專利名稱：一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化具有治療作用的dna疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗及其應(yīng)用，此種DNA疫苗可直接用于動(dòng)物試驗(yàn)。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病(schistosomiasis)是一種流行廣泛、嚴(yán)重危害人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲(chóng)病。全球每年死于血吸蟲(chóng)病的人數(shù)超過(guò)2萬(wàn)。在我國(guó)流行的是日本血吸蟲(chóng)病。日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma Japonicum, Sj)致病的主要原因是雌蟲(chóng)所產(chǎn)的大量蟲(chóng)卵沉積于肝、腸等組織中，形成蟲(chóng)卵肉芽腫、組織損傷和繼發(fā)性肝纖維化，肝纖維化可進(jìn)一步導(dǎo)致門(mén)脈高壓綜合癥如食管胃底靜脈曲張、肝脾腫大和脾功能亢進(jìn)，患者可因并發(fā)上消化道出血、肝性昏迷及結(jié)腸息肉癌變等嚴(yán)重病癥而致死。目前，血吸蟲(chóng)病疫苗的研究絕大多數(shù)集中在抗感染等預(yù)防性疫苗的研究上，而針對(duì)已經(jīng)感染者，治療性疫苗的研究則極少見(jiàn)。血吸蟲(chóng)感染人體后，雌蟲(chóng)產(chǎn)出蟲(chóng)卵為未成熟蟲(chóng)卵，部分沉積于肝臟，經(jīng)過(guò)初產(chǎn)期、空泡期、胚胎期發(fā)育至成熟蟲(chóng)卵約需11日，雖然臨床上可以使用高效的抗蟲(chóng)藥吡喹酮?dú)⑾x(chóng)治療，但吡喹酮只能殺滅3d以上的童蟲(chóng)、成蟲(chóng)，而肝臟內(nèi)的未成熟蟲(chóng)卵仍可繼續(xù)發(fā)育，并引起組織內(nèi)蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)，目前血吸蟲(chóng)性肝纖維化研究的重點(diǎn)在于對(duì)已經(jīng)形成的纖維化的治療，尚無(wú)針對(duì)吡喹酮?dú)⑾x(chóng)后由未成熟蟲(chóng)卵引起的肉芽腫反應(yīng)的治療方法。且血吸蟲(chóng)病患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多已轉(zhuǎn)為慢性，體內(nèi)早已形成肉芽腫或肝纖維化，殺蟲(chóng)后病人依然有晚期轉(zhuǎn)化的可能，蟲(chóng)卵等抗原的免疫病理反應(yīng)并不因殺蟲(chóng)治療而終止。因此，在血吸蟲(chóng)病患者殺蟲(chóng)化療后，如何有效應(yīng)對(duì)那些已經(jīng)沉積在肝內(nèi)的蟲(chóng)卵尤其是未成熟蟲(chóng)卵所產(chǎn)生的免疫病理反應(yīng)而導(dǎo)致的肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展則成為當(dāng)務(wù)之急。現(xiàn)已證實(shí)，細(xì)胞免疫和體液免疫均參與日本血吸蟲(chóng)病性肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展， 并以細(xì)胞免疫為主。肝纖維化的主要病理改變?yōu)檠x(chóng)卵抗原的持續(xù)刺激引起TH2型反應(yīng)持續(xù)存在，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞異常激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并大量增殖，產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)超過(guò)了機(jī)體的降解能力，致使ECM在肝內(nèi)過(guò)量沉積。在肝肉芽腫、纖維化形成過(guò)程中，THZffl2極化及其免疫調(diào)節(jié)起到非常重要的作用。現(xiàn)已普遍認(rèn)為T(mén)H1類細(xì)胞因子可以抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成。TH1類細(xì)胞因子中與抗纖維化作用相關(guān)主要有IFN-y、IL-12、IL-18。IL-18又名IFN-γ誘導(dǎo)因子，能強(qiáng)烈誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ。Feng Wei等將含小鼠IL-18的質(zhì)粒pVAX/IL-18與含日本血吸蟲(chóng)14kDa脂肪酸結(jié)合蛋白(SjFABP)的質(zhì)粒pVAX/SjFABP、含日本血吸蟲(chóng)^kDa谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(SB6GST) 的質(zhì)粒pVAX/Sj26GST聯(lián)合免疫小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合注射pVAX/IL_18組均顯著增加了 IFN- γ和IL-2產(chǎn)物，指示著IL-18能加強(qiáng)Th-I優(yōu)勢(shì)性免疫反應(yīng)。^iang等將IL-18基因修飾的肝細(xì)胞經(jīng)脾移植入感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴的小鼠后，發(fā)現(xiàn)IL-2、IFN-Y的表達(dá)水平明顯升高，而IL-4、IL-10表達(dá)水平卻顯著降低，形成典型的Th1型免疫應(yīng)答。感染20周后， 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)羥脯氨酸等表達(dá)水平降低，肝臟I、III型前膠原、羥脯氨酸及膠原含量明顯降低，說(shuō)明IL-18可誘導(dǎo)日本血吸蟲(chóng)感染慢性期從促進(jìn)肉芽腫、肝纖維化形成的Tti2型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化為抗纖維化的Th1型應(yīng)答優(yōu)勢(shì)，提示通過(guò)IL-18調(diào)控ThZft2極化的方向可減輕蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化的反應(yīng)強(qiáng)度，以達(dá)到干預(yù)治療肝纖維化的目的。目前抗纖維化治療著力于消除和抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展，尚無(wú)有效治療能明顯改善或逆轉(zhuǎn)纖維化相關(guān)的炎癥進(jìn)程。TH1細(xì)胞因子能直接抑制成纖維細(xì)胞的膠原合成，說(shuō)明TH1 細(xì)胞因子是一種潛在的抗纖維化治療靶點(diǎn)，其中能明顯改善感染肝臟纖維化且已應(yīng)用于臨床的TH1細(xì)胞因子有IFN- γ。然而傳統(tǒng)的細(xì)胞因子免疫治療是將利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的細(xì)胞因子注入患者體內(nèi)，通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)免疫原局部而起作用，這種治療必需連續(xù)、大劑量用藥，這勢(shì)必導(dǎo)致毒副作用增加及宿主體內(nèi)細(xì)胞因子嚴(yán)重失衡。因此，理想的治療方法是即能有效的利用此類細(xì)胞因子進(jìn)行抗肝纖維化治療，同時(shí)又能將其導(dǎo)致的毒副作用和其它部位正常組織的細(xì)胞因子失衡減至最低。單鏈抗體(single chain Fv antibody, scFv)作為基因工程抗體的一種，是具有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小功能片段，與完整抗體比較，具有更大的優(yōu)越性分子量小，免疫原性低，組織穿透力強(qiáng)，定位迅速，清除快，易于基因工程制備和改造等，目前已有多種單鏈抗體用于腫瘤的臨床檢測(cè)，取得了較滿意的效果。而且已有多個(gè)人源性單鏈抗體獲美國(guó)FDA 的批準(zhǔn)，但目前尚無(wú)單鏈抗體用于血吸蟲(chóng)病治療的報(bào)道。本課題組利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了日本血吸蟲(chóng)未成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原單鏈抗體庫(kù)，集落挖掘法從中篩選得到一株與天然分子候選疫苗SIEA^5-28kDa特異性結(jié)合的scFv，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)可溶性單鏈抗體高效表達(dá)，并將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP) 與特異性SIEA^-28kDa單鏈抗體進(jìn)行融合表達(dá)，通過(guò)對(duì)EGFP的綠色熒光檢測(cè)顯示，特異性單鏈抗體能與未成熟蟲(chóng)卵及雌蟲(chóng)生殖系統(tǒng)特異性結(jié)合，結(jié)合部位主要在未成熟卵卵胚、 雌蟲(chóng)卵黃腺、卵巢及與生殖系統(tǒng)鄰近的腸壁內(nèi)膜，與運(yùn)用親本抗體檢測(cè)結(jié)果相似。Western blotting檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)此scFv蛋白不僅能與SIEA，而且能與成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原(SEA)和成蟲(chóng)抗原(AWA)特異性結(jié)合，說(shuō)明此scFv對(duì)日本血吸蟲(chóng)從雌成蟲(chóng)到未成熟蟲(chóng)卵、成熟蟲(chóng)卵各個(gè)階段都具有高特異性靶向免疫識(shí)別能力。隨后，我們利用高度純化的scFv為探針篩選日本血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)，獲得兩個(gè)編碼SIEA^-28kDa疫苗候選分子的基因，通過(guò)構(gòu)建真核重組質(zhì)粒免疫小鼠，獲得了較好的抗日本血吸蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)效果。證實(shí)了此抗 SIEA26-28kDa的scFv具有潛在應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技術(shù)是當(dāng)今疾病免疫研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。該方法是利用基因工程技術(shù)將兩種或多種具有相同或相關(guān)功能活性但各自作用靶點(diǎn)不同的細(xì)胞因子融合在一起，使融合基因表達(dá)的產(chǎn)物既具有各因子獨(dú)特的生物學(xué)活性或使其某些活性顯著提高，又可能通過(guò)協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮出較單一細(xì)胞因子簡(jiǎn)單配伍所不具備的復(fù)合生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上，將抗體分子的片段與細(xì)胞因子融合，表達(dá)的融合蛋白不但可以保留抗體分子片段與抗原特異性結(jié)合的特性，還具有細(xì)胞因子的多功能免疫學(xué)活性， 從而可借助抗體將細(xì)胞因子導(dǎo)向到特定的靶部位發(fā)揮高效生物學(xué)功能，同時(shí)減輕全身毒副作用。Heuser等構(gòu)建了抗黏蛋白的scFv-Fc-IL-2融合蛋白(C595scFv-Fc-IL_2)，證實(shí)此融合蛋白能同時(shí)特異性地結(jié)合MUCI+的腫瘤細(xì)胞和CD25+的免疫效應(yīng)細(xì)胞。Halin等采用抗纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的scFv L-19與IL-12融合，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用該融合蛋白治療比應(yīng)用等量的IL-12具有更強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)。Helguera等將鼠GM-CSF與HER2抗體融合，觀察到該融合蛋白既保持了與人HER2/neU抗原的特異性結(jié)合能力，同時(shí)也保持了與重組鼠 GM-CSF相似的生物學(xué)活性，在小鼠體內(nèi)能夠明顯抑制表達(dá)HER2/neU的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，能同時(shí)增強(qiáng)Th1和Ttl2型細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化具有有效治療作用的DNA疫苗及其應(yīng)用方法。一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗，以具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體scFv與細(xì)胞因子IL-18DNA融合，轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述的具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體的核苷酸序列為SEQ ID NO :1。所述的DNA疫苗制備如下以具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體scFv和細(xì)胞因子 IL-18DNA為模板，同時(shí)根據(jù)兩個(gè)模板和兩個(gè)模板之間45bp的鏈接片段glycine-rich linker[(GlyJer)3]設(shè)計(jì)特異性引物(含5’或3’酶切位點(diǎn))，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別得到scFv+1 inker和lingker+IL_18DNA，隨后經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增得到scFv和IL-18融合 DNA:scFv-IL18 ；將其轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pVAXl即得。擴(kuò)增scFv+1 inker的引物序列為SEQ ID NO 2 Pl :5，-CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3’SEQ ID NO 3 P2
5 ‘ - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC
CCGTTTGATTTCCA-3‘；擴(kuò)增lingker+IL-18的引物序列為SEQ ID NO 4 P3
5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCG
ATGGCTGCTGAACCAGTAG-3‘SEQ ID NO 5 P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3‘。所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18融合DNA: scFv_IL18的核苷酸序列為SEQ ID NO :6。所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18融合DNA: scFv_IL18的氨基酸序列為SEQ ID NO :7。所述的DNA疫苗可用于制備治療日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化藥物。傳統(tǒng)的細(xì)胞因子免疫治療需要連續(xù)、大劑量的注射，對(duì)人體正常器官損傷較大。因此本發(fā)明旨在利用scFv對(duì)日本血吸蟲(chóng)從雌成蟲(chóng)到未成熟蟲(chóng)卵、成熟蟲(chóng)卵各個(gè)階段均具有高特異性靶向免疫識(shí)別能力的特性，同時(shí)具有抗生殖產(chǎn)卵和卵胚發(fā)育的效果，將該單鏈抗體與對(duì)血吸蟲(chóng)性肝纖維化具有免疫調(diào)理作用的細(xì)胞因子IL-18融合表達(dá)，產(chǎn)生scFv-IL18融合蛋白，借助scFv的靶向和免疫作用，通過(guò)IL-18對(duì)蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化形成的干擾， 誘導(dǎo)日本血吸蟲(chóng)感染慢性期從Tti2型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化為T(mén)h1型優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答，在病灶局部調(diào)控ThZft2極化的方向以減輕蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化的反應(yīng)強(qiáng)度，同時(shí)還能大大降低IL-18 對(duì)其它正常組織器官的毒副作用，達(dá)到增強(qiáng)scFv-IL18治療日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化的效果。


圖1是本發(fā)明全套scFv、IL-18基因的PCR擴(kuò)增圖；圖2是本發(fā)明全套scFv_IL18基因的S0E-PCR擴(kuò)增圖；圖3是本發(fā)明構(gòu)建的真核質(zhì)粒pVAXl/SjscFv-ILlS雙酶切鑒定圖；圖4是本發(fā)明在正常小鼠體內(nèi)表達(dá)后產(chǎn)生的IL-18圖；圖5是本發(fā)明對(duì)日本血吸蟲(chóng)性肝纖維化BALB/c鼠體內(nèi)Thl/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)的影響；圖6是本發(fā)明對(duì)日本血吸蟲(chóng)性肝纖維化BALB/c鼠肝肉芽腫大小和膠原纖維含量的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化治療性DNA疫苗pVAXl/Sj scFv-IL18進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，而不會(huì)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例11、scFv+1 inker 禾口 1 ingker+IL—18 的擴(kuò)增根據(jù)具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體scFv(其氨基酸序列見(jiàn) SEQ ID NO :8)、IL-18基因序列和鏈接片段(Gly4Ser)3]序列設(shè)計(jì)特異性引物，用引物Pl 和 P2 擴(kuò)增 scFv+1 inker [即(Gly4Ser)3],反應(yīng)條件為-MV 預(yù)變性 5min ； 94 °C 50sec, 58°C 30sec,72°C Imin ；共30個(gè)循環(huán)。最后72°C延伸5min。引物P3和P4擴(kuò)增linker [即 (GlyJer) J+IL-18，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ；94°C 50sec,76°C 30sec,72°C Imin ；共 30個(gè)循環(huán)。最后72°C延伸5min。產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物序列如下(下劃線代表酶切位點(diǎn)，粗體部分為加入的連接片段序列)Pl :5，-CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3’ (EcoR I)P2
5 ‘ - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC
CCGTTTGATTTCCA-3‘P3
5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCG
ATGGCTGCTGAACCAGTAG-3‘P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3‘ (XhoI)2、SOE-PCR 擴(kuò)增 scFv_IL18 融合 DNA上述scFv+1 inker和lingker+IL-18片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，純化產(chǎn)物(各50ng)按1 1混合，行SOE-PCR進(jìn)行連接，反應(yīng)條件如下94°C延伸 5min，94°C 50sec,60°C lmin,72°C Imin 30sec，共 10 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 8min。得到scFv-IL18融合DNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。3、真核質(zhì)粒 pVAXl/Sj scFv_IL18 的構(gòu)建從過(guò)夜培養(yǎng)的LB (含Kana終濃度50mg/L)平板上挑取單個(gè)含有pVAXl質(zhì)粒的大腸桿菌菌落(PVAXl質(zhì)粒購(gòu)于hvitrogen公司)，接種于5ml LB/Kana液體培養(yǎng)基，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按Takara公司質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取純化。將scFv_IL18和pVAXl質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，酶切體系如下表所示，37°C酶切4h后，在紫外燈下切下酶切片段，用Takara的瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶
切產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗，其特征在于，以具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體scFv與細(xì)胞因子IL-18DNA融合，轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述的具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體的核苷酸序列為SEQ ID NO=I0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗制備如下以具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體scFv和細(xì)胞因子IL-18DNA為模板，同時(shí)根據(jù)兩個(gè)模板和兩個(gè)模板之間45bp的鏈接片段glycine-rich linker [ (Gly4Ser) 3]設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別得到scFv+1 inker和lingker+IL_18DNA，隨后經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增得到scFv 和IL-18融合DNA:scFv-IL18 ；將其轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pVAXl即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于 擴(kuò)增scFv+1 inker的引物序列為SEQ ID NO 2 Pl 5' -CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3‘ SEQ ID NO 3 P2 5' - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGTTTGATTTCCA-3‘；擴(kuò)增lingker+IL-18的引物序列為 SEQ ID NO 4 P3 5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCGATGGCTGCFGAACCAGTAG-3 SEQ ID NO 5 P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18 融合DNA:scFv-IL18的核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18 融合DNA:scFv-IL18的氨基酸序列為SEQ ID NO :7。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的DNA疫苗的應(yīng)用方法，其特征在于，用于制備治療日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體為一種對(duì)日本血吸蟲(chóng)病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗及其應(yīng)用。利用自行研制的具有免疫靶向和抗血吸蟲(chóng)卵胚作用的單鏈抗體scFv，將其與細(xì)胞因子IL-18融合，利用特異性單鏈抗體的免疫靶向作用和抗血吸蟲(chóng)卵卵胚的作用，結(jié)合IL-18的免疫調(diào)理，增強(qiáng)了對(duì)血吸蟲(chóng)病肝纖維化的治療效果。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102526761SQ20121001131
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者何卓, 馮其梅, 周云飛, 尹鐵球, 張樹(shù)菊, 汪世平, 田智 申請(qǐng)人:中南大學(xué)