本發明涉及細胞因子的用途技術領域，尤其涉及重組的人源IL-17在制備藥物中的用途。

背景技術：

器官移植是治療器官功能衰竭的一種有效治療方案，但是人類器官供體的缺少是其主要限制。由于病理學、解剖學、經濟學和倫理學方面的因素，豬被認為是解決器官缺乏的一個最適宜的供體來源。但是，免疫排斥反應是異種移植的主要障礙。促炎細胞因子在細胞免疫反應中起重要的作用，所以我們推測一些促炎細胞因子在異種移植中有重要的病理學作用。然而，這些細胞因子在異種移植中的作用仍然不清楚。

在炎癥反應、凝血反應和細胞存活或者死亡中，內皮細胞具有重要調節作用。內皮細胞功能性紊亂與多種疾病有關，例如，腫瘤轉移、動脈硬化和持久的慢性炎癥。由于內皮細胞是被免疫細胞最先識別的，所以它們是最重要的一道防御線。在異種移植中，它們在炎癥反應和凝血反應中具有重要作用的細胞。同時它們在同種和異種移植損傷中具有關鍵性的作用，作為異種移植研究領域中的相關研究的主要靶細胞。

在異種移植的反應過程中，會產生許多促炎細胞因子。在豬-人的器官移植過程中，人源細胞因子是否能夠刺激來自豬供體的細胞或者器官是一個需要弄清楚的問題。在各種異種移植的模型中，包括豬－狒狒的模型中，其他一些重要的細胞因子，例如白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素(IL-17)和白細胞介素-1β(IL-1β)的表達量也有所增加。這些細胞因子的生物學功能和它們的促炎反應在各種生理學中作用也都已經報到了。可是這些促炎細胞因子在異種移植中的效果仍然不清楚。

技術實現要素：

為了弄清上述促炎細胞因子在異種移植中的效果，我們用這些細胞因子去刺激豬主動脈內皮細胞(PAEC)。我們檢測了一些信號通路的激活情況和下游基因的表達，例如粘附分子(內皮細胞選擇素(E-selectin)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1))，趨化因子(白細胞介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1))，促炎因子(IL-6)和促凝血反應有關的基因(組織因子)。并且對豬白細胞抗原I(SLA-I)和豬白細胞抗原II(SLA-II DR)也進行檢測。

發明人發現人源的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα以不同的通路激活豬內皮細胞。在豬主動脈內皮細胞，人源的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα與來源于豬的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα作用效果一致。人源的細胞因子rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα可以誘導粘附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)、趨化因子(IL-8和MCP-1)、促炎因子(IL-6)和促凝血反應有關的基因(組織因子)的表達，而人源的細胞因子rhIL-6可以增加趨化因子MCP-1和促凝血因子(組織因子)的表達。人源的細胞因子rhIL-1β和rhTNFα可以上調表達豬白細胞抗原I(SLA-I)而人源的細胞因子rhIL-17或rhIL-6都不能。雖然人源的細胞因子rhIL-17不能使E-selectin、VCAM-1、ICAM-1、IL-8、MCP-1、IL-6和組織因子的表達量增加很多，但是它與人源的細胞因子rhTNFα的協同作用下，顯著增加E-selectin、IL-6和IL-8的表達量。另外，在豬主動脈內皮細胞中，托珠單抗(tocilizumab)不能阻止由人源的IL-6激活的STAT3信號通路。發明人認為人源的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα在異種移植中具有重要的病理學作用，能夠成為潛在的治療靶點。并且人源的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα可以作為激活相關信號通路、誘導或上調相關基因表達的活性分子。進而，這些人源的細胞因子可以作為制備相關藥物的活性成分。相關藥物可以是包括人源的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β或TNFα作為活性成分，以及任選地藥物載體——例如水等溶劑的藥物組合物。

基于以上發現，本發明提供一種重組的人源IL-17在制備藥物中的用途。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種重組的人源IL-17在制備激活豬內皮細胞中NF-κB和MAPKs信號通路的藥物中的用途。

根據本發明的第二方面，本發明提供一種重組的人源IL-17在制備上調豬內皮細胞中粘附分子表達的藥物中的用途。

進一步地，上述粘附分子包括內皮細胞選擇素(E-selectin)、VCAM-1和ICAM-1。

根據本發明的第三方面，本發明提供一種重組的人源IL-17在制備上調豬內皮細胞中IL-6表達的藥物中的用途。

根據本發明的第四方面，本發明提供一種重組的人源IL-17在制備誘導豬內皮細胞中趨化因子表達的藥物中的用途。

進一步地，上述趨化因子是IL-8。

進一步地，上述趨化因子是單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)。

根據本發明的第五方面，本發明提供一種重組的人源IL-17在制備上調豬內皮細胞中組織因子表達的藥物中的用途。

根據本發明的第六方面，本發明提供一種重組的人源IL-17和TNFα通過協同效應在制備上調豬內皮細胞中內皮細胞選擇素、IL-8或IL-6表達的藥物中的用途。

進一步地，上述豬內皮細胞是豬主動脈內皮細胞。

本發明發現重組的人源IL-17能夠激活豬內皮細胞中NF-κB和MAPKs信號通路、上調豬內皮細胞中粘附分子、IL-6和組織因子表達以及誘導豬內皮細胞中趨化因子表達，因此重組的人源IL-17可以作為實現這些功能的藥物的活性成分。

附圖說明

圖1顯示在PAEC中，IL-17、IL-1β和TNFα激活NF-κB和MAPK，而IL-6激活STAT3。(A)將PAEC暴露于rpIL-6(20ng/ml)或rhIL-6(20ng/ml)(指定的時間)，并將HUVEC暴露于rhIL-6(20ng/ml)(指定的時間)。裂解物通過針對p-STAT3、STAT3、p-AKT和肌動蛋白的抗體進行免疫印跡分析。p-STAT3和p-AKT的定量分析顯示在右側。(B)將PAEC暴露于rpIFNγ(40ng/ml)或rhIFNγ(40ng/ml)，將HUVEC暴露于rhIFNγ(40ng/ml)。裂解物通過針對p-STAT1、STAT1和肌動蛋白的抗體進行免疫印跡分析。p-STAT1的定量分析顯示在右側。(C-E)將PAEC暴露于rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)(C)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)，rpTNFα(100ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)(E)，HUVEC暴露于rhIL-17(100ng/ml)(C)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)或rhTNFα(20ng/ml)(E)。通過用所示抗體免疫印跡分析裂解物。p-P65、p-IκBα、p-P38和p-JNK的定量分析顯示在右側。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖2顯示在PAEC中，IL-17、IL-1β和TNFα增加粘附分子和促炎細胞因子IL-6的表達。PAEC不作處理或者使用rpIL-6(20ng/ml)或rhIL-6(20ng/ml)(A)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)(B)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)(C)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)(E)處理2、6或12小時。通過實時PCR檢測E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖3顯示在HUVEC中粘附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)和IL-6被人IL-6、IFNγ、IL-1β和TNFα誘導。HUVEC不作處理或者使用rhIL-6(20ng/ml)(A)，rhIFNγ(40ng/ml)(B)，rhIL-17(100ng/ml)(C)，rhIL-1β(20ng/ml)(D)或rhTNFα(20ng/ml)(E)處理2、6或12小時。通過RT-PCR分析E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖4顯示在PAEC中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα誘導IL-8和MCP-1的表達。(A-B)PAEC不作處理或者使用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過實時PCR檢測IL-8(A)或MCP-1(B)的mRNA水平。(C-D)PAEC不作處理或者使用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理24小時，其中直方柱從左到右依次對應右側的分子。通過ELISA測量上清液中豬IL-8(C)或MCP-1(D)的蛋白水平。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖5顯示在HUVEC中，人IL-6、IFNγ、IL-17、IL-1β和TNFα調節IL-8和MCP-1的mRNA水平。(A-B)HUVEC不作處理或者使用rhIL-6(20ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過RT-PCR分析IL-8(A)和MCP-1(B)的mRNA水平。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖6顯示在PAEC中，組織因子的mRNA水平由IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα誘導。PAEC未經處理或用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過實時PCR檢測組織因子的mRNA水平。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖7顯示人IL-6、IL-1β和TNFα誘導HUVEC中組織因子的表達。HUVEC未經處理或用rhIL-6(20ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理2、6或12小時。通過RT-PCR分析組織因子的mRNA水平。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，**p<0.01,***p<0.001。

圖8顯示在用IL-1β和TNFα處理的PAEC中，SLA-1，而不是SLA-II DR增加。(A-B)PAEC未經處理或用rpIL-6(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rpIFNγ(40ng/ml)，rhIFNγ(40ng/ml)，rpIL-17(100ng/ml)，rhIL-17(100ng/ml)，rpIL-1β(20ng/ml)，rhIL-1β(20ng/ml)，rpTNFα(20ng/ml)或rhTNFα(20ng/ml)處理24小時，其中直方柱從左到右依次對應右側的分子。通過流式細胞儀檢測SLA-I(A)或SLA-II DR(B)的表達。通過幾何平均熒光強度(Gmean)評價SLA-1或SLA-II DR與PAEC結合的程度。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，***p<0.001。

圖9顯示在PAEC中IL-17和TNFα協同誘導E-selectin、IL-6和IL-8表達。PAEC用rhIL-17(100ng/ml)，rhTNFα(2ng/ml)或rhIL-17+rhTNFα處理0、2或6小時的PAEC。通過實時PCR檢測E-selectin、VCAM-1、ICAM-1、IL-6、IL-8、MCP-1或組織因子mRNA的誘導。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。其中直方柱從左到右依次對應右側的分子。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖10顯示在PAEC中，托珠單抗不抑制IL-6誘導的STAT3活化。(A-B)PAEC或HUVEC用低濃度(100ng/ml)(A)或高濃度(500ng/ml)(B)托珠單抗預處理30分鐘或不處理，然后PAEC用rpIL-6(20ng/ml)或rhIL-6(20ng/ml)處理0、15或30分鐘，HUVEC用rhIL-6(20ng/ml)處理0、15或30分鐘。裂解物使用針對p-STAT3和STAT3的抗體通過蛋白質印跡分析。p-STAT3的定量分析顯示在圖像下。數據代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具體實施方式

下面通過具體實驗結合附圖對本發明作進一步詳細說明。

1.實驗材料

1.1實驗儀器

37℃CO₂細胞培養箱(Heraus)

超凈工作臺(蘇凈集團安森公司)

細胞/顆粒計數儀(BECKMAN COULTER)

熒光顯微鏡(Carl ZEISS)

蛋白電泳儀(BIO-RAD)

流式細胞儀(BD)

常溫和冷凍離心機(Eppendorf)

純水裝置(Millipore)

超低溫冰箱(Haier)

搖床(Thermo Fisher)

實時定量PCR儀(ABI 7900)

自動沖片機(Danaford ML 400)

真空泵(上海精宏)

1.2原代細胞和細胞系

實驗中主要用到兩種細胞原代豬主動脈內皮細胞(PAECs)和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，其中PAECs由中國野生型五指山小型豬主動脈分離而得。

1.3細胞因子和抗體

重組人的IL-17、重組人和豬的IL-6、IFNγ、IL-1β及TNFα均購自美國R&D Systems公司。重組豬的IL-17購自美國Kingfisher Biotech Inc公司。pP65、P65、p-IκBα、IκBα、p-JNK、JNK、P38、p-P38、p-STAT1、STAT1、p-STAT3、STAT3和β-Actin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。FITC-標記的SLA class I(SLA-I)和SLA class II DR(SLA-II DR)抗體均購自美國Bio-rad公司。豬的IL-8ELISA試劑盒購自美國Abcam公司(Cambridge,MA,USA)。豬的MCP-1ELISA試劑盒購自RayBiotech Inc(Norcross,GA,USA)。

本發明中，相關細胞因子或蛋白的英文縮寫前面的符號的含義說明如下：r一般是指重組，例如rhIL-17表示重組的人源IL-17；h一般是指人源，例如rhIL-17表示重組的IL-17是人源的；p一般是指豬源，例如rpIL-17表示重組的豬源IL-17。英文縮寫IFN表示干擾素，例如IFNγ表示γ干擾素；TNF表示腫瘤壞死因子，例如TNFα表示腫瘤壞死因子α。

1.4其它試劑

Tocilizumab購自美國Genentech公司。內皮細胞培養基(ECM)、胎牛血清(FBS,Cat.No.0025)、青霉素/鏈霉素溶液(P/S，Cat.No.0503)以及內皮細胞生長添加劑(ECGS,Cat.No.1052)均購自美國Sciencell公司。蛋白酶抑制劑Cocktail購自Roche公司。TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺和過硫酸氨均購自Sigma-Aldrich公司。100×青霉素-鏈霉素濃縮液和非必需氨基酸購自Gibco公司。胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。RPMI-1640、DMEM培養基購自Gibco公司。TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司。0.45um硝酸纖維素膜(PVDF)購買自Millipore公司。胰酶Trypsin(EDTA)購自Gibco公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。磷酸緩沖液(phosphate bufferd saline,PBS)購自Hyclone公司。ECL反應試劑盒購自Millipore公司。異丙醇、甲醇、三氯甲烷購自國藥集團化學試劑有限公司。苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)購自Sigma公司。DEPC購自上海生工公司。

2.實驗方法

2.1細胞培養

實驗中培養的細胞系用含10％胎牛血清、1％P/S和1％ECGS的ECM培養基。溫度37℃及5％二氧化碳飽和濕度。

2.2蛋白免疫印跡

采用冷的PBS(磷酸鹽緩沖液，phosphate-buffered saline)清洗PAECs和HUVECs細胞后收集細胞，用含10mM NaF,1mM Na₃VO₄,1mM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細胞30min，采用10％SDS-PAGE凝膠分離蛋白。分離蛋白后進行轉膜，將蛋白轉至PVDF膜(美國Millipore公司)，然后用含5％脫脂牛奶及0.1％Tween 20的TBST(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.6)溶液室溫下封閉1h。封閉后清洗PDVF膜，加入一抗在4℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗，在室溫下孵育1h，用增強的化學發光(ECL)檢測試劑(美國Millipore公司)顯影。采用ImageJ軟件計算總蛋白和actin條帶灰度，磷酸化蛋白的表達水平以相對灰度值表示。

2.3熒光實時定量PCR

采用(美國Invitrogen)試劑提取PAECs和HUVECs的總RNA，用500ngRNA和Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA樣品。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(中國大連Takara公司)。檢測E-selectin,VCAM-1,ICAM-1,IL-6,IL-8,MCP-1及tissue factor的水平。這些基因的表達以均以GAPDH作為內參，以2^-ΔΔCt方法計算。在ViiA 7Real-Time PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上進行cDNA的擴增，核苷酸引物的序列如表1所示。PCR條件為：95℃，1min；95℃，10s，60℃，34s 40個循環；95℃15s,60℃15s,95℃15s。

表1

2.4酶聯免疫吸附實驗(ELISA)

分別采用rpIL-6(20ng/ml)、rhIL-6(20ng/ml)、rpIFNγ(40ng/ml)、rhIFNγ(40ng/ml)、rpIL-17(100ng/ml)、rhIL-17(100ng/ml)、rpIL-1β(20ng/ml)、rhIL-1β(20ng/ml)、rpTNFα(20ng/ml)及rhTNFα(20ng/ml)刺激PAEC 24h后，收集細胞上清液，用pIL-8、pMCP-1ELISA試劑盒檢測細胞上清液中豬的IL-8(pIL-8)和MCP-1(pMCP-1)蛋白濃度。

2.5流式細胞術

收集PAECs并用PBS清洗一次，取1×10⁶個細胞用100μl含1％BSA的PBS溶液重懸，用FITC標記的SLA-I及SLA-II DR抗體進行染色，同種型匹配(Isotype-matched)抗體作為陰性對照，在4℃避光條件下孵育30min。用PBS清洗一次，用100μl含1％BSA的PBS溶液重懸細胞后，用BD流式細胞儀進行檢測，SLA-I、SLA-II與PAECs的結合程度以幾何平均熒光強度表示。

2.6統計學分析

展示的數據是平均值(Mean)，誤差范圍是標準差(SEM)。不同組間的差異用雙尾Student’s t test進行分析。P值小于0.05的視為統計學顯著差異。

3.實驗結果

3.1.在PAECs中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα激活了不同的信號通路

人源IL-17、IL-1β和TNFα主要激活NF-κB和MAPKs信號通路，人源IL-6和IFNγ則分別激活STAT3和STAT1通路。然而，這些人源的細胞因子在PAECs中能激活哪些信號通路仍然不清楚。

利用重組的人源和豬源細胞因子刺激PAECs或HUVECs細胞。我們發現在PAECs或者HUVECs中，rhIL-6能夠顯著的激活pSTAT3；在PAECs中，rpIFNγ能夠激活pSTAT1，然而rhIFNγ不能激活(圖1A-B)。在PAECs中，rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα上調了p-P65，pIκBα、p-P38和p-JNK(圖1C-E)。在PAECs中，rhIL-6和rpIL-6激活的p-STAT3水平幾乎一致(圖1A)。rhIL-17激活的p-P65和pIκBα水平比rpIL-17略高(圖1C)；rhIL-1β激活的p-JNK水平略低于rpIL-1β(圖1D)；然而這些差異都沒有顯著性。

這些結果表明，在PAECs中，人源的IL-17、IL-1β和TNFα能夠顯著的激活NF-κB和MAPKs信號通路，人源的IL-6能夠激活STAT3通路，然而人源的IFNγ并不能激活STAT1信號通路，這個結論與先前的報道一致。另外，在PAECs中，人源的IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα激活的信號通路水平與豬源的細胞因子基本一致，表明豬源和人源的IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα具有很高的同源性并且功能保守。

3.2.在PAECs中，IL-17、IL-1β和TNFα上調了粘附分子和IL-6的表達

接下來在PAECs中，我們想研究粘附分子(內皮細胞選擇素(E-selectin)、VCAM-1和ICAM-1)及促炎分子IL-6的表達是否受這些細胞因子的調控。令人意外的是我們發現rpIFNγ上調了VCAM-1和ICAM-1的表達，然而rpIL-6、rhIL-6和rhIFNγ并不能上調這些基因的表達(圖2A-B)。rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα能夠顯著上調E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的表達(圖2C-E)。在PAECs中，rhIL-1β或rhTNFα處理兩小時，E-selectin的mRNA水平上調超過100倍(圖2D-E)。在HUVECs中，rhIL-6提高了ICAM-1和IL-6的表達但沒有上調E-selectin和VCAM-1(圖3A)。在rhIFNγ處理的HUVECs中，VCAM-1、ICAM-1和IL-6的mRNA水平明顯上調，但E-selectin的水平沒變(圖3B)。在HUVECs中，rhIL-1β和rhTNFα同樣上調了E-selectin、VCAM-1、ICAM-1和IL-6的表達，然而IL-17并沒有上調任何基因，這個結果與之前的信號結果一致(圖3C-E，圖1C)。

3.3.在PAECs中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα誘導了趨化因子的表達

另外，在PAECs中，我們還檢測了這些細胞因子是否影響趨化因子(IL-8和MCP-1)的表達。rhIL-6上調了MCP-1的mRNA表達但是沒有上調IL-8(圖4A-B)。rpIFNγ上調了MCP-1的表達而且還微弱下調IL-8的表達，rhIFNγ并沒有調控MCP-1和IL-8的表達水平(圖4A-B)。在PAECs中，rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα誘導MCP-1的mRNA表達水平大約2-6倍，rhIL-1β和rhTNFα則大大的上調了IL-8的表達水平(圖4A-B)。

我們利用ELISA的方法檢測上清中的IL-8和MCP-1的蛋白水平，結果與mRNA水平保持一致(圖4C-D)。在HUVECs中，rhIL-6和rhIFNγ上調了MCP-1的表達但是下調了IL-8的表達(圖5A-B)。rhIL-1β和rhTNFα極大的增加了IL-8和MCP-1的mRNA表達水平(圖5A-B)。

3.4.在PAECs中，IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα上調了組織因子的表達

凝血失調是導致異種器官移植失敗的一個重要原因。組織因子通過一系列的分子級聯反應使得凝血酶原轉化為凝血酶進而促進凝血反應的發生。在PAECs中，IL-6、IL-1β和TNFα使組織因子的mRNA表達水平提高了2-3倍，然而IL-17誘導的水平非常低(圖6)。rpIFNγ或者rhIFNγ并不能誘導組織因子的表達(圖6)。在HUVECs中，rhIL-6、rhIL-1β和rhTNFα提高了組織因子的mRNA表達水平，然而rhIL-17和rhIFNγ不能上調組織因子的表達(圖7)。

3.5.在PAECs中，IL-1β和TNFα誘導了SLA-I的表達

利用人源或者豬源的細胞因子處理PAECs 24小時，利用流式細胞術分析SLA-I和SLA-II的表達水平。人源和鼠源的IL-1β、TNFα以及rpIFNγ提高了SLA-I的表達，然而IL-6、IL-17或rhIFNγ不能誘導SLA-I的表達。然而除了rpIFNγ外，其它細胞因子都不能誘導SLA-I的表達(圖8)。

3.6.在PAECs中，IL-17和TNFα通過協同效應上調E-selectin、IL-8和IL-6的表達

據我們所知，在鼠源或人源系統中，IL-17和TNFα協同誘導的基因表達水平比它們各自單獨誘導的基因水平之和要高。在豬源系統中，rhIL-17和rhTNFα是否具有協同效應仍不可知。我們發現，在PAECs中，rhIL-17和rhTNFα誘導的E-selectin、IL-8和IL-6的表達水平明顯高于rhIL-17和rhTNFα單獨誘導的水平之和(圖9)。雖然IL-17單獨誘導的基因表達水平不高，然而通過與TNFα的協同作用可顯著提高基因的表達水平。

3.7.在PAECs中，tocilizumab不能阻斷IL-6激活的STAT3通路

Tocilizumab是人源IL-6受體的人源化單克隆抗體，在人源系統中，它可以阻斷IL-6介導的下游信號通路的激活進而抑制其炎癥效應。在HUVECs中，tocilizumab(100ng/ml)抑制了rhIL-6介導的STAT3的激活，在一個高濃度(500ng/ml)的情況下基本完全阻斷了IL-6介導的STAT3的激活(圖10A-B)。令人吃驚的是，在PAECs中，tocilizumab(100ng/ml或500ng/ml)處理組或非處理組，rhIL-6或rpIL-6激活的STAT3水平沒有明顯差異(圖10A-B)。造成這種結果的原因可能是人源和鼠源IL-6受體的結構差異，特別是tocilizumab與受體結合位點處的結構差異。基于這些結果，我們預測tocilizumab在異種移植中抑制免疫排斥的效果不如病人中的效果好。

4.討論

雖然這些促炎細胞因子在各種疾病和同種移植中具有重要的病理學作用，但是在異種移植中它的病理學作用仍然不清楚。在豬主動脈內皮細胞，我們發現人源的細胞因子IL-17、IL-1β和TNFα可以激活NF-κB和MAPKs信號通路，而人源的細胞因子IL-6可以激活STAT3信號通路。人源的細胞因子IL-17、IL-1β和TNFα不僅能夠誘導粘附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)、促炎因子(IL-6)和趨化因子(IL-8和MCP-1)，而且也能誘導組織因子。在人源細胞因子IL-1β或TNFα豬白細胞抗原I(SLA-I)的表達量也有所增加，但是在人源細胞因子IL-17中不能。在豬主動脈內皮細胞中，人源細胞因子IL-6只能增加MCP-1和組織因子mRNA的水平。可是，人源細胞因子IFNγ對豬主動脈內皮細胞沒有作用。基于我們的試驗，我們認為人源的細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα在異種移植中對炎癥反應和促凝血反應有重要的作用。

Batten等人認為人源細胞因子IL-1β對豬主動脈內皮細胞沒有作用，然而我們發現它能夠刺激豬主動脈內皮細胞產生某些變化。他們發現在500U/ml人源細胞因子rhIL-1β處理1天、2天、3天或者6天后，在豬主動脈內皮細胞中，E-selectin和VCAM-1的蛋白質水平沒有增加，而在我們的試驗中發現，用20ng/ml人源細胞因子rhIL-1β處理豬主動脈內皮細胞2h后，E-selectin和VCAM-1的mRNA水平可以增加10-400倍。另外我們發現，人源細胞因子rhIL-1β可以顯著激活NF-κB和MAPKs信號通路，以及其他的炎癥相關基因，趨化因子，組織因子和SLA-I。但是豬白細胞抗原II(SLA-II DR)是沒有變化的，這個結論與Batten等人報道的結論是一致的。我們認為導致這樣兩種不同結果原因可能與不同的處理時間或者人源細胞因子IL-1β的不同濃度有關。

IL-17是由Th17細胞產生的一種特異性的細胞因子，與自身免疫疾病，癌癥和各種炎癥紊亂反應有關。在之前的研究中，人源細胞因子IL-17能夠激活PAECs下游信號通路，例如NF-κB、JNK和P38或上調表達下游粘附因子，促炎基因，趨化因子和組織因子。雖然有些基因的表達在人源細胞因子IL-17刺激下表達并不是很大，但是當它與人源細胞因子rhTNFα共同作用下，能夠明顯擴大其影響效果。人源細胞因子IL-17通過加強mRNA的穩定性。在牛皮癬疾病中，Andrea Chiricozzi等人鑒定了160個基因，例如CCL20，CXCL1，IL-17C，IL-8等都能通過協同作用上調表達。利用基因芯片分析和RT-PCR在另外196個基因表達中這兩個細胞因子具有協同作用。在之前研究中，我們發現在人源細胞因子IL-17和rhTNFα的協同作用下，可以誘導E-selectin、IL-6和IL-8的表達。我們預測除了這三個基因外，在豬主動脈內皮細胞中，會有更多的基因受到這種協同作用的影響。基因芯片技術是一種比較好的方法去研究這些問題。在異種移植中，人源細胞因子rhIL-17和rhTNFα能夠擴大促炎反應。抗IL-17和抗TNFα藥物聯合使用會對異種移植臨床治療具有一定的治療效果。

IL-6是一種在炎癥反應、癌癥、免疫調控和造血過程中具有廣泛的生物學功能的多效細胞因子。它主要激活JAK/STAT3的信號通路。在我們的研究中，人源化細胞因子IL-6能夠激活STAT3信號通路和誘導MCP-1和組織因子的表達。同樣，IL-6在急性和慢性炎癥反應中具有重要的作用。它也能促進多形核中性白血球(PMN)向單核粒細胞/巨噬細胞的轉移。并且我們發現人源細胞因子IL-6能夠誘導內皮細胞產生MCP-1。這種現象可能支持多形核中性白血球(PMN)向單核粒細胞的轉化。IL-6也是一種能夠平衡調節性T細胞和產生IL-17的Th17細胞。另外，IL-6在T細胞具有抗凋亡作用。我們認為在異種移植中，通過招募單核粒細胞，平衡調節性T細胞和Th17細胞以及促進T細胞的存活，人源細胞因子IL-6可以誘導炎癥反應。更加有趣的是，托珠單抗(tocilizumab)，一種抗IL-6受體的特異性抗體，不能阻斷由人源細胞因子IL-6激活的STAT3信號通路。并且建議在體外模型或者豬－狒狒的異種移植模型中，使用其他藥品，例如單抗藥物sarilumab和siltuximab是否能夠阻斷IL-6信號。

另外，我們發現人源細胞因子rhTNFα能夠顯著激活NF-κB和MAPKs信號通路，然后調節下游基因的表達。豬源rpIFNγ明顯能夠激活下游基因和STAT1，而人源細胞因子rhIFNγ不能。

在PAECs中，趨化因子MCP-1和IL-8能夠與一些粘附分子E-selectin、ICAM-1和VCAM-1一起，與特異性的內細胞相互作用并且招募它們到炎癥反應位點。IL-6也被認為是促炎反應中的最重要的細胞因子與促炎反應相關基因的表達是一個放大免疫反應最重要的途徑。在我們的研究中，發現人源細胞因子rhIL-17、rhIL-1β和rhTNFα能夠誘導這些基因的表達，以及人源rhIL-6能夠增加MCP-1的表達。這些結果顯示人源細胞因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNFα在異種移植中能夠促進炎癥反應，它們可以被聯合藥物所抑制。

T細胞反應在異種移植的細胞免疫反應中有重要的作用。主要組織相容性復合體(MHC)對T細胞的激活是十分重要的。豬白細胞抗原II(SLA-II)主要負責CD4⁺T細胞的激活，而SLA-I主要對CD8⁺T細胞和NK細胞的活性。顯性負Ⅱ類反式激活(Dominant negative class II transactivator)轉基因豬能夠降低這類T細胞的反應，而在豬白細胞抗原I(SLA-I)缺陷性豬的外周血中CD4^-CD8⁺T細胞的數量有所減少。

在我們的研究中發現，人源細胞因子TNFα和IL-1β能夠誘導豬白細胞抗原I(SLA-I)，但是人源細胞因子IL-17和IL-6不能。豬白細胞抗原II(SLA-II)只能被豬源rpIFNγ激活，而其他的細胞因子則不能。這些發現顯示，人源細胞因子TNFα和IL-1β處理的PAECs更容易被CD8⁺T細胞和NK細胞識別。在豬－狒狒異種移植的模式中，會經常發生凝血紊亂，成為移植成功的一個重要壁壘。凝血反應是一個非常緊密的調控過程。組織因子引起的凝血酶原向凝血酶轉變的一個分子聯機反應，它能夠啟動外源性凝血級聯反應。Ahrens等人認為，與野生型的豬相比，下調組織因子的豬能夠減少凝血酶的形成和增加凝血的時間。在我們的研究中發現，人源細胞因子IL-6、IL-1β或者TNFα能夠誘導組織因子的表達，而人源細胞因子rhIL-17可以微弱的上調表達組織因子。這些研究結果發現，在豬－狒狒異種移植的模式中，人源細胞因子IL-6、IL-1β、TNFα和IL-17能夠促凝血反應。因此，在異種移植中，阻斷這些細胞因子可以緩解凝血紊亂反應。

綜上所述，在我們的研究中我們發現：(1)人源細胞因子IL-6、IL-17、TNFα和IL-1β能夠以不同的方式激活PAECs；(2)激活的PAECs在不同程度上調控粘附因子、趨化因子、促炎基因IL-6、SLA-I和凝血因子，這些基因在異種移植中能夠影響炎癥和凝血反應。

以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民醫院

<120> 重組的人源IL-17在制備藥物中的用途

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