專利名稱：Egr-1拮抗劑在制備治療Ⅱ型糖尿病的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及Egr-I作為治療II型糖尿病靶標的應用，尤其是涉及Egr-I拮抗劑在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。
背景技術：
II型糖尿病是一種常見病，多發病，在我國以及全世界都具有很高的發病率，在我國，II型糖尿病已經成為發病率增長最快的疾病。最新資料表明，我國糖尿病患者已超過6000萬，占全球糖尿病患者的五分之一。預計截止到2025年我國糖尿病患者總數將接近1億。II型糖尿病是一種多病因的代謝疾病，除內在的遺傳因素外，還與人們生活環境、生活方式及行為有很大的關系，特別是過度肥胖引起的一些代謝紊亂易導致II型糖尿病。II型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，是指肌肉和脂肪組織對胰島素產生抗性，作為補償，胰島β細胞則分泌更多的胰島素，但仍不能把血糖維持在正常范圍內。另外，過量的胰島素分泌使胰島β細胞功能受到損傷，導致胰島素分泌不足。胰島素抵抗是指機體靶組織對胰島素的反應性低于正常的一種病理生理狀態，經常與肥胖，II型糖尿病早期階段等臨床疾病相伴隨，是這些疾病的一個重要的特征，也是導致這些疾病發生的重要因素。但是造成胰島素抵抗以及由此導致的肥胖，II型糖尿病等相關疾病的分子機制并不是很清楚。這就導致了其防治的困難。Egr-I基因普遍存在于從酵母到人的真核細胞基因組中，進化上高度保守。多種外界刺激都可促進Egr-I表達并使其活化，活化的Egr-I與靶基因啟動子區上特異結合位點作用而調控不同靶基因的轉錄。目前已證實多種行使各類功能的基因的轉錄需要Egr-I 參與，包括與細胞生長分化和細胞凋亡、炎性細胞趨化、免疫刺激等相關的多種基因。Egr-I 的生物學功能主要是通過激活或抑制這些靶基因的表達實現的。有研究表明，在前列腺癌組織中，轉錄因子Egr-I過表達，而且利用特定的反義寡核苷酸抑制Egr-I的表達，能夠逆轉前列腺癌細胞的轉化。值得一提的是，已經有臨床前研究利用針對Egr-I的反義寡核苷酸防止肺移植后形成炎癥和血栓。另外，Egr-I在肺慢性阻塞性疾病(C0PD)、動脈粥樣硬化、兒童哮喘、白血病等疾病中都有重要的調節作用。

發明內容
本發明的提供一種新的II型糖尿病相關疾病的藥物靶點。本發明涉及人類基因功能，特別是涉及與II型糖尿病的Egr-I基因功能。檢測II 型糖尿病病人脂肪組織以及相關動物體內實驗證明了 Egr-I基因的高表達，通過建立胰島素抵抗脂肪細胞的細胞模型進行進一步的研究，表明Egr-I在胰島素抵抗的情況下受到胰島素信號通路的調節。胰島素長期刺激實驗表明，正常脂肪細胞應答胰島素這一過程是依賴于Egr-I的轉錄活性的，Egr-I的表達受到胰島素的調控。本發明還通過構建了控制 Egr-I表達的相關腺病毒和Egr-I的干擾序列進行深入的探究，研究發現干擾Egr-I的表達可以緩解胰島素抵抗，說明抑制Egr-I的表達能夠增加胰島素敏感性，防止胰島素抵抗。因此Egr-I可以作為II型糖尿病相關疾病理想的藥物靶點。因此，本發明在另一方面提供了 Egr-I拮抗劑在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。在一個實施方案中，所述Egr-I拮抗劑增加胰島素敏感性，防止胰島素抵抗。在一個實施方案中，本發明的Egr-I拮抗劑是抑制Egr-I基因轉錄和/或翻譯的拮抗劑，優選為針對Egr-I的siRNA。在一個實施方案中，所述siRNA靶向下列序列5’_U⑶ CCCAGGACAAUUGMAUUUGCU-3，(SEQ ID NO: 1)，并且所述 siRNA 的序列優選為 5，_AGCAAAUUUC AAUUGUCCUG GGAGA-3， (SEQ ID NO:2)。在另一個實施方案中，本發明的Egr-I拮抗劑是包含鋅指結構域(Egr-Ι第 331-427位氨基酸)的顯性無效Egr-I，優選為表達所述顯性無效Egr-I的DNEgr-I腺病


圖1顯示了 14例II型糖尿病病人脂肪組織中Egr-I的表達水平。其中提取人組織標本RNA，并用實時熒光定量PCR檢測基因表達。圖2 A，含有大量脂滴的脂肪細胞，油紅染色后脂肪細胞；B，胰島素抵抗細胞IRS 的活性；C，胰島素抵抗細胞的葡萄糖攝取能力。圖3 胰島素抵抗細胞中Egr-I應答胰島素刺激上調并調控細胞的葡糖攝取能力A，胰島素抵抗細胞中Egr-I依然能應答胰島素刺激而上調；B，在胰島素抵抗細胞中過表達DN-Egr-I使細胞對葡糖的攝取得到顯著恢復。圖4顯示了胰島素長期刺激下Egr-I的表達與IRS活性的關系。正常3T3-L1 細胞以及脂肪細胞在不同時間點胰島素的刺激下Egr-I以及^S活性的變化。圖5顯示了長期胰島素刺激下Egr-I調控細胞葡糖攝取能力。過表達DnEgr-I 的正常3T3-L1前脂細胞(A)和脂肪細胞(B)在長期胰島素刺激下的葡萄糖攝取實驗。圖6顯示了 Egr-I RNAi有效的下調了小鼠體內的Egr-1 mRNA水平?；疑螆D代表作為對照的糖尿病小鼠，黑色代表尾靜脈注射Egr-I RNAi的糖尿病小鼠。圖7 A圖，db/db小鼠在喂食后血糖水平出現明顯上升，在干擾Egr-I表達水平后，喂食后血糖水平的升高得到抑制。B圖，GTT實驗，糖尿病小鼠在GTT后血糖水平顯著上升，干擾Egr-I后，血糖的升高被顯著抑制。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明范圍。一般材料和方法
技術領域：
本發明以下實施例中使用了以下所列的材料和方法。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗指南New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。1 材料3T3-L1細胞系購自上海細胞所，胰島素(諾和靈R)，地塞米松購自鼓樓醫院， [3H]-D-Glucose購自中國同位素總公司，IBMX購自Sigma公司，抗_p_IRS (Tyr)抗體， 抗-IRS抗體，抗-Egr-I抗體購自Santa Cruz公司，胎牛血清購自PAA公司?？筥p_ERK 抗體，抗-ERK抗體購自(上海康城生物技術公司)反轉錄試劑盒Traverse-Ace以及熒光定量PCR試劑盒購自TOYOBO公司。TNF-α細胞因子購自Sigma公司，油紅染料購自南京生興生物技術公司?？?p-IRS(Ser308)，抗-p-IRS(Ser612)均購自 Cell signaling 公司，野生型及db/db小鼠(Bks)購自南京大學模式動物研究所，羅氏血糖儀，葡萄糖購自 Sigma公司。II型糖尿病病人組織標本由江蘇省中醫院提供。2細胞培養
前脂細胞(3T3-L1)培養于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM 培養基中，于37° C、5% C02濃度條件下的細胞培養箱中培養。3脂肪細胞以及胰島素抵抗細胞的誘導
前脂細胞(3T3-L1)接種并長滿后培養基換為含有10%胎牛血清，150nmol/L胰島素， 250nmol/L地塞米松以及0. 5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的刺激液1，培養2天后，換為含有10%胎牛血清和150nmol/L胰島素的培養基，再培養2天后，細胞換回正常的含10%胎牛血清的DMEM培養基，6天后即出現大量含有脂滴的脂肪細胞。3T3-L1前脂細胞在誘導為脂肪細胞后，用含有終濃度為5ng/ml的TNF-α細胞因子的DMEM培養基誘導3天，每M小時換液，3天后即為胰島素抵抗脂肪細胞。4油紅染色
將誘導好的脂肪細胞用PBS洗3遍，加入油紅染料，吸干，10倍顯微鏡鏡檢。5葡萄糖攝取實驗
每個細胞樣本加入[3H]-D-Gluc0se使終濃度為200uCi/mmol/L，同時加入終濃度為 IOnm的胰島素，3小時后，用冰預冷的PBS洗3遍，加入IOM KOH裂解細胞，用等體積無水乙醇沉淀葡萄糖過夜，IOOOOg離心10分鐘，用無菌水200ul重懸沉淀，用閃爍計數器檢測。6免疫印跡分析
細胞培養至可以進行蛋白抽提時，吸去培養基，用冰預冷的PBS洗兩遍，加入300 μ 1 裂解緩沖液(50.0 mmol/L Tris, 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 1.0 mmol/L Na3V04, 2.0 mmol/L NaF, 100. 0 μ g/ml PMSF, 1.0 μ g/ml 亮肽酶素 (Ieupeptin),以及1. 0 μ g/ml抑肽酶)，冰浴30 min，期間每隔5分鐘混勻一次，刮取細胞，12 000 g離心10分鐘，收集上清。采用Bradford法測定蛋白質濃度。取50 μ g 的總蛋白進行SDS-PAGE膠電泳分離，按常規方法轉印至PVDF膜上，一抗4°C孵育過夜， 抗-Egr-I (1 1000)，抗-p-IRS (Tyr) (1 500)，抗-IRS (1 500)，用 AP 標記的二抗與 NBT 和 BCIP 顯色或者采用 BM chemi luminescence Western Blotting Kit(購自 Roche 公司)檢測結果。7提取組織標本RNA
取Img組織標本，懸浮于Iml Trizol Gnvitrogen)，用組織勻漿器勻漿3_5分鐘，加 1/5體積酚氯仿抽提蛋白，12000rpm，離心10分鐘，抽取上清，加等體積的異丙醇，-20度， 20分鐘沉淀RNA，12000rpm，離心10分鐘，棄上清，沉淀溶于20ul DEPC (焦碳酸二乙脂)溶液，測定濃度。
8 反轉錄 PCR
通過Tranverse-Ace反轉錄試劑盒(Τ0Υ0Β0)，采用oligo-dT進行逆轉錄。取800ng 總RNA反轉錄合成單鏈cDNA，流程如下800ng總RNA，加入lmol/L Oligo dT引物lul， 補DEPC水至10ul。65° C，反應5 min后，迅速置于冰上，再加入反應緩沖液如1，IOmmol/ L dNTP 2 ul,20 U/ul 的 RNA 酶拮抗劑 11。在 37° C 反應 5 min 后，加入 Iul 10 U/ul 逆轉錄酶，42° C反應1 h后在90° C處理10 min。9實時熒光定量PCR
采用實時熒光定量PCR試劑盒(Τ0Υ0Β0)，具體體系如下
20 μ 1 體系，STOR(2*) :10μ 1，引物(上游)(10*) :2 μ 1，引物(下游)(10*) :2μ 1， cDNA模板2μ 1，加雙蒸水至20 μ 1。egr-1實時定量PCR引物序列
egr-1 (鼠)正向5，-TCGGCTCCTTTCCTCACTCA-3，(SEQ ID N0:3) egr-1 (鼠)反向5’ - CTCATAGGGTTGTTCGCTCGG-3，(SEQ ID N0:4) egr-1 (人)正向5，- CAGCAGTCCCATTTACTCAG-3，(SEQ ID N0:5) egr-1 (人)反向5，- GACTGGTAGCTGGTATTG-3，(SEQ ID N0:6) 擴增條件
950C預變性5分鐘，95°C變性15秒，60°C退火15秒，72°C延伸，收集熒光信號45秒，共 40個循環，數據分析。10糖耐量實驗GTT
小鼠禁食12小時后，腹腔注射葡萄糖(1.8mg/g)，分別在不同時間點尾部取血，用血糖儀檢測小鼠血液中葡萄糖含量。11攝食血糖實驗
小鼠禁食12小時后，再喂食12小時，尾部取血，檢測小鼠血液中葡萄糖含量。12 DNEgr-I腺病毒的構建
采用本領域公知的方法構建表達顯性無效Egr-I的腺病毒。具體而言，利用PCR構建包含鋅指結構域(Egr-1上第331-427位氨基酸)的顯性無效Egr-1 (dominant negative Egr-I，DNEgr-I)，特異性擴增引物為 5，-CGCGGGATCCACACCCCCCCATGAACGCCCATATGCTTGC-3， (SEQ ID NO:7)(有義鏈)，和 5，-CGCGGGATCCTCTAGATTAGTCTGCTTTCTTGTCCTTCTGTCT-3， (反義鏈)(SEQ ID NO: 8)。將DNEgr-I的序列從原始質?？寺〉絧AdTrack_CMV質粒，AdEasy System將這些pAdTrack-CMV質粒再重組到腺病毒中，即得到DNEgr-I腺病毒。該病毒能夠表達Egr-I的鋅指結構域，與野生型Egr-I蛋白競爭結合DNA啟動子區，從而抑制細胞內 Egr-I的轉錄活性。13干擾序列的設計合成
siRNA 由 hvitrogen 公司設計以靶向下列序列Egr_l，5-UCUCCCAGGACAAUUGAAAUUUGC U-3 (SEQ ID N0:1)；亂序5-CCUACGCCACCAAUUUC⑶-3 (SEQ ID NO: 9) siEgr-1 靴向序列位于Egr-1基因的第二個外顯子。實施例1
II型糖尿病病人脂肪組織中Egr-I表達量明顯高于正常人
II型糖尿病病人組織標本由江蘇省中醫院提供。如圖1顯示，在14例II型糖尿病病人脂肪組織中Egr-I的mRNA的表達水平要顯著高于正常人的對照組，表明Egr-I表達水平的變化可能在調控II型糖尿病中發揮了作用。我們在糖尿病小鼠、受胰島素/葡萄糖刺激的糖尿病小鼠、高脂飲食3/6周的野生型小鼠上所做的動物實驗也得到同樣的結論。實施例2
胰島素抵抗脂肪細胞模型的成功建立在正常脂肪細胞中，胰島素信號受體底物IRS應答胰島素會發生酪氨酸磷酸化，并激活下游胰島素信號通路。在用TNF-α細胞因子誘導脂肪細胞3天后，我們采用免疫印跡的方法檢測胰島素信號通路中IRS的酪氨酸磷酸化水平的變化。圖2-B、2-C所示結果表明誘導的胰島素抵抗細胞模型成功建立。實施例3
胰島素抵抗細胞中Egr-I應答胰島素的刺激上調并調控細胞的葡糖攝取能力我們檢測到胰島素抵抗細胞中Egr-I的表達量在胰島素刺激3小時后明顯增加，如圖 3-A所示，表明Egr-I在胰島素抵抗的情況下仍然受到胰島素信號通路的調節。DNEgr-I病毒能夠表達Egr-I的鋅指結構域，與野生型Egr-I蛋白競爭結合 DNA啟動子區，從而抑制細胞內Egr-I的轉錄活性。我們將構建好的DNEgr-I病毒感染胰島素抵抗細胞48小時。如圖3-B所示，實驗結果表明，Egr-I在調控細胞胰島素抵抗的過程中具有重要作用，抑制Egr-I的轉錄活性后能提高細胞對胰島素的敏感性。實施例4
長期胰島素刺激下Egr-I調控細胞的葡糖攝取能力
圖4結果顯示在長期胰島素刺激下，正常脂肪細胞開始出現胰島素抵抗現象，而在這一過程中，Egr-I的表達受到到胰島素的調控，同時Egr-I的表達伴隨著^S的活性降低。 圖5結果說明，長期胰島素刺激下，正常脂肪細胞應答胰島素的能力出現顯著下降，而這一過程是受到Egr-I調控的。實施例5
Egr-I干擾序列的設計合成成功
通過尾靜脈注射Egr-I RNAi，顯著下調了 db/db小鼠肝臟Egr-I的mRNA水平(如圖 6所示)。這表明Egr-I干擾序列成功干擾了 Egr-I的表達。實施例6
干擾Egr-I能夠提高糖尿病小鼠的胰島素敏感性，有助于緩解II型糖尿病病情如圖7所示，喂食后Egr-I干擾db/db小鼠組的血糖水平較對照組組db/db小鼠的血糖水平明顯得到抑制，同樣，GTT實驗的數據也顯示，Egr-I干擾組db/db小鼠對血糖水平的控制要顯著好于對照組db/db小鼠。這些結果說明，干擾Egr-I表達增強了脂肪細胞的胰島素敏感性，對胰島素抵抗具有緩解作用，因此，Egr-I可以作為臨床治療II型糖尿病和胰島素抵抗有效的潛在靶標。
權利要求
1.以Egr-I為靶點的拮抗劑在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述Egr-I拮抗劑增加胰島素敏感性，防止胰島素抵抗。
3.權利要求1或2的用途，其中所述的Egr-I拮抗劑抑制Egr-I基因轉錄和/或翻譯。
4.權利要求3的用途，其中所述Egr-I拮抗劑包括針對Egr-I的siRNA。
5.5.權利要求4的用途，其中所述siRNA靶向下列序列5’-UCUCCCAGGACAAUUGAAAUUU GCU-3，。
6.權利要求5的用途，其中所述siRNA的序列為5’ -AGCAAAUUUCAAUU⑶CCUG GGAGA-3’。
7.權利要求3的用途，其中所述Egr-I拮抗劑包括包含Egr-I第331-427位氨基酸的鋅指結構域的顯性無效Egr-I。
8.權利要求7的用途，其中所述Egr-I拮抗劑是表達所述顯性無效Egr-I的DNEgr-I 腺病毒。
全文摘要
本發明提供了Egr-1作為治療Ⅱ型糖尿病靶標的應用，尤其是提供了Egr-1拮抗劑在制備治療Ⅱ型糖尿病的藥物中的用途。本發明的Egr-1拮抗劑能增加胰島素敏感性，防止胰島素抵抗。本發明的Egr-1拮抗劑是能夠抑制Egr-1基因轉錄和/或翻譯的拮抗劑，其中優選為siRNA或顯性無效Egr-1。
文檔編號A61K48/00GK102552938SQ20121007910
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者李朝軍, 沈寧, 羅歐陽, 薛斌, 郁曉 申請人:南京大學