專利名稱：醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用。
背景技術：
隨著社會工業(yè)化和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年升高,死亡率僅次于腫瘤和心血管疾病，成為第三大威脅人類健康的疾病。尤其是在我國，目前糖尿病的發(fā)病率非常高，在成年人達到隨著民眾生活水平的提高，國內糖尿病人群正在快速增長。我國《2010糖尿病專題調查》結果顯示，我國2010年糖尿病患病率，男性為10.24%，女性為9.05%。糖尿病包括I型糖尿病，2型糖尿病，其它特殊類型糖尿病及妊娠期糖尿病,其中，I型糖尿病的治療主要依賴于胰島素治療，而2型糖尿病的治療則又豐富的選擇，但各有其優(yōu)缺點。游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)是生物體的一種重要能量來源，同時也是一種信號分子，具有多種生理作用。FFA的生理功能及其對機體內的營養(yǎng)代謝疾病的調控作用長期以來受到人們的關注，但由于FFA的特異性膜受體一直未被發(fā)現(xiàn)，關于其分子機制的認識無法進一步深入。而最新研究找到并鑒定了 FFA的特異性膜受體，使科學家們重新認識了 FFA在健康人及患者體內發(fā)揮作用的分子機制。游離脂肪酸受體(FFAR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族，而鑒于目前30%以上的藥物靶標都是GPCR，因此開發(fā)基于FFA受體的高親和力的藥物進而治療如糖尿病等的復雜的疾病，將有著很大的應用潛力。短鏈脂肪酸是腸道菌群消化食物過程的產物，而短鏈脂肪酸亦受體屬于游離脂肪酸受體家族。其中，脂肪酸受體2 (FFAR2)又名GPR43，于1997年首次被克隆，但直到2003年之后才被逐漸重視，之后不斷有重要發(fā)現(xiàn)發(fā)表；尤其是2010年，新發(fā)表論文數(shù)量和質量都是歷年之最，足見目前FFAR2的研究已成為國際上一個新的研究熱點。文獻查閱發(fā)現(xiàn)FFAR2在腸道、胃、骨髓、脾臟、外周血單個核細胞、脂肪等組織均有表達，而在免疫相關組織、腸道、脂肪組織中表達較高，因此目前其研究主要集中在免疫、腸炎、脂肪分化領域。文獻報道，短鏈脂肪酸(Short Chain Fatty Acids, SCFAs)均能一定程度上結合FFAR2并激活下游信號通路但親和力有明顯差異，具體順序為親和力C2 = C3 > C4 > C5 = C6 (數(shù)字代表短鏈脂肪酸中碳原子數(shù))，而長鏈脂肪酸則不能激活其下游信號通路。在炎癥相關研究方面，文獻報道在硫酸葡聚糖(Dextran sulphate sodium, DSS)誘導的腸炎模型中，通過在造模小鼠飲水中添加FFAR2激動劑醋酸鈉(Sodium Acetate)能夠顯著抑制腸道炎癥反應，并緩解腸道損傷指數(shù)。而FFAR2基因敲除小鼠中，醋酸鈉處理并不能夠顯著緩解DSS誘導的腸炎。上述發(fā)現(xiàn)提示FFAR2與SCFA的相互作用可能將食物、胃腸道微生物代謝、免疫系統(tǒng)及炎癥反應在分子機制上的相互作用聯(lián)系起來，并發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。在脂肪相關研究方面，文獻報道FFAR2與脂肪細胞分化有密切聯(lián)系，但在不同實驗條件下對高脂喂養(yǎng)及自發(fā)性肥胖動物模型的脂肪含量具有不同的調節(jié)作用。上述研究表明，F(xiàn)FAR2在正常及肥胖狀態(tài)下對脂肪細胞 分化及脂肪酸代謝的調節(jié)具有不同的特點，其具體機制還需要進一步深入研究。然而，上述研究雖然對FFAR2的功能有重要的提示作用，但是有關FFAR2的功能及其作用的分子機制方面還有很多有待探索之處。鑒于FFAR2可能發(fā)揮著重要的生理功能，尤其是對炎癥反應及糖代謝的調節(jié)作用，我們利用文獻中報道的FFAR2的配體-醋酸鹽，在糖尿病小鼠模型中通過醋酸鹽激活FFAR2信號通路，進而發(fā)現(xiàn)醋酸鹽對糖尿病小鼠模型具有顯著的改善作用。當前我國糖尿病的治療已經有豐富的臨床用藥，如各種短效、中效、長效胰島素，
二甲雙胍，羅格列酮，格列美脲，艾塞那肽等。而醋酸鹽是人體代謝及腸道菌群代謝的產物之一，但是在人體血液中濃度較低。醋酸鹽(分子式為C00-，分子量為59.05)由于其為人體正常代謝產物，且化學成分簡單，毒性低，便于吸收，因此醋酸鹽對糖尿病的保護作用，可以利用其作為糖尿病治療的輔助藥物，可以減少其它臨床用藥的用量，并減輕對其他臨床用藥的依賴性，對改善目前糖尿病患者的用藥顯著具有一定的促進作用，具有非常重要的社會意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用。一種改善糖尿病藥物，該藥物中含有醋酸鹽。所述醋酸鹽為堿金屬醋酸鹽中的一種或幾種的任意組合。所述醋酸鹽為醋酸鈉。所述藥物的劑型為片劑、膠囊、注射劑的一種。醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用。所述醋酸鹽為堿金屬醋酸鹽中的一種或幾種的任意組合。所述醋酸鹽為醋酸鈉。本發(fā)明利用小劑量多次鏈脲菌素注射引發(fā)的糖尿病小鼠模型(Mult1-Low Doseof Streptozocin模型，MLDS),首次揭示醋酸鹽處理可以顯著抑制MLDS引起的小鼠隨機血糖的升高，顯著改善MLDS引起的小鼠糖耐量的異常，顯著增加MLDS處理后小鼠血清中胰島素的含量，并顯著抑制MLDS引起的小鼠脾臟中炎癥因子的表達；本發(fā)明的實驗結果表明，醋酸鹽在臨床上對糖尿病具有一定的改善作用。


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圖1:MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠隨機血糖的曲線圖。圖2:MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠的糖耐量的曲線圖。圖3: MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠的糖耐量實驗中血糖的曲線下面積。圖4: MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠在外源胰島素注射條件下的血糖的曲線圖。圖5:MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠在進食狀態(tài)下血清中的胰島素含量曲線圖。圖6: MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠脾臟中炎癥因子IL_6在mRNA水平的表達的曲線圖。
具體實施方式
:下面結合具體實施方式
，詳細描述本發(fā)明。應理解，這些實施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用，醋酸鹽用于改善糖尿病，醋酸鹽可抑制血糖的升高，改善糖耐量的異常，增加血清中胰島素的含量，并可抑制脾臟中炎癥因子的表達，所述醋酸鹽為堿金屬醋酸鹽，如醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銫中的一種或幾種的任意組合，本實施例以醋酸鈉為例研究醋酸鹽的用途。本發(fā)明的下列實驗顯示了醋酸鹽在多次小劑量鏈脲菌素注射誘發(fā)的糖尿病模型中，對糖尿病有明顯的保護作用。1、為了觀察醋酸鹽對于鏈脲菌素誘發(fā)的小鼠糖尿病的改善作用，我們通過給小鼠腹腔注射50mg/kg鏈脲菌素，并連續(xù)5天注射，造成小鼠因胰島P細胞損傷誘發(fā)的糖尿病模型(即MLDS模型)。實施例1: (1),選擇6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠共42只(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)。標準飲食，適應性喂養(yǎng)I周后，分為4組，分別為生理鹽水溶劑組(Vehicle，共6只，分2籠，每籠三只)，單純醋酸鹽組(Acetate，共6只，分2籠，每籠三只)，模型組(MLDS+Vehicle，共15只，分5籠，每籠三只)，模型醋酸鹽處理組(MLDS+Acetate，共15只，分5籠，每籠三只)。(2)，在MLDS模型造模前三天，給藥組通過腹腔注射500mg/Kg醋酸鈉，200ul每只。在第三天注射醋酸鈉2h后，腹腔注射左脲菌素(50mg/kg，用檸檬酸緩沖液，10mmol/L，PH值4.5);用同樣方法，連續(xù)注射醋酸鈉與左脲菌素處理5天。(3)，連續(xù)注射左脲菌素5天后，各組單獨給予溶劑或者醋酸鹽處理。期間，在對應時間點，通過刀片取小鼠尾端靜脈血，于上午9:0(T10:00用強生公司Life Scan快速血糖儀檢測血糖濃度并記錄隨機血糖，如圖1所示，為隨機血糖隨時間變化的曲線圖。結果如圖1所示，單純醋酸鹽處理組隨機血糖水平與對照組沒有顯著差異，而單純模型組(鏈脲菌素處理)小鼠隨機血糖與對照組相比顯著升高，同時，給予醋酸鹽處理的模型組，隨機血糖水平與單純模型組相比顯著降低，上述結果顯示醋酸鹽處理的糖尿病小鼠模型隨機血糖狀態(tài)有顯著改善。2、本發(fā)明通過給MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠糖耐量進行研究，各組小鼠進行腹腔注射葡萄糖耐量實驗(IPGTT)。實施例2:腹腔葡萄糖耐量試驗，于實驗前天下午6:00撤食，實驗當天8:00開始，刀片切尾靜脈，用強生Life Scan快速血糖儀測各點血糖，葡萄糖耐量實驗用濃度20%(m/v)的2g/Kg葡萄糖溶于生理鹽水，并腹腔注射，分別于注射前(Omin)，注射后15min、30min、60min、90min和120min測血糖,測得其血糖隨時間變化的曲線。如圖2所示，單純醋酸鹽處理組葡萄糖負荷后，血糖水平與對照組沒有顯著差異(未在結果中顯示)，而單純模型組(鏈脲菌素處理)小鼠葡萄糖負荷后，血糖與對照組相比顯著升高。同時，給予醋酸鹽處理的模型組，葡萄糖負荷后，血糖水平與單純模型組相比顯著降低。上述結果顯示醋酸鹽處理的糖尿病小鼠模型葡萄糖耐受有顯著的改善作用。經對葡萄糖負荷后，計算了單純模型組與醋酸鹽處理的模型組葡萄糖曲線下面積，如圖3所示，其為本發(fā)明的MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠的糖耐量實驗中血糖的曲線下面積，各組小鼠血糖曲線下面積用軟件GraphPad Prism計算,各組間統(tǒng)計學分析亦用GraphPad Prism計算,*/ <%仍；醋酸鹽處理組葡萄糖曲線下面積顯著低于單純模型組。結果顯示，醋酸鹽處理能夠顯著改善MLDS誘導的糖尿病小鼠模型的葡萄糖耐量。3、為了觀察醋酸鹽對于鏈脲菌素誘發(fā)的小鼠糖尿病改善作用的機理，通過給各組小鼠進行腹腔胰島素耐量試驗(ITT)。如圖4所示，其為本發(fā)明的MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠在外源胰島素注射條件下的血糖的曲線圖。實施例3:胰島素耐量試驗，于實驗當天上午8:00撤食，實驗當天下午2:00開始，刀片切尾靜脈，用強生Life Scan快速血糖儀測各點血糖，胰島素耐量實驗用濃度0.75U/Kg的胰島素溶于生理鹽水(胰島素Humulin購自禮來公司)，并腹腔注射，分別于注射前(Omin),注射后 15min、30min、60min、90min 和 120min 測血糖。圖4中胰島素耐量實驗中各組小鼠血糖的統(tǒng)計學分析亦用GraphPad Prism計算， <0.05，***p〈0.0Olo如圖4所示，單純醋酸鹽處理組葡萄糖負荷后，血糖水平與對照組沒有顯著差異(未在結果中顯示)，而單純模型組(鏈脲菌素處理)小鼠葡萄糖負荷后，血糖與對照組相比顯著升高。同時，給予醋酸鹽處理的模型組，葡萄糖負荷后，血糖水平與單純模型組相比顯著降低。但經過對每組小鼠的Omin血糖的歸一化處理，發(fā)現(xiàn)醋酸鹽處理后，模型組小鼠的胰島素敏感性與單純模型組相比，沒有顯著變化。上述結果顯示醋酸鹽處理的糖尿病小鼠模型胰島素敏感性沒有顯著的影響，但對小鼠在未進食狀態(tài)下的血糖具有顯著的改善作用。結果顯示，醋酸鹽處理能夠顯著降低MLDS誘導的糖尿病小鼠在未進食狀態(tài)下的血糖水平。如圖5所示，其為本發(fā)明的MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠在進食狀態(tài)下血清中的胰島素含量曲線圖。實施例4:⑴小鼠給與溶劑或者醋酸鹽處理4周后，于實驗當天10:00用Iml —次性無菌注射器自眼眶靜脈叢取血，約200ul每只小鼠。(2)，小鼠全血(無抗凝劑)于4°C冰箱放置I小時后，4°C離心IOOOg 10分鐘，取血清檢測血清中Insulin含量。(3)，Insulin檢測用酶聯(lián)免疫吸附法測，試劑盒采購自R&D公司小鼠Insulin ELISA試劑盒，實驗操作完全按照試劑盒說明進行。(4)，圖5中各組小鼠血清中胰島素含量的統(tǒng)計學分析亦用 GraphPad Prism 計算，<0.05。結果如圖5所示，單純模型組(鏈脲菌素處理)小鼠血清中胰島素水平與對照組相比顯著降低，表明小鼠胰島P細胞受到了一定程度的損害，而給予醋酸鹽處理的模型組，血清中胰島素水平與單純模型組相比顯著增加。上述結果顯示，在進食狀態(tài)下，醋酸鹽處理能夠對MLDS誘導的糖尿病小鼠的胰島^細胞的損傷具有一定的保護作用。6、為了觀察醋酸鹽對于鏈脲菌素誘發(fā)的小鼠糖尿病改善作用的機理，研究小鼠脾臟中炎癥因子IL-6在mRNA水平的表達。如圖6所示，其為本發(fā)明的MLDS誘導的糖尿病小鼠模型中小鼠脾臟中炎癥因子IL-6在mRNA水平的表達的曲線圖。各組小鼠脾臟，因為脾臟中有大量的免疫細胞。通過實時定量PCR檢測脾臟中炎癥因子的表達情況。實施例5: (I)， 用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，開腹，迅速取出小鼠脾臟，并迅速置于液氮罐中待用。(2)，從液氮容器中取小鼠脾臟，每只小鼠取脾臟約5mg，與TRIzoI中剪碎(TRIzol購自Invitrogen公司),并與勻衆(zhòng)儀中搗碎。(3),脾臟組織榮勻衆(zhòng)通過常規(guī)的總RNA抽提方法(TRIzol提供方法),并用逆轉錄試劑盒得到cDNA (Promega公司產品)。(4),用SYBR green檢測試劑盒Real-Time PCR檢測組織中相關基因含量(TAKARA公司產品)。
(5),圖6中各組小鼠血清中胰島素含量的統(tǒng)計學分析亦用GraphPad Prism計算,05。如圖6所示，單純醋酸鹽處理組脾臟中IL-6的mRNA表達水平與對照組沒有顯著差異，而單純模型組(鏈脲菌素處理)小鼠脾臟中IL-6的mRNA表達水平與對照組相比顯著升高。同時，給予醋酸鹽處理的模型組，小鼠脾臟中IL-6的mRNA表達水平與單純模型組相比顯著降低。上述結果顯示醋酸鹽處理對糖尿病小鼠脾臟中的炎癥狀態(tài)有顯著改善作用。本發(fā)明顯示了醋酸鹽對低劑量多次鏈脲菌素注射誘發(fā)糖尿病小鼠模型糖尿病的改善作用。本發(fā)明還公開一種改善糖尿病藥物，該藥物中含有醋酸鹽，所述醋酸鹽為堿金屬醋酸鹽中的一種或幾種的任意組合，其劑型為片劑、膠囊、注射劑的一種。醋酸鹽是人體正常的代謝產物，具有成本低，副作用小等特點，具有很好的輔助治療糖尿病的應用潛力。參考目前動物模型上的結果，推薦應用成人每天2次，20mg/kg次的
劑 量。
權利要求
1.一種改善糖尿病藥物，其特征在于，該藥物中含有醋酸鹽。
2.根據(jù)權利要求1所述的改善糖尿病藥物，其特征在于，所述醋酸鹽為堿金屬醋酸鹽中的一種或幾種的任意組合。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的改善糖尿病藥物，其特征在于，所述醋酸鹽為醋酸鈉。
4.根據(jù)權利要求1所述的改善糖尿病藥物，其特征在于，所述藥物的劑型為片劑、膠囊、注射劑的一種。
5.醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用，其特征在于，所述醋酸鹽為堿金屬醋酸鹽中的一種或幾種的任意組合。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用，其特征在于，所述醋酸鹽為 醋酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開醋酸鹽在制備改善糖尿病藥物中的應用。利用小劑量多次鏈脲菌素注射引發(fā)的糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)醋酸鹽處理可以顯著抑制MLDS引起的小鼠隨機血糖的升高，顯著改善MLDS引起的小鼠糖耐量的異常，顯著增加MLDS處理后小鼠血清中胰島素的含量，并顯著抑制MLDS引起的小鼠脾臟中炎癥因子的表達。本發(fā)明首次提供了醋酸鹽用于治療MLDS誘發(fā)的糖尿病在動物模型上的證據(jù)，提示醋酸鹽可能在臨床上對糖尿病具有一定的改善作用。
文檔編號A61K31/185GK103211804SQ201210018250
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權日2012年1月20日
發(fā)明者寧光, 石國軍, 顧衛(wèi)瓊, 楊明蘭, 章曉芳 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院