPC、DSPC、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、DSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之間的摩爾比為DPPC D SPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=60 100 25 5 0.2 10 0. 2 10，優選 70 90 20 10 0. 5 5 0. 5 5， 例如 80 19 0. 5 0. 5,80 18 1 1,80 17 1. 5 1. 5,80 16 2 2、 80 15 2.5 2. 5,80 14 3 3 和 80 10 5 5。在一個實施方案中，制成所述熱敏脂質體的原料包括DPPC、HSPC、CHOL、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、HSPC, CHOL, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之間的摩爾比為DP PC HSPC CHOL DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段 =90 110 40 60 20 40 1 6 1 6，例如 95 105 45 55 25 35 2 5 2 5，優選 100 50 30 3 3。在一個實施方案中，制成所述熱敏脂質體的原料包括DPPC、MSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC、DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之間的摩爾比為DPPC MSPC D SPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=80 120 0. 5 20 0.2 5 0. 2 5，優選 85 100 1 10 0. 5 2. 5 0. 5 2. 5，更優選 86 10 2 2、90 10 2 2、95 :5:2: 2,97. 5 2. 5 2 2、99 1 2 2、 89 10 2.5 2. 5,90 10 2 2、91 10 1. 5 1. 5,92 10 1 1 和 93 10 0. 5 0. 5。在一個實施方案中，制成所述熱敏脂質體的原料包括DPPC、MSPC、DSPG、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MSPC、DSPG、 DSPE-PEG、DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之間的摩爾比為DP PC MSPC DSPG DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段 =60 100 2 20 2 20 0. 5 5 0. 5 5，優選 70 90 6 10 8 12 1 3 1 3，更優選 82 8 10 2 2。在一個實施方案中，制成所述熱敏脂質體的原料包括DPPC、MPPC、DSPE-PEG、 DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段，其中 DPPC、MPPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段之間的摩爾比為DPPC MPPC DSPE-PEG DSPE-PEG-CREKA 或 DSPE-PEG-具有 CREKA 核心序列的肽段=70 110 2 20 0.5 5 0. 5 5，優選 80 100 8 12 1 3 1 3，更優選 90 10 2 2。所述的靶向熱敏脂質體組合物可以進一步制成藥物劑型，例如注射劑、輸液、凍干粉針劑或噴霧劑。本發明的另一個方面提供所述靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，包括如下步驟以腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物為原料，采用薄膜分散法或逆向蒸發法制備靶向熱敏脂質體組合物。在一個實施方案中，所述采用薄膜分散法制備靶向熱敏脂質體組合物包括下述步驟將DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物溶解于有機溶劑中；除去有機溶劑，以在容器壁上形成脂質薄膜；加入任選含有抗腫瘤藥物的緩沖液，進行水化處理，以形成粗脂質體混懸液；對粗脂質體混懸液進行超聲粉碎處理；對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化，從而得到靶向熱敏脂質體組合物。在一個實施方案中，所述采用薄膜分散法制備靶向熱敏脂質體組合物包括下述步驟將DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物溶解于有機溶劑中；除去有機溶劑，以在容器壁上形成脂質薄膜；加入任選含有抗腫瘤藥物的緩沖液，進行水化處理，以形成粗脂質體混懸液；對粗脂質體混懸液進行超聲粉碎處理；對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化；將純化后的脂質體混懸液與抗腫瘤藥物的溶液進行恒溫共孵育，并對共孵育后的脂質體進行純化，從而得到靶向熱敏脂質體組合物。其中，所述除去有機溶劑優選是通過在一定溫度的水浴條件下(例如30-60°C )減壓旋轉蒸發來實現的。所述水化處理優選是通過對緩沖液進行渦旋震蕩和/或超聲處理來實現的。所述任選含有抗腫瘤藥物的緩沖液優選為任選含有抗腫瘤藥物的硫酸銨緩沖液或PH = 4的檸檬酸緩沖液。所述對粗脂質體混懸液進行超聲粉碎處理優選是利用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機來實現的。所述對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化優選是通過將超聲粉碎處理后的脂質體混懸液通過kphadex G50柱，用磷酸鹽緩沖溶液(PBQ或漢克平衡鹽溶液(HBS) 洗脫并收集脂質體部分來實現的。所述對超聲粉碎處理后的脂質體混懸液進行純化優選是通過將超聲粉碎處理后的脂質體離心并收集上清部分來實現的。
所述恒溫共孵育優選是在37度恒溫水浴震蕩器中進行的。所述對共孵育后的脂質體進行純化優選是通過將共孵育后的脂質體再次通過 Sephadex G50柱，除去未包封的抗腫瘤藥物并收集脂質體部分來實現的。在一個實施方案中，所述采用逆向蒸發法制備靶向熱敏脂質體組合物包括下述步驟將DSPE-PEG-腫瘤歸巢肽或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材和DSPE-PEG溶于有機溶劑(如氯仿、乙醚等)中，加入待包封的抗腫瘤藥物的水溶液，其中抗腫瘤藥物的水溶液與有機溶劑的體積比為抗腫瘤藥物的水溶液有機溶劑= 1 3 1 6 ；對上述步驟形成的溶液進行超聲，直至形成WO型乳劑；減壓蒸發溶劑至形成凝膠；繼續減壓蒸發，從而得到靶向熱敏脂質體組合物；或者在混勻器上機械振蕩，使凝膠塊破碎并轉變成液體，減壓蒸發揮去溶劑，從而得到靶向熱敏脂質體組合物。優選的，本發明提供一種所述靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，所述熱敏脂質體中包含水溶性藥物(例如阿霉素)，所述方法包括如下步驟將腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材和DSPE-PEG置于茄形瓶中，加入有機溶劑將其溶解，在45°C水浴條件下減壓旋轉蒸發，形成均勻的透明薄膜；向茄形瓶中加入硫酸銨溶液或PH = 4的檸檬酸緩沖液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈現藍色乳光；將所得脂質體過kphadex G50柱，用PBS或用pH = 7的HBS，收集脂質體部分，得空白脂質體；將水溶性抗腫瘤藥物(例如阿霉素)溶于少量蒸餾水中，與空白脂質體在37度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次過kphadex G50柱，除去未包裹的水溶性抗腫瘤藥物(例如阿霉素)，收集脂質體部分，即得靶向熱敏脂質體組合物。還優選的，本發明提供一種所述靶向熱敏脂質體組合物的制備方法，所述熱敏脂質體中包含脂溶性藥物，所述方法包括如下步驟將腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材和DSPE-PEG置于茄形瓶中，加入有機溶劑將其溶解，再加入脂溶性抗腫瘤藥物母液，在45°C水浴條件下減壓旋轉蒸發，形成均勻的透明薄膜；向茄形瓶中加入預熱(45°C)的PBS或pH = 7的HBS溶液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光；將所得脂質體離心，收集上清部分， 即得靶向熱敏脂質體組合物。本發明的另一個方面提供所述靶向熱敏脂質體組合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。在一個實施方案中，所述惡性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤。本發明的優點和/或能夠產生的效果(特別是預料不到的技術效果)在于將熱敏脂質體在局部加熱條件下大量釋放所載藥物所產生的物理化學靶向與腫瘤歸巢肽CREKA的主動靶向相結合，起到協同抗腫瘤作用，對腫瘤的殺傷力更強，對正常組織的毒副作用更低。


圖1為阿霉素攝取(流式細胞儀)實驗結果圖2為阿霉素攝取(激光共聚焦)實驗結果圖3為藥效實驗結果
具體實施例方式實施例1腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的連接稱取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺(5mg)，即 CREKA 與 DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的摩爾比為2 1，溶解于:3ml PBS中(即反應物濃度為^ig/ ml)，調節pH為7，在氮氣保護下，室溫攪拌M小時。取上述反應所得物料置于截留分子量為2000的透析袋中透析48小時，經冷凍干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。實施例2腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的連接稱取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺(IOmg)，即 CREKA 與 DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的摩爾比為1 1，溶解于5. 55ml PBS中(即反應物濃度為^ig/ ml)，調節pH為7，在氮氣保護下，室溫攪拌M小時。取上述反應所得物料置于截留分子量為2000的透析袋中透析48小時，經冷凍干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。實施例3腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的連接稱取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺(5mg)，即 CREKA 與 DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的摩爾比為2 1，溶解于6. Iml PBS中(即反應物濃度為Img/ ml)，調節pH為7，在氮氣保護下，室溫攪拌M小時。取上述反應所得物料置于截留分子量為2000的透析袋中透析48小時，經冷凍干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。實施例4腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的連接稱取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺(5mg)，即 CREKA 與 DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的摩爾比為2 1，溶解于^il PBS中(即反應物濃度為!Bmg/ ml)，調節pH為7，在氮氣保護下，室溫攪拌M小時。取上述反應所得物料置于截留分子量為2000的透析袋中透析48小時，經冷凍干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。實施例5腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的連接稱取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺(5mg)，即 CREKA 與 DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的摩爾比為2 1，溶解于1.22ml PBS中(即反應物濃度為5mg/ ml)，調節pH為7，在氮氣保護下，室溫攪拌M小時。取上述反應所得物料置于截留分子量為2000的透析袋中透析48小時，經冷凍干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。實施例6腫瘤歸巢肽CREKA與DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的連接
稱取CREKA(1. lmg)、DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺(5mg)，即 CREKA 與 DSPE-PEG2000-馬來酰亞胺的摩爾比為2 1，溶解于:3ml DMF中(即反應物濃度為^ig/ ml)，用三乙胺調節pH為7，在氮氣保護下，室溫攪拌M小時。取上述反應所得物料置于截留分子量為2000的透析袋中透析48小時，經冷凍干燥得到DSPE-PEG2000-CREKA。實施例7CREKA靶向的阿霉素熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入異丙醇溶解， 45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的檸檬酸緩沖液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體過kphadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脫，收集脂質體部分， 得空白脂質體，向空白脂質體中加入2mg/ml的阿霉素母液0.5ml，使藥脂比為1 20m/m， 37度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次過kphadex G50柱，除去未包裹的游離阿霉素，收集脂質體部分，即得最終阿霉素靶向脂質體。實施例8CREKA靶向的阿霉素熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE-PEG-CREKA，置于茄形瓶中，加入二氯甲烷溶解，45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的檸檬酸緩沖液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體a^phadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脫，收集脂質體部分，得空白脂質體，向空白脂質體中加入2mg/ml的阿霉素母液0. 5ml，使藥脂比為1 20m/ m, 37度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次過kphadex G50柱，除去未包裹的游離阿霉素，收集脂質體部分，即得最終阿霉素靶向脂質體。實施例9CREKA靶向的阿霉素熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC10l.Bmg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，45 度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入PH = 4的檸檬酸緩沖液， 渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體過kphadex G50柱，用HBS(pH = 7)洗脫，收集脂質體部分，得空白脂質體，向空白脂質體中加入2mg/ml的阿霉素母液0. 5ml，使藥脂比為1 20m/m，37度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次a^phadex G50柱，除去未包裹的游離阿霉素，收集脂質體部分，即得最終阿霉素靶向脂質體。實施例10CREKA靶向的阿霉素熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入異丙醇溶解， 45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的檸檬酸緩沖液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體過kphadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脫，收集脂質體部分， 得空白脂質體，向空白脂質體中加A^iig/ml的阿霉素母液lml，使藥脂比為1 10m/m，37 度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次a^phadex G50柱，除去未包裹的游離阿霉素，收集脂質體部分，即得最終阿霉素靶向脂質體。實施例11CREKA靶向的阿霉素熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mgDSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入異丙醇溶解， 45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入pH = 4的檸檬酸緩沖液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體過kphadex G50柱，用HBS(pH= 7)洗脫，收集脂質體部分， 得空白脂質體，向空白脂質體中加入2mg/ml的阿霉素母液0. 25ml，使藥脂比為1 40m/m， 37度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次過kphadex G50柱，除去未包裹的游離阿霉素，收集脂質體部分，即得最終阿霉素靶向脂質體。實施例12CREKA靶向的阿霉素熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入異丙醇溶解， 45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入硫酸銨溶液(123mM， pH5. 4)，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體過kphadex G50柱，用PBS洗脫，收集脂質體部分，得空白脂質體，向空白脂質體中加入2mg/ml的阿霉素母液0.5ml，使藥脂比為1 20m/m，37度恒溫水浴震蕩器中共孵育，再次a^phadex G50柱，除去未包裹的游離阿霉素，收集脂質體部分，即得最終阿霉素靶向脂質體。實施例13CREKA靶向的紫杉醇熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，再加入ang/ml乙腈溶解的紫杉醇母液0. 5ml，使藥脂比為1 20m/m，45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入anl 45度預熱的5%葡萄糖溶液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。 將所得脂質體離心，12000rpm, 5min,收集上清部分，即得最終紫杉醇靶向熱敏脂質體。實施例14CREKA靶向的紫杉醇熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC10I-Bmg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，再加入ang/ml乙腈溶解的紫杉醇母液0.75ml，使藥脂比為1 30m/m，45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入anl 45度預熱的5%葡萄糖溶液，渦旋震蕩，超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。將所得脂質體離心，12000rpm，&iiin，收集上清部分，即得最終紫杉醇靶向熱敏脂質體。實施例15CREKA靶向的紫杉醇熱敏脂質體的構建
原料摩爾比質量或體積
DPPC8615.45mg
MSPC101.8mg
DSPE-PEG21.207mg
DSPE-PEG-CREKA21.54mg稱量DPPC、MSPC, DSPE-PEG和DSPE_PEG_CREKA，置于茄形瓶中，加入氯仿溶解，再加入ang/ml的乙腈溶解的紫杉醇母液lml，使藥脂比為1 40m/m，45度水浴條件下減壓旋轉蒸發，成均勻的透明薄膜。向茄形瓶中加入anl 45度預熱的5%葡萄糖溶液，渦旋震蕩， 超聲，至脂膜完全脫落溶解，使用探頭超聲的超聲波細胞粉碎機將樣品超聲至呈藍色乳光。 將所得脂質體離心，12000rpm, 5min,收集上清部分，即得最終紫杉醇靶向熱敏脂質體。實施例16CREKA靶向的多西紫杉醇熱敏脂質體的構建
權利要求
1.一種靶向熱敏脂質體組合物，其特征在于所述組合物包括表面修飾有腫瘤歸巢肽 CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的熱敏脂質體，所述熱敏脂質體中包含有抗腫瘤藥物。
2.如權利要求1所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、吡柔比星、阿柔比星、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬和甲氨蝶呤中的一種或多種。
3.如權利要求2所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中抗腫瘤藥物的藥脂比(藥物與脂材的質量比)為 1 10w/w 1 50w/w，例如 1 10w/wU 20w/w、l 30w/w、l 40w/ w、l 50w/wo
4.如權利要求1-3任一項所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中制成所述熱敏脂質體的原料包括腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段、熱敏脂質體膜材、DSPE-PEG和抗腫瘤藥物。
5.如權利要求4所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述腫瘤歸巢肽導向化合物 DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段是通過將腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段與DSPE-PEG-馬來酰亞胺溶解于液體介質中，調節液體介質的pH 值至6. 0-8. O范圍內，持續攪拌反應，純化反應所得物，經冷凍干燥得到的腫瘤歸巢肽導向化合物DSPE-PEG-CREKA或DSPE-PEG-具有CREKA核心序列的肽段。
6.如權利要求5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中調節液體介質的pH值至6.5-7. 5 范圍內，優選調節PH值至6. 8-7.2的范圍內，更優選調節pH值至6. 9-7. 1的范圍，最優選調節至PH值為7.0。
7.如權利要求5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述液體介質為可將腫瘤歸巢肽 CREKA與DSPE-PEG-馬來酰亞胺溶解于其中的任意種類的液體介質，例如水性溶劑和有機溶劑。
8.如權利要求5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述反應是在惰性氣體的保護下進行的。
9.如權利要求5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述反應是在環境溫度下進行的，優選在15°C -35°C的溫度進行，更優選在20°C -30°C的溫度進行，最優選在25°C的溫度進行。
10.如權利要求5所述的靶向熱敏脂質體組合物，其中所述攪拌的時間為M小時以上。
全文摘要
本發明屬于靶向給藥系統領域，具體涉及一種靶向熱敏脂質體組合物，其特征在于所述組合物包括表面修飾有腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的熱敏脂質體，所述熱敏脂質體中包含有抗腫瘤藥物。本發明還涉及所述靶向熱敏脂質體組合物的制備方法和所述靶向熱敏脂質體組合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。本發明的靶向熱敏脂質體具有很好的靶向腫瘤的作用及抗腫瘤效果。
文檔編號A61P35/00GK102552144SQ20121000996
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者張強, 張烜, 王欣 申請人:北京大學