專利名稱：促紅細胞生成素微球在制備治帕金森病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及促紅細胞生成素微球的新用途，具體地說，是促紅細胞生成素微球在制備治帕金森病藥物中的用途。
背景技術：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常見的神經系統退行性疾患，主要與黑質致密區多巴胺能神經元變性缺失及由此造成的黑質紋狀體通路多巴胺遞質減少有關。經過多年的臨床實踐，一般認為，左旋多巴仍是最有效的治療帕金森病藥物。但左旋多巴長期應用后，大部分患者會出現癥狀波動、異動癥(levodopa-induced dyskinesia,LID)和精神癥狀，即H)運動并發癥，加之實驗室發現高濃度多巴胺(dopamine，DA)和左旋 多巴會由于自身氧化產生自由基，可導致神經細胞變性壞死，因此，聯合其他藥物共同預防和治療ro病癥十分迫切。研究發現紋狀體GRKs和Arrestins表達的變化與H)的發展關系密切。近年研究表明，PD運動并發癥的發生與表達Dl受體的直接通路及其下游cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)、ERK等信號轉導通路被激活關系密切，其下游信號轉導蛋白多巴胺和環磷腺苷調節的憐酸化蛋白 _32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000,DARPP-32)的蛋白Thr75位點磷酸化表達的改變可能參與了異動癥的發病。目前認為使用左旋多巴控釋劑、多巴胺受體激動劑、B型單胺氧化酶(monoamineoxidase-B type,MA0_B)抑制劑和兒茶酌·-氧位-甲基轉移酶抑制劑(eateehol-O-methyltransferase inhibitor, C0MTI)可延緩運動并發癥的出現。但是西藥預防和治療產生的副作用較大，容易形成耐藥性，不宜長期服用。促紅細胞生成素(Erythropoietin, ΕΡ0)是一種參與調節紅細胞前體細胞分化、增殖、抑制凋亡的糖蛋白激素，可以增加紅血球的數目。近年來越來越多的研究表明，EPO在神經發育、神經保護和成年神經元修復、生存、再生過程中均發揮著非常廣泛和復雜的作用，而且認為它的神經保護作用是一種不依賴于其促進紅細胞生成功能的直接作用。另外，EPO及其受體(Erythropoietin receptor, EPO-R)在哨齒類、哺乳類及人類的神經元和膠質細胞均有表達。關于促紅細胞生成素對H)模型的保護作用及其機制的實驗研究已有報道，但是關于促紅細胞生成素與多糖、緩釋材料制備的微球在治療和預防H)病癥藥物中的應用還未見報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種促紅細胞生成素微球在制備治帕金森病藥物中的應用。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是
促紅細胞生成素微球在制備治帕金森病藥物中的應用，所述的促紅細胞生成素微球是自然提取的促紅細胞生成素、基因重組表達促紅細胞生成素、聚乙二醇修飾的促紅細胞生成素、糖基化修飾的促紅細胞生成素或人血清融合的促紅細胞生成素中的一種與多糖制備成促紅細胞生成素多糖顆粒，所述促紅細胞生成素多糖顆粒再與緩釋材料制備成促紅細胞生成素微球。所述的促紅細胞生成素多糖顆粒是指促紅細胞生成素與多糖在聚乙二醇溶液中通過冷凍干燥或噴霧干燥制備得到，所述多糖是葡聚糖或海藻酸鈉中的一種。所述的緩釋材料為聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸-聚乳酸(PLGA)、聚己內酯(PCL)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)或聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇(PLGA-PEG)中的一種。所述的促紅細胞生成素微球是通過水包油-油包固(S/0/W)的方法或水包油-油包油-油包固(S/0/0/W)的方法制備得到。所述的促紅細胞生成素微球是通過皮下注射或顱內注射。
所述的促紅細胞生成素微球的注射劑量為10萬單位 500萬單位/kg。所述的促紅細胞生成素微球的注射頻率為7天 60天一次。本發明優點在于
1、本發明發掘了促紅細胞生成素微球的新醫療用途，開拓了一個新的應用領域；
2、該促紅細胞生成素微球作為藥物治療和預防ro病癥具有長效緩釋、無毒副作用、順應性好、減輕病人痛苦、價格低等優點，易于被患者接受；
3、促紅細胞生成素微球制備工藝簡單，對環境友好，在治療和預防ro病癥中有良好的應用前景。


附圖I是大鼠腦脊液EPO含量結果。附圖2是免疫組化檢測大鼠腦內EPO結果。附圖3是免疫組化檢測大鼠腦內EPO-R結果。附圖4是免疫組化檢測大鼠黑質TH細胞結果。附圖5是大鼠腦內黑質多巴胺能神經元計數結果。附圖6是大鼠黑質TH的檢測結果。附圖7是大鼠紋狀體TH的檢測結果。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例I促紅細胞生成素微球的制備 一、制備促紅細胞生成素多糖顆粒
①用超純水分別制備10% (w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和10% (w/w)的葡聚糖水溶液。精確稱取SOOmg自然提取的促紅細胞生成素溶于7.2ml超純水中待用。②在0°C 4°C條件下，將上述的葡聚糖水溶液、促紅細胞生成素水溶液和PEG水溶液按照體積比為1: 1: 5、1: 1:10、1: 1:20或1: 1:40的比例混合，然后旋渦震蕩30s 60s充分混勻。③將促紅細胞生成素、PEG和葡聚糖形成的混合溶液冷凍過夜，然后真空冷凍干燥。
④將步驟③所得的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續相，獲得載促紅細胞生成素多糖顆粒。得到的促紅細胞生成素多糖顆粒的粒徑為O. 3 5μπι，這些玻璃體顆粒光滑圓整，粒徑分布均勻，促紅細胞生成素的結構得到較好的保護，避免了在劑型制備過程中失活。二、制備促紅細胞生成素微球
①稱取Ig聚乙烯醇(PVA)和5g NaCl，加超純水94g，然后加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無氣泡后，停止攪拌，放于4°C冰箱待用。該溶液中PVA濃度為1% (w/w), NaCl濃度為5% (w/w)。②精確稱取緩釋材料聚羥基乙酸-聚乳酸(PLGA) 200mg，加二氯甲烷800mg，漩渦振蕩，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20 % (w/w)，現用現配，以 防二氯甲烷揮發。③稱取促紅細胞生成素多糖顆粒10mg，均勻分散于O. 5g步驟②中的PLGA的二氯甲燒溶液中，磁力攪拌15min,轉速1800rpm,充分攪拌使得促紅細胞生成素多糖顆粒均勻分散于PLGA的二氯甲烷溶液中，將所得初乳分散于含I % (w/w) PVA和5% (w/w)氯化鈉的水溶液中，以2200rpm的轉速勻衆成復乳(S/0/W),于Imin內轉移到4°C的10% (w/w)氯化鈉的水溶液中固化，攪拌3 4小時后收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預凍過夜，再真空冷凍干燥，制得粒徑在50 μ m 120 μ m的微球。需要說明的是，促紅細胞生成素還可以是基因重組表達促紅細胞生成素、聚乙二醇修飾的促紅細胞生成素、糖基化修飾的促紅細胞生成素或人血清融合的促紅細胞生成素中的一種。所述的促紅細胞生成素多糖顆粒還可以是促紅細胞生成素與多糖在聚乙二醇溶液中通過噴霧干燥制備得到，所述多糖還可以是海藻酸鈉。所述的緩釋材料還可以是聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)或聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇(PLGA-PEG)中的一種。所述的促紅細胞生成素微球還可以采用水包油-油包油-油包固(S/0/0/W)的方法制備得到(詳見Yuan W，Wu F，Guo M, Jin T. Development of protein deliverymicrosphere system by a novel S/O/O/ff multi-emulsion. Eur J Pharm Sci, 2009,36(2-3) : 212-218.袁偉恩，吳飛，葛梅燕，金拓.用一種新穎的水包油-油包油-油包固的方法制備輸送蛋白微球系統，歐洲藥劑科學雜志，2009，36 (2-3):212-218)。制備的促紅細胞生成素微球可以用于皮下注射或顱內注射，起到緩釋和治療H)病癥的作用。實施例2自然提取的促紅細胞生成素制備的微球治療ro的臨床前試驗 一、實驗方法
I. PD模型制備
大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥麻醉后，嚴格平顱位固定于大鼠腦立體定向儀上，剪毛后碘伏消毒頭部皮膚，沿正中線切開頭皮，15%雙氧水燒灼骨膜，暴露顱骨縫及前囟，確定前囟坐標，根據包新民等所著《大鼠腦立體定位圖譜》，確定右側前腦內側束(medial forebrainbundle, MFB)注射位點①前囟后3. 7mm,矢狀縫右側I. 7mm,盧頁骨下8. Omm,門齒線2. 4mm ；
②前囟后4. 4mm,矢狀縫右側I. 2mm,盧頁骨下8. 0mm,門齒線2. 4mm。按上述確定的注射位點鉆孔，用10 μ I規格的微量注射器抽取6-OHDA 6 μ 1(溶于O. 2%維生素C生理鹽水，濃度4 μ g/μ 1)，每點注射3 μ I,注射速度約I μ 1/min,留針5min后緩慢退針,退4mm再留針5min,直至完全退出，縫合皮膚切口，置籠喂養。3周后，大鼠腹腔注射阿樸嗎啡(O. 5mg/kg)誘導旋轉，平均旋轉頻率> 7次/min為成功H)大鼠模型。微球注射液預處理
羧甲基纖維素(CMC)溶劑配方0. 5%CMC，5%甘露醇，O. 1%吐溫_80，加水溶解。EPO微球注射液將123mg實施例I所制備的EPO微球溶于7. 5mlCMC溶劑中，得到含EPO和CMC的混懸液，即EPO微球注射液，其中，EPO的終濃度為10000 U/ml。
模型分組和行為學測定
隨機將ro大鼠模型分為①ro組(ro大鼠不再做進一步處理)、②epo微球 ο萬單位/kg組(ro大鼠皮下注射或顱內注射劑量為 ο萬活性單位/kg大鼠的自然提取的epo制備的微球)、③epo微球loo萬單位/kg組(ro大鼠皮下注射或顱內注射劑量為loo萬活性單位/kg大鼠的自然提取的EPO制備的微球)、④EPO微球500萬單位/kg組(H)大鼠皮下注射或顱內注射劑量為500萬活性單位/kg大鼠的自然提取的EPO制備的微球)。EPO微球注射頻率為7天 60天一次。另設有假手術組正常SD大鼠，不作任何處理。各組大鼠經腹腔注射阿樸嗎啡誘導旋轉，記錄其30分鐘內旋轉圈數，計算各組大鼠每分鐘的平均旋轉圈數。大鼠腦脊液抽取
大鼠在注射EPO微球注射液I周后，予腹腔注射3%的戊巴比妥麻醉后，嚴格平顱位固定于大鼠腦立體定向儀上，剪毛后碘伏消毒頭部皮膚，解剖器械由18G針頭改造，針尖
I.5_，用鉗子改成90度角。30G針連接Iml注射器用于收集腦脊液。改造枕頭鈍性分離表層肌肉，暴露環枕膜，立即用連接Iml的30G針頭以30度角度從切口的尾端刺入環枕膜，進入約1mm，抽取腦脊液。將腦脊液注入O. 5ml的EP管中，_80°C下保存待用。免疫組化染色
大鼠在結束注射后的第12h，每組隨機抽取4只大鼠用乙醚麻醉，依次經心臟灌注預冷的生理鹽水IOOml和4%多聚甲醛300ml，斷頭取腦，相同固定液中后固定8h，經修塊、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后用石蠟包埋。行石蠟切片，切片厚度為5 μ m。取紋狀體冠狀層面采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)行免疫組化染色，步驟如下石蠟切片脫蠟至水；3%雙氧水室溫避光孵育5min，以消除內源性過氧化氫酶活性；pH7. 7的I nmol/1 EDTA-Tris-HCl 微波加熱修復；1%BSA_PTS (O. 5%Triton-X100)室溫封閉 20min ；TH受體單克隆抗體(1:400，1%BSA稀釋)4°C濕盒內孵育過夜；滴加稀釋的生物素標記二抗，37°C孵育20min ;滴加稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37°C孵育20min ;聯苯二胺(DAB)顯色劑顯色，自來水沖洗，之后脫水、透明、封片。各步驟之間均用O.Olmol/1 PBS充分漂洗，PBS代替一抗作為陰性對照。免疫組化切片各觀察區隨機取5個不重疊視野，于高倍鏡(10父40)下觀察，采用01^10^3-^50成相系統拍攝，1111&86- 1'0 Plus 5. I圖象處理軟件進行半定量分析，計算TH受體陽性細胞指數(IOD) =陽性細胞面積X校正光密度值(測量區光密度一背景光密度)。蛋白免疫印跡
大鼠在最后一次注射12h后，乙醚麻醉，每組隨機抽取4只大鼠斷頭處死。迅速開顱取腦，快速冰上分離雙側紋狀體，每IOmg組織加入100 μ I蛋白裂解液RIPA (含有50mMpH7. 4 Tris, 150mM NaCl, l%Triton X-100,1% sodium deoxycholate, 0. 1% SDS 以及 sodiumorthovanadate, sodium fluoride, EDTA, leupeptin 等)和 I μ I 蛋白酶抑制劑 PMSF,超聲充分勻漿，冰上裂解30 min，然后置于4°C離心機于HOOOrpm離心30min，吸取上清液至另
一 EP管，提取總蛋白，測定蛋白濃度后于-80 0C保存。蛋白電泳溶液配制。IX電泳緩沖液(Running Buffer) 14. 4g/L甘氨酸，3g/LTris base, lg/L十二燒基橫酸鈉。轉膜緩沖液(Transter Buffer) :19.375 g Tris base,0. 75 g 甘氨酸，200ml 甲醇加水至 1000ml。IX 上樣緩沖液(Sample Buffer) 62. 5mMTris-HCl (pH6. 8，25°C )，2% w/v 十二烷基磺酸鈉，10% 甘油，50mM 二硫蘇糖醇，(λ 01%w/v 溴酌■藍或酌■紅。10 X TBS (Tris-buffered saline):封閉緩沖液(Blocking Buffer) I X TBS,
0.1%吐溫-20和5% w/v脫脂奶粉。第一抗體稀釋液I X TBS, 0. 1%吐溫-20和5%封閉劑。Wash Buffer TBS/T :1 XTBS，0. 1% Tween-20。·配膠用BiO-Rad公司的專用配膠槽，用15 μ I微量注射器或20 μ I EPPEND0RF移液槍加已變性的樣品于加樣孔中，每加一個，水沖洗針管。先在100V下電泳30min，再穩壓150V電泳60min。蛋白轉膜，250mA的電流下轉移90min，轉膜后取膜。轉膜后用25ml TBS室溫下洗膜5min ;用25ml的封閉緩沖液室溫下封閉Ih ;用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min ;按相應濃度稀釋第一抗體TH抗體(滴度為1:400)或抗β -actin的兔抗溶液(滴度為1:1000)，在IOml的一抗稀釋緩沖液中，4°C輕搖孵育膜過夜；用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min ;加第二抗體(抗兔的HRP相連的IgG ；1:1000)于IOml的封閉緩沖液中室溫下輕搖孵育膜Ih ;用15ml的Wash Buffer洗3次,每次5min。配置IOml的ECL顯色混合液，加于PVDF膜上，置室溫中反應，去除多余液體，用Imagelab圖像分析軟件計算各樣本目的蛋白條帶OD值與面積值的乘積，從而進行蛋白條帶密度定量。每個樣品的免疫印跡蛋白條帶與β -actin相比較后，得出一個密度比，再進行統計學分析。統計學分析
采用SPSS13. O軟件進行統計學處理。數據以均數土標準誤差表示，應用團體t檢驗和單因素方差分析進行統計，以P < 0. 05為顯著性水平。二、結果
I.不同劑量EPO微球對大鼠模型旋轉次數的影響
各組大鼠注射阿樸嗎啡后，其平均旋轉圈數結果見表1，假手術組大鼠30分鐘內平均旋轉數為0±2圈/分鐘，ro組大鼠30分鐘內平均旋轉數為19±2圈/分鐘，與假手術組相比P〈0. 001 (*) ;10萬活性單位/kg EPO微球組旋轉數為15±2圈/分鐘，與H)組相比無顯著差異；100萬活性單位/kg EPO微球組旋轉數為4± I圈/分鐘，與H)組相比P〈0. 001(#) ；500萬活性單位/kg EPO微球組旋轉數為2±1圈/分鐘，與ro組相比P〈0. 001 (#)。結果表明自然提取的EPO制備的微球可以降低ro大鼠的不自主旋轉次數，其中，高劑量EPO微球有十分明顯的治療效果。表I不同劑量EPO微球對大鼠模型旋轉次數的影響
權利要求
1.促紅細胞生成素微球在制備治帕金森病藥物中的應用，其特征在于，所述的促紅細胞生成素微球是自然提取的促紅細胞生成素、基因重組表達促紅細胞生成素、聚乙二醇修飾的促紅細胞生成素、糖基化修飾的促紅細胞生成素或人血清融合的促紅細胞生成素中的一種與多糖制備成促紅細胞生成素多糖顆粒，所述促紅細胞生成素多糖顆粒再與緩釋材料制備成促紅細胞生成素微球。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的促紅細胞生成素多糖顆粒是指促紅細胞生成素與多糖在聚乙二醇溶液中通過冷凍干燥或噴霧干燥制備得到，所述多糖是葡聚糖或海藻酸鈉中的一種。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的緩釋材料為聚乳酸、聚羥基乙酸-聚乳酸、聚己內酯、聚乳酸-聚乙二醇或聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇中的一種。
4.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的促紅細胞生成素微球是通過水包油-油包固的方法或水包油-油包油-油包固的方法制備得到。
5.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的促紅細胞生成素微球是通過皮下注射或顱內注射。
6.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的促紅細胞生成素微球的注射劑量為10萬單位 500萬單位/kg。
7.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的促紅細胞生成素微球的注射頻率為7天 60天一次。
全文摘要
本發明公開了促紅細胞生成素微球在制備治帕金森病藥物中的應用，所述的促紅細胞生成素微球是自然提取的促紅細胞生成素、基因重組表達促紅細胞生成素、聚乙二醇修飾的促紅細胞生成素、糖基化修飾的促紅細胞生成素或人血清融合的促紅細胞生成素中的一種與多糖制備成顆粒，所述顆粒再與緩釋材料制備成微球。本發明的優點在于發掘了促紅細胞生成素微球的新醫療用途，開拓了一個新的應用領域，促紅細胞生成素微球治療和預防帕金森病具有長效緩釋、無毒副作用、順應性好、減輕病人痛苦、價格低等優點，易于被患者接受，促紅細胞生成素微球制備工藝簡單，對環境友好，在治療和預防帕金森病中有良好的應用前景。
文檔編號A61K38/18GK102895655SQ201210366598
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者劉振國, 袁偉恩, 戚辰, 張奇昕 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院