專利名稱：Grp75基因在制備治療肝臟纖維化藥物中的用途的制作方法
技術領域：
:本發明屬于分子生物學領域，涉及Grp75基因新的用途，具體涉及應用基因轉染技術Grp75在制備治療肝細胞氧化損傷和肝臟纖維化藥物中的用途。
背景技術：
:肝纖維化是肝臟對各種原因所致肝損傷的創傷愈合反應，表現為肝內結締組織增生與沉積。現代研究表明，常見多發的急，慢性肝病例如病毒型肝炎，脂肪肝，酒精肝等大部分病例在早期均表現為肝纖維化，如果不能及時發現并有效抑制，將可能進一步發展成為肝硬化乃至肝癌，直接危及患者生命。據研究顯示，正常肝細胞損傷被視為激活肝纖維化的最初信號，隨著肝細胞的持續受損，凋亡，肝纖維化將不斷加劇。因此，阻止或者延緩肝纖維化的發生，預期可治愈多數慢性肝病。研究報道，肝細胞的 氧化損傷的發生是肝纖維化的早期的病理過程，肝纖維化是肝臟內纖維結締組織增生導致的慢性疾病，在肝纖維化的病理過程中，肝星形細胞的激活，是其顯著的特征，而肝細胞的氧化損傷和凋亡往往是肝纖維化發生的始動因素。葡萄糖調節蛋白75(簡稱Grp75)是細胞質和線粒體內的一種重要的分子伴侶，在缺糖、輻射等應激條件下，Grp75呈上調表達，以起到保護蛋白質，協助蛋白質(特別是線粒體蛋白質)轉運，提高細胞對應激反應耐受性的作用。Grp75在缺糖損傷時通過減少ROS和脂質過氧化物的產生，以及增加 ATP 水平保護細胞。(YanLIU，WenLIU, XiaodongSONG, JiZU0.Effectof Grp75 over expression on intracellular ATP level, mitochondrialmembranepotential and ROS accumulation following glucose deprivation in PC12cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry 2005, (268):45-51 ；Zuo J,Xia BI,Massa SM,etal.GRP75 is upregulated in ischemic brain.[J].J.Neurochem.1996,67:S33A.)同時GRP75能通過阻止Bax構象改變、延遲Cyt C釋放抑，調控Raf/Mek/Erk途徑等細胞凋亡通路，從而對缺糖等應激造成的細胞凋亡起到抑制作用。P53蛋白的C端312 352氨基酸殘基處具有Grp75結合信號，Grp75與p53發生結合，可抑制p53移位到線粒體和核，繼而分別抑制了 P53介導的線粒體凋亡途徑和轉錄依賴性凋亡途徑。所以Grp75可以通過多種作用機制抑制細胞凋亡，對細胞損傷起到保護作用。(Wadhwa R, Takano S, Kaur K, DeocarisCC, Pereira-Smith 0M, Reddel RR, Kaul SC.Upregulation of mortalin/mthsp70/Grp75contributes to human careinogenesis.1nt J Cancer.2006 Jun 15 ；118 (12):2973-80.)Grp75在心臟、腦、肺、脾等多種組織中有構成性表達，當細胞損傷發生時，伴侶分子Grp75可以應激性上調，起到細胞保護效應，抑制細胞凋亡進程。然而Grp75在肝組織中卻沒有構成性表達(李華，楊增杰，夏蓓莉，左伋.葡萄糖調節蛋白75的表達特性.[J].復旦學報(醫學科學版)，2001,28 (5):382)，如何在肝細胞發生損傷時，我們將GRP75的基因轉入，分別在細胞和整體水平上上使Grp75上調表達，進一步產生其抗氧化損傷作用和抑制肝細胞凋亡的作用已引起有關領域研究者的關注。發明內容:本發明的目的是提供Grp75基因新的用途，具體涉及Grp75基因在制備治療肝臟纖維化藥物中的用途。尤其涉及Grp75對肝細胞的過氧化氫造成的損傷保護作用和Grp75對由CCL4S導的肝纖維化的治療作用。具體的，本發明采用7702細胞進行細胞實驗，通過加入H202 (400umol/ml)的DMED培養基建立肝細胞氧化損傷模型，用MTT法檢測正常組和Grp75上調組在給予氧化損傷的細胞存活率影響；用賴式法檢測AST，ALT等血清學指標，用熒光探針標記ROS和線粒體跨膜電位用熒光顯微鏡觀察其變化；采用以CCL4腹腔注射法制作大鼠肝纖維化模型，將Grp75基因轉入動物，鑒定證實Grp75在肝臟中上調表達，以病理學、組織中線粒體功能(ATP生成、CytoC)和血清中AST, ALT的變化，觀察Grp75對模型動物的治療作用；實驗結果表明，上調Grp75能通過線粒體保護作用，緩解細胞氧化損傷，抑制肝細胞凋亡，從而減緩肝纖維化發展的進程，達到對肝纖維化的治療效果。更具體地本發明的目的通過下述技術方案實現:
1.建立細胞氧化損傷模型，其中包括:7702細胞常規培養；加入H2O2建立7702細胞氧化損傷模型；用MTT比色法鑒定7702細胞H2O2氧化損傷模型；2.Grp75基因轉入7702細胞，其中包括:構建Grp75上調質粒；脂質體轉染法將Grp75基因轉入7702細胞；Western blot檢測細胞內GRP75表達；3.Grp75轉基因保護細胞氧化損傷，其中包括:細胞培養與分組；賴氏法檢測細胞內AST，ALT水平；用熒光探針標法檢測線粒體活性氧(Reactive oxygen species, R0S)的生成；用突光探針標法檢測線粒體膜電位(mitochondria membrane potential, MMP);用蟲突光素酶法檢測細胞內腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate, ATP)；4.動物肝纖維化模型建立，本發明的實施例中優選建立CCL4誘導大鼠肝纖維化模型；5.GRP75轉基因治療大鼠肝纖維化，其中包括:構建Grp75上調質粒；將質粒用轉染試劑轉入大鼠；免疫組化和Western blot觀察GRP75轉入大鼠后的表達量；6.Grp75轉基因治療作用觀察，其中包括:動物肝組織病理切片觀察；AST，ALT等血清學指標檢測；ATP線粒體腺嘌呤核苷三憐酸(adenosine triphophate)檢測；Western blot檢測細胞色素C表達。本發明提供了 Grp75基因在制備治療肝臟纖維化藥物中的用途；尤其是Grp75對肝細胞的過氧化氫造成的損傷保護作用和Grp75對由CCL4誘導的肝纖維化的治療作用。本發明基于Grp75是細胞質和線粒體內的一種重要的分子伴侶，其N端1_23位點為線粒體的穿膜信號，幫助蛋白正確折疊、協助蛋白質的轉運，具有清除R0S、抗細胞凋亡的作用等特性，進行了 Grp75對H2O2誘導的細胞氧化應激的細胞保護作用試驗，和CCL4誘導下的肝纖維化為病理基礎的動物模型的保護作用試驗，在肝細胞發生損傷時，將GRP75的基因轉入，分別在細胞和整體水平上使其上調表達，結果顯示，通過Grp75蛋白的抗氧化損傷作用和抑制肝細胞凋亡的作用可達到治療肝纖維化的效果。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。


:圖1是MTT法檢測正常組細胞，損傷組細胞，Grp75高表達組細胞，Grp75高表達后損傷的細胞各組細胞的細胞活力。圖2是正常組細胞，損傷組細胞，Grp75高表達組細胞，Grp75高表達后損傷的細胞線粒體膜電位的變化。圖3是蛋白質免疫印跡檢測細胞色素C在胞漿中的表達量。圖4是蛋白質免疫印跡法檢測動物轉基因效果。圖5是用免疫組織化學觀察動物轉基因后Grp75表達量。圖6是HE染色觀察四組動物在病理學上的差異。圖7是蛋白質免疫印跡法檢測肝臟細胞色素C的表達差異。圖8是動物肝臟組織線粒體ATP檢測結果。
具體實施方式
:實施例1細胞實驗I細胞氧化損傷模型的建立和鑒定1.1細胞與主要試劑:7702 細胞購自中國科學院細胞，噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT),購自amresco公司，二甲基亞諷(DMSO),購自merck公司，高糖培養基(DMEM)購自invitrogen公司，H2O2購自上海生工。1.2實驗步驟:取對數生長期的7702細胞，制成單細胞懸液，以5X IO4個/ml的細胞密度接種于96孔培養板，每組6個復孔，正常組細胞與GRP75上調組細胞各兩組，200 μ I培養液37°C、5% CO2培養箱中培養12小時后，加入400uM H2O2繼續培養2小時，隨后進行MTT檢測，即棄去細胞培養上清，用培養基洗一次，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)溶液，放回培養箱內繼續培養4小時，吸棄上清后，加150 μ I DMSO溶解沉淀，振蕩10分鐘后，酶標儀上檢測492nm處測定OD值。MTT檢測細胞活率結果顯示:7702細胞在400uM H2O2損傷條件下，活率降低；與對照組相比，Grp75高表達組的細胞活力未有明顯改變，而轉染Grp75的細胞在H2O2損傷后細胞活率明顯較損傷組升高(如圖1所示)，2.Grp75 轉染細胞2.1主要試劑:PCRMIX，凝膠回收試劑盒，質粒小抽試劑盒(天根公司),T4連接酶載體(TAKARA)2.2EGFP-N2/Grp75 表達質粒構建
左邊引物，5‘TAAGGATCCATGATAAGCGCCAGCAGA，3 BamHl
右邊引物’5 ‘GGCGGTACCTTACTGTTTCTCTTCCTTC’ 3 Kpnl帶有BamHl KpnI的限制性內切位點的目的基因PCR擴增弓丨物2.3表達載體質粒擴增、提取與鑒定以實驗室現有的C_myc/Grp75質粒為模板以BamHl，Kpnl為引物進行PCR擴增，反應體系為:Iul 模板IOum BamHl primerIOum Kpnl primer5ul IOX Taq buffer4ul d NTP mix0.5ul TaqddH20 補至 50ul所得產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離提純后保存，將EGFP-N2質粒用BamHl和Kpnl雙酶切，純化產物并回收，將PCR所得Grp75序列用DNA連接酶連入EGFP-N2，隨后將重組后的質粒轉化入感受態細胞中通過藍白斑篩選后，挑取菌落進行測序。2.4Grp75的細胞轉染與鑒定轉染前24小時物在500ul無抗完全培養基中接種0.5-2X105個細胞用50ul的DMEM培養基稀釋0.8ug質粒DNA靜置5分鐘，50ul稀釋2ul LIP2000轉染試劑，混合轉染試劑和質粒DNA稀釋液，靜置20分鐘將轉染復合物加入到24孔板細胞中IOOul/孔，將孔板置于37°C, 5%二氧化碳培養箱中培養18小時,在轉染6小時的時候換新鮮培養基。所得的細胞用0.2mg/mlG418篩選3 5天換篩選液9天后挑取單克隆進行培養。所得細胞提取蛋白進行Western blot鑒定。3.轉入Grp75對細胞氧化損傷保護作用3.1線粒體活性氧檢測3.1.1主要試劑:H2DCFDA(R0S檢測試劑)購自invitrogen公司，高糖培養基(DMEM)購自invitrogen 公司。3.1.2.實驗步驟:取對數生長期的7702細胞，以8X IO5個/ml的細胞密度接種于放有圓形玻片的24孔培養板，每組3個復孔，500 μ I培養液，37°C>5% CO2培養箱中培養12小時后，加入400uMH2O2繼續培養2小時于檢測細胞內ROS。即將24孔板內培養液棄去，用無血清DMEM洗細胞三次，加入500 μ I工作液濃度為IOmM的H2DCFDA, 37°C細胞培養箱內孵育20分鐘。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以488nm激發波長，525nm發射波長，于熒光酶標儀檢測ROS值。熒光法檢測活性氧結果顯示:損傷組ROS的熒光強度，明顯高于正常對照組；而Grp75高表達組經H2O2的作用后，熒光強度比正常組和對照組稍高，而明顯要比損傷組低，這表示Grp75可以有效控制細胞內活性氧的生成。表I是ROS熒光強度檢測結果。
表I
權利要求
1.Grp75基因在制備治療肝臟纖維化藥物中的用途。
2.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝臟纖維化是肝細胞的過氧化氫造成的損傷。
3.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝臟纖維化是由CCL4誘導的肝纖維化。
4.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Grp75的上調改善肝細胞氧化損傷。
5.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Grp75通過調節肝細胞線粒體功能抑制肝 細胞凋亡。
全文摘要
本發明屬分子生物學領域，涉及應用基因轉染技術Grp75在制備治療肝細胞氧化損傷和肝臟纖維化藥物中的用途。本發明基于Grp75是細胞質和線粒體內的一種重要的分子伴侶，其N端1-23位點為線粒體的穿膜信號，幫助蛋白正確折疊、協助蛋白質的轉運，具有清除ROS、抗細胞凋亡的作用等特性，進行了Grp75對H2O2誘導的細胞氧化應激的細胞保護作用試驗，和CCL4誘導下的肝纖維化為病理基礎的動物模型的保護作用試驗，在肝細胞發生損傷時，將GRP75的基因轉入，分別在細胞和整體水平上使其上調表達，結果顯示，通過Grp75蛋白的抗氧化損傷作用和抑制肝細胞凋亡的作用可達到治療肝纖維化的效果。本發明的Grp75基因可制備治療肝臟纖維化藥物。
文檔編號A61K48/00GK103203026SQ20121001141
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者劉雯, 左伋, 鄂裘愷, 劉平 申請人:復旦大學, 上海中醫藥大學