專利名稱：一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種中藥組合物，具體地說，是ー種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物及其應用。
背景技術：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常見的神經系統(tǒng)退行性疾患， 主要與黑質致密區(qū)多巴胺能神經元變性缺失及由此造成的黑質紋狀體通路多巴胺遞質減少有夫。經過多年的臨床實踐，一般認為，左旋多巴仍是最有效的藥物。但長期應用后大部分患者會出現癥狀波動、運動障礙和精神癥狀。加之實驗室發(fā)現高濃度多巴胺(dopamine， DA)和左旋多巴由于自身氧化產生自由基，可導致神經細胞變性壞死。因此，聯(lián)合其他藥物共同治療ro運動并發(fā)癥十分迫切。此外，研究發(fā)現紋狀體GRKs和Arrestins表達的變化與的發(fā)展關系密切。近年研究表明，帕金森病運動并發(fā)癥的發(fā)生與表達Dl受體的直接通路及其下游cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)、ERK等信號轉導通路被激活關系密切，其下游信號轉導蛋白多巴胺和環(huán)磷腺苷調節(jié)的憐酸化蛋白-32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位點磷酸化表達的改變可能參與了異動癥(levodopa-induced dyskinesia, LID)的發(fā)病。目前認為使用左旋多巴控釋劑、多巴胺受體激動劑、B型單胺氧化酶(monoamine oxidase-B type,MAO-B)抑制劑和兒茶酌■-氧位-甲基轉移酶抑制劑(eateehol-O-methyl transferase inhibitor,C0MTI)可延緩運動并發(fā)癥的出現。但這些藥物往往副作用較大， 容易形成耐藥性，不宜長期服用。我國在中醫(yī)藥治療PD方面積累了豐富經驗，總結其治療原則是益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則。中國專利文獻CN100409867C公開了ー種熄風止顫膠囊，提供了由白芍、鉤藤等組成的復方中藥，治療PD，改善震顫癥狀、肌強直、運動不能癥狀。李敏等提出了補腎活血中藥可以改善ro患者運動并發(fā)癥癥狀，且療效隨治療時間延長而增加，該補腎活血中藥由山萸肉10g，何首烏15g，丹參15g，水蛭6g等中藥組成，但沒有公開其他中藥成分 (詳見李敏等.補腎活血顆粒治療帕金森病運動并發(fā)癥臨床研究.中華中醫(yī)藥雜志， 2011，26(6) :1296-1299.)。但是關于ー種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物目前還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物的應用。為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻10-20份、黃芪10-20份、熟地黃10-20份、白芍藥10-30份、當歸10-20份、鉤藤10-20份、僵蠶5_20份、天南星5_20份。所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻12-16份、黃芪12-16份、熟地黃12-16份、白芍藥16-25份、當歸12-16份、鉤藤12-16份、僵蠶8_12份、天南星8_12 份。所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻15份、黃芪15份、熟地黃15 份、白芍藥20份、當歸15份、鉤藤15份、僵蠶10份、天南星10份。為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是所述的中藥組合物在制備治療帕金森病運動并發(fā)癥的疾病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在干
1、本發(fā)明的中藥組合物，其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，藥味數較少，具有療效高、 無毒副作用、價格低等優(yōu)點，采用治療原則是益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則，從病原根本入手，對癥下藥，以達到治療的效果；
2、制備方法簡單，成本低，對環(huán)境友好，適于長期服用，是ー種安全有效的治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物，具有良好的應用前景。


附圖I是中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型AM評分的影響，#與西藥組比較，P〈0. 05 ;*與小劑量組比較，均P〈0. 05 ；+與中劑量組比較，P〈0. 01。附圖2是中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型劑峰旋轉次數的影響，#與西藥組比較，均P〈0. 01 ;*與西藥組比較，均P〈0. 01。附圖3是中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化ERK1/2表達的影響的免疫組化結果，A: sham 組,B:LID 組,C: Ievodopa 組，D:TCM_low 組，E:TCM_medium 組，F:TCM-high 組。附圖4是中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化ERK1/2表達的影 口向的 Western 結果，I: sham 組，2: LID 組，3: Ievodopa 組,4: TCM-low 組，5: TCMnedium 組，6:TCM-high 組。附圖5是不同劑量中藥組合物對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化DARPP-32 (THr75)表達的影響的免疫組化結果,A: sham組，B:LID組，C: Ievodopa組，D:TCM-Iow組， E:TCM_medium 組，F:TCM_high 組。附圖6是不同劑量中藥組合物對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化DARPP-32 (THr75)表達的影響的 Western 結果,I: sham 組，2: LID 組，3: Ievodopa 組,4:TCM_low 組， 5: TCMnedium 組，6: TCM-high 組。附圖7是不同劑量中藥組合物對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6的影響的免疫組化結果，I: sham 組，2: LID 組，3: Ievodopa 組,4: TCM-low 組，5: TCMnedium 組,6: TCM-high 組；U:未損傷側，L:損傷側。附圖8是不同劑量中藥組合物對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6的影響的Western 結果，1，、2，:sham 組，3’、4’ PD 組，5’、6’ LID 組，1、2: Ievodopa 組，3、4:TCM_low 組，5、6:TCM-medium 組，7、8:TCM-high 組；I’、3’、5’、1、3、5、7:未損傷側，2’、4’、6’、2、4、6、8:
損傷側。附圖9是中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)P-arrestinl的影 ロ向的免疫組化結果，I sham 組,2: LID 組,3: Ievodopa 組,4:TCM_low 組,5: TCM-medium 組， 6:TCM-high組；U:未損傷側，L:損傷側。附圖10是中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型紋狀體區(qū)P -arrestinl的影響的 Western 結果，I，、2， sham 組，3，、4，PD 組，5，、6，: LID 組，1、2: evodopa 組，3、4: TCM-low 組，5、6:TCM-medium 組，7、8:TCM-high 組；I’、3’、5’、1、3、5、7:未損傷側，2’、4’、6’、2、4、
6、8:損傷側。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。本發(fā)明提供ー種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻10-20份、黃芪10-20份、熟地黃10-20份、白芍藥10-30份、 當歸10-20份、鉤藤10-20份、僵蠶5-20份、天南星5-20份。實施例I中藥組合物的制備(一)
天麻10份、黃芪20份、熟地黃10份、白芍藥30份、當歸10份、鉤藤20份、僵蠶5份、 天南星20份，常規(guī)方法煎煮。實施例2中藥組合物的制備(ニ)
天麻11份、黃芪19份、熟地黃11份、白芍藥28份、當歸11份、鉤藤19份、僵蠶6份、 天南星18份，常規(guī)方法煎煮。實施例3中藥組合物的制備(三)
天麻12份、黃芪18份、熟地黃12份、白芍藥26份、當歸12份、鉤藤18份、僵蠶8份、 天南星16份，常規(guī)方法煎煮。實施例4中藥組合物的制備(四)
天麻13份、黃芪17份、熟地黃13份、白芍藥24份、當歸13份、鉤藤17份、僵蠶12份、 天南星14份，常規(guī)方法煎煮。實施例5中藥組合物的制備(五)
天麻14份、黃芪16份、熟地黃14份、白芍藥22份、當歸14份、鉤藤16份、僵蠶14份、 天南星12份，常規(guī)方法煎煮。實施例6中藥組合物的制備(六)
天麻15份、黃芪15份、熟地黃15份、白芍藥20份、當歸15份、鉤藤15份、僵蠶10份、 天南星10份，常規(guī)方法煎煮。實施例7中藥組合物的制備(七)
天麻16份、黃芪14份、熟地黃16份、白芍藥18份、當歸16份、鉤藤14份、僵蠶16份、 天南星8份，常規(guī)方法煎煮。實施例8中藥組合物的制備(八)
天麻17份、黃芪13份、熟地黃17份、白芍藥16份、當歸17份、鉤藤13份、僵蠶18份、 天南星6份，常規(guī)方法煎煮。
實施例9中藥組合物的制備(九)
天麻18份、黃芪12份、熟地黃18份、白芍藥14份、當歸18份、鉤藤12份、僵蠶20份、 天南星5份，常規(guī)方法煎煮。實施例10中藥組合物的制備(十)
天麻19份、黃芪11份、熟地黃19份、白芍藥12份、當歸19份、鉤藤11份、僵蠶15份、 天南星15份，常規(guī)方法煎煮。實施例11中藥組合物的制備(i^一)
天麻20份、黃芪10份、熟地黃20份、白芍藥10份、當歸20份、鉤藤10份、僵蠶9份、 天南星7份，常規(guī)方法煎煮。實施例12中藥組合物的制備(十二)
天麻18份、黃芪18份、熟地黃18份、白芍藥24份、當歸18份、鉤藤18份、僵蠶12份、 天南星12份，常規(guī)方法煎煮。實施例13中藥組合物的制備(十三)
天麻12份、黃芪12份、熟地黃12份、白芍藥16份、當歸12份、鉤藤12份、僵蠶8份、 天南星8份，常規(guī)方法煎煮。需要說明的是，實施例1-13所述的常規(guī)方法煎煮是中藥湯劑常規(guī)的制作方法，即將所述的原料藥加水煎煮成湯劑。實施例14本發(fā)明的中藥組合物的臨床前試驗一、實驗方法
I. LID模型制備和分組
利用6-0HDA制備模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯/芐絲肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/ kg芐絲肼)溶于含0. 2%維生素C的消毒生理鹽水中)4周，制備異動癥 (levodopa-induced dyskinesia, LID)大鼠模型，隨機將LID模型分為LID組、西藥組、中藥組合物小劑量組、中藥組合物中劑量組、中藥組合物大劑量組。LID組為LID模型大鼠腹腔注射0.2%維生素C液29天。西藥組為腹腔注射左旋多巴甲酷+芐絲肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/ kg芐絲肼)溶于含0.2%維生素C的消毒生理鹽水中)，2次/d (上午 9點和下午5點)，持續(xù)29d ;中藥組合物小劑量組、中藥組合物中劑量組、中藥組合物大劑量組在給予左旋多巴甲酷+芐絲肼的基礎上分別加用本發(fā)明的中藥組合物，9 ml /kg，毎日 I次灌胃，連續(xù)4周。中藥組合物中劑量組參照實施例6所述的方法制備中藥組合物；中藥組合物大劑量組按照中劑量組各中藥原料藥各增加20%，參照實施例12所述的方法制備； 中藥組合物小劑量組按照中劑量組各中藥原料藥各減少20%，參照實施例13所述的方法制備。在治療過程中于第8、15、22、29天上午用藥后進行異常不自主運動(AM)評分及劑峰旋轉次數測定。AM評定AM分成4個組分(上肢AM、ロ面部AM、軸性AM和旋轉AM)進行評定，每部分又根據其有無和嚴重程度分為5個等級(0-4):0無；I持續(xù)時間小于30s ;2 持續(xù)時間大于30s，小于60s ；3持續(xù)時間大于60s，外界刺激可使之停止；4持續(xù)時間大于 60s，外界刺激不能使之停止。用藥后每20min評估一次，每次觀察lmin。AM總分按觀察時間內總積分的平均值進行統(tǒng)計，理論上I只大鼠一次用藥后各組分AM最大評分為4分， 總AIM評分為16分。劑峰旋轉次數注射左旋多巴后，每5min記錄旋轉次數，最多的旋轉次數為劑峰旋轉次數。
2.免疫組化染色
結束注射后12h，3%戊巴比妥鈉麻酔，于左心室灌注4%多聚甲醛固定，斷頭取腦后相同固定液中后固定8h，經修塊、梯度酒精脫水、ニ甲苯透明、浸蠟后用石蠟包埋。行石蠟切片，切片厚度為5 Pm。取紋狀體冠狀層面采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結 (SP)法行免疫組化染色,步驟如下石臘切片脫臘至水；3%雙氧水室溫避光孵育5min,以消除內源性過氧化氫酶活性；PH7.7的lnmol/1こニ胺四こ酸-三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(EDTA-Tris-HCl微波加熱修復；1%牛血清白蛋白室溫封20min ；GRK6多克隆抗體 (I :200)、^ -arrestinl 多克隆抗體(I :500)、兔抗鼠 DARPP-32 抗體(I :500)、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗體(I :500)、兔抗大鼠總ERK1/2單克隆抗體(I :500)和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2單克隆抗體(I :500) 4°C濕盒內孵育過夜；滴加稀釋的生物素標記ニ抗， 37°C孵育20min ;滴加稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37 °C孵育20min ;聯(lián)苯ニ胺 (3,3，-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)顯色劑顯色，自來水沖洗，之后脫水、透明、封片。各步驟之間均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作為陰性對照。在顯微鏡下觀察免疫組化切片，各觀察區(qū)隨機取5個不重疊視野，于高倍鏡(10X40)下觀察， 采用0LYMPUS-IX50成相系統(tǒng)拍攝，Image-Pro Plus 5. I圖象處理軟件進行半定量分析，計算GRK6蛋白陽性細胞指數(IOD)=陽性細胞面積X校正光密度值(測量區(qū)光密度一背景光密度)。3. Western blot 蛋白免疫印跡
結束注射后3h，快速冰上分離雙側紋狀體，每IOmg組織加入100 u I蛋白裂解液RIPA 和Iu I蛋白酶抑制劑PMSF，超聲裂解，提取總蛋白。測定蛋白濃度后于-80°C保存。40iig 樣本經10% SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至ニ氟化樹(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，用5%脫脂奶粉洗脫緩沖液后室溫封閉I h ;加入抗GRK6抗體(1:500)、抗 ^ -arrestinl 抗體(I: 500)、抗總 DARPP-32 抗體(1:1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75) 抗體(1:1000)、抗總￡腿1/2抗體(1:1000)或抗磷酸化ERK1/2抗體(I :500)或抗^ -actin (1:1000)，4°C孵育過夜；TBST沖洗，加HRP標記的山羊抗兔ニ抗(1:1000)或山羊抗小鼠 ニ抗(1:3000)，37°C孵育Ih ；TBST沖洗，滴加ECL顯色液，Bio-Rad凝膠成像儀曝光、顯像。 Western blot圖像采用SmartView2000圖像分析軟件計算各樣本目的蛋白條帶OD值與面積值的乘積，從而進行蛋白條帶密度定量。4.統(tǒng)計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數據以均數土標準誤差表示，用單因素方差分析及獨立T建議進行檢驗，P<0. 05表示差異有統(tǒng)計學意義。ニ、結果
(一)不同劑量中藥組合物對異動癥大鼠模型行為學的影響 I.中藥組合物不同劑量對異動癥大鼠模型各組分AIM評分的影響就ロ面部AnH平分而言，第8天各組間均值無顯著差異(/^=2. 18，P >0.05)，第15、22、 29天各組間均值差異顯著(7^=10. 43、/^=11. 70、/^=15. 62，IKQ. 01)。小劑量組與西藥組比較，各天差異均不明顯。第15、22、29天中劑量組比小劑量組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義 (^=5. 06^=5. 48^=5. 46,均/X0. 01)。中劑量組與大劑量組比較，無統(tǒng)計學差異。就上肢A頂評分而言，第8、22、29天各組間均值差異有統(tǒng)計學意義(片9. 64、/7=13. 70,/^=30. 30, /X0. 01)，第15天各組間無明顯差異。小劑量組與西藥組比較，僅于第 22天差異顯著U=5. 69，7X0.01)。中劑量組于第8、15、22天于小劑量組比較差異不顯著， 僅于第29天差異有統(tǒng)計學意義“=6. 20，P<Q. 01)，與西藥組比較，第22、29天差異有統(tǒng)計學意義U=3. 11、6=7.30，均/X0.05)。大劑量組與中劑量組之間比較，第8、22天時差異有統(tǒng)計學差異“=5. 06、(=2. 53，均/X0. 05);與西藥組比較，第8、15、22、29天差異均有統(tǒng)計學意義U=3. 10、t=2. 72、t=6. 06、t=l. 31，均/X0. 05)。就軸向AM評分而言，第8、15、22、29天各組間比較，均無統(tǒng)計學意義。就旋轉AM評分而言，第15、22、29天各組間均值差異顯著(F=17. 12、/と27. 26、 F=2&. 18, 7X0.01)。第8、15、22、29天小劑量組與西藥組比較均無統(tǒng)計學意義。第15、22、 29天中劑量組與西藥組比較，旋轉AIM值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5. 67^=6. 80、 t=6. 40，均/X0. 01)。大劑量組比中劑量組第15、22天旋轉AIM評分降低“=2. 43^=2. 32， 均/X0. 05)。(見表 I)
表I中藥組合物TCM小、中、大劑量與西藥組AM評分的比較( X 土S,分)
權利要求
1.ー種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻10-20份、黃芪10-20份、熟地黃10-20份、白芍藥10-30份、 當歸10-20份、鉤藤10-20份、僵蠶5-20份、天南星5-20份。
2.根據權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻12-16份、黃芪12-16份、熟地黃12-16份、白芍藥16-25份、當歸12-16 份、鉤藤12-16份、僵蠶8-12份、天南星8-12份。
3.根據權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻15份、黃芪15份、熟地黃15份、白芍藥20份、當歸15份、鉤藤15份、 僵蠶10份、天南星10份。
4.根據權利要求1-3任一所述的中藥組合物在制備治療帕金森病運動并發(fā)癥的疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻10-20份、黃芪10-20份、熟地黃10-20份、白芍藥10-30份、當歸10-20份、鉤藤10-20份、僵蠶5-20份、天南星5-20份。本發(fā)明還提供這種中藥組合物的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于配伍符合中藥“君臣佐使”原則，藥味數較少，具有療效高、無毒副作用、價格低等優(yōu)點，從病原根本入手，對癥下藥，以達到治療的效果；制備方法簡單，成本低，對環(huán)境友好，適于長期服用，是一種安全有效的治療帕金森病運動并發(fā)癥的中藥組合物，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K35/64GK102600375SQ20121006302
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者劉振國, 吳娜, 陳偉, 魏江磊 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院