專利名稱：固本抑瘤Ⅱ號含藥血清誘導腫瘤細胞自噬的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥制劑的新用途，具體涉及一種固本抑瘤II號含藥血清誘導腫瘤細胞自噬的用途。
背景技術：
固本抑瘤II號是郁仁存等國家級名老中醫在多年臨床經驗基礎上提出的配合放、化療治療腫瘤的重要方劑(郁仁存，王笑民，徐詠梅等，郁仁存，中國中醫藥出版社 [M1.2007. 11)。經初步研究，據稱本方能降低患者的異常的血液流變學指標，提高免疫功能，減輕骨髓抑制及腸胃反應。固本抑瘤II號由黨參、茯苓、生白術、生黃芪、川芎、雞血藤等13味藥組成。根據功效，將全方拆分為三組，益氣組由黨參、茯苓、白術、生黃芪、女貞子、枸杞子、仙靈脾組成， 活血組由川芎、雞血藤、莪術組成，解毒組由苦參、腫節風、浙貝母組成。前期實驗發現該方中活血藥雞血藤其黃酮類成分促進細胞非凋亡性程序死亡(唐勇，王笑民,何薇等,雞血藤提取物體外抗腫瘤實驗研究，中國中醫基礎醫學雜志，2007，13(4) :306-308)。“藥物血清”的概念由80年代日本昭和藥科大學田代真一教授首次提出(田代真一，和漢藥Q實驗的研究〔二 ^ ^諸問題-invitrog實驗O問題[J],和漢醫藥學會志， 1991，8，218.)。中藥血清藥理學，是通過給動物灌服中藥或中藥復方，經過一段時間后采血、然后分離血清，用含有藥物成分的動物血清進行體外實驗的一種技術。能最大程度地模擬中藥經口服途徑進入體內，通過神經、體液(如細胞因子、免疫系統等)等機制作用于病變部位的過程。研究發現多種中藥單體具有誘導腫瘤自噬的作用，如槲皮素(quercetin)等黃酮類化合物能誘導結腸腺癌細胞自卩遼性死亡(Psahoulia FH, Moumtzi S, RobertsML, Sasazuki T，Shirasawa S，PintzasA. Quercetin mediates preferentialdegradation of oncogenicRas and causes autophagy in Ha-RAS-transformed humancolon cells [J]. Carcinogenesis,2007，28(5) :1021-1031.)。中藥含藥血清體外抗腫瘤的研究主要集中在誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞端粒酶活性、抑制腫瘤細胞體外增殖、協同細胞毒化療藥物作用、形成腫瘤細胞周期阻滯等方面，有關中藥對細胞自噬機制研究主要集中在中藥單體對腫瘤方面的研究，而中藥復方對腫瘤細胞自噬干預作用的研究尚未見報道。臨床研究表明固本抑瘤II號能降低外周血中的血栓素TXB和纖維蛋白原水平， 改善機體血液高凝狀態；提高NK細胞活性和T4/T8比值，進而增強免疫功能，小鼠實驗發現60 120g -kg/d的固本抑瘤II號具有化療增效作用，全方和行氣活血組水提物能抑制 A549細胞生長，與DDP具有增效作用，能使腫瘤細胞生長阻滯于G0/G1期。張青等(固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注治療中晚期肝癌58例臨床研究， 張青等，中醫雜志，2007年，第48卷第03期)觀察固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注治療原發性肝癌的療效，針對112例原發性肝癌患者，隨機分為治療組(固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注)58例、對照組(化學藥物動脈灌注)54例；3 4周灌注I次，每組患者至少完成3次治療。治療組的穩定率為89. 7%，一年生存率為68. 9%，二年生存率為 51.7%，均明顯高于對照組(P <0.05);并可緩解化療藥物的毒副反應，保護肝臟功能，改善患者的生活質量，固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注治療原發性肝癌有較好的減毒增效作用。楊國旺等(固本抑瘤II號聯合化療治療晚期乳腺癌28例臨床觀察，楊國旺等，中醫雜志，2008年，第49卷第12期)觀察中藥固本抑瘤II號在晚期乳腺癌治療中的作用，針對55例復發或轉移性乳腺癌患者隨機分為治療組和對照組，兩組均采用NP (去甲長春花堿 +順鉬)方案化療，治療組同時加服中藥固本抑瘤II號。結果顯示，治療組腫瘤緩解率、臨床獲益率分別為50. 0%和92. 9%，對照組兩指標分別為40. 7%和81. 5% ;治療組在乏力、 肢體麻木、腰膝酸軟3個證候的改善及穩定率優于對照組(P < O. 05或P < O. 01)，固本抑瘤II號在晚期乳腺癌的治療中可以發揮增效減毒作用，益氣活血解毒中藥可能作為化療增敏劑。張青等(固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注治療晚期胰腺癌的臨床觀察，張青等，中國中西醫結合雜志，2007年，第27卷第05期)觀察固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注治療晚期胰腺癌的療效，針對65例晚期胰腺癌患者，隨機分為治療組(固本抑瘤II號配合化學藥物動脈灌注)35例、對照組(化學藥物動脈灌注)30例。經2個月治療，治療組與對照組臨床有效率分別為17. 1%、13. 3%，臨床獲益率分別為54. 2%、40. 0%，兩組比較差異有顯著性(P<0. 05);對晚期胰腺癌的疼痛有效率分別為64. 5%,59. 2%，組間差異無顯著性。固本抑瘤II號有明顯的減毒增效作用，其配合化學藥物動脈灌注治療晚期胰腺癌有較好的療效。唐武軍等(固本抑瘤II號聯合MVP方案治療晚期NSCLC，唐武軍等，中國中醫藥信息雜志，2001年第8卷第07期)觀察中藥固本抑瘤II號聯合MVP方案化療治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的療效、毒性反應、免疫功能變化及生活質量的改善情況。方法將90例晚期NSCLC患者隨機分為治療組(A組:MVP方案化療，同時服用中藥固本抑瘤II號)及對照組(B組MVP方案化療，不服中藥)，至少治療2個周期后評估療效及不良反應。結果A、 B兩組有效率(CR+PR)分別為40. O %和28. 6% (P > O. 05)，穩定率分別為80. O %和52. 4% (P < O. 05);中位生存期A組29周，B組27周(P > O. 05);生存質量的改善A組優于B組 (P < O. 05);血液學毒性反應、惡心嘔吐及發熱癥狀A組明顯少于B組(P < O. 05);免疫功能及血流變學指標A組優于B組(P < O. 05)。固本抑瘤II號聯合MVP方案化療治療晚期 NSCLC能增強機體免疫功能，改善血液高凝狀態，減輕化療毒副反應，改善患者生存質量。然而，現有技術中尚未有研究發現固本抑瘤II號含藥血清具有誘導腫瘤細胞自噬的作用。

發明內容
本發明的目的在于提供固本抑瘤II號含藥血清具有誘導腫瘤細胞自噬的新用途，具體說其含藥血清可以用于誘導腫瘤細胞II型程序性死亡的新用途，可用于固本抑瘤 II號全方或單體及其組合物誘導自噬的新用途，可以用于固本抑瘤II號通過調控自噬抑制腫瘤細胞的新用途，也可以用于研發固本抑瘤II號通過調控自噬抗腫瘤臨床藥物的新用途。本發明系統地研究了固本抑瘤II號(下稱GY II)及其拆方含藥血清誘導人乳腺癌細胞MCF7發生自噬的現象，以在人乳腺癌MCF-7細胞中為例，闡述了固本抑瘤II號及其拆方誘導的自噬各種檢測手段，對細胞周期以及細胞凋亡的影響，確定了其不同于現有技術，也未被所屬技術領域所發現的新用途。本實驗發現固本抑瘤II號含藥血清具有誘導MCF7細胞自噬的作用，MDC及 Hoechst 33342雙染色在熒光顯微鏡下顯示，活血組、解毒組、雞血藤組含藥血清干預MCF7 細胞24h后，MDC染色陽性細胞率明顯高于空白血清組，MDC陽性見核周區域呈綠色點狀染色。MAPI-LC-3II染色激光共聚焦結果顯示，活血組、解毒組、雞血藤組含藥血清作用于MCF7細胞24h后，LC-3II染色陽性細胞率明顯高于空白血清組，陽性細胞可見自噬體綠染，細胞核紅染。MAPI-LC-3II/DNA雙參數流式細胞術同步分析細胞自噬與細胞周期結果顯示 MCF7細胞中加入含藥血清干預后，活血組、解毒組、雞血藤組含藥血清作用于MCF7細胞24h 后，LC-3II染色陽性細胞率明顯高于空白血清組，其中以活血組、雞血藤組含藥血清誘導自噬作用最強。透射電鏡觀察可見，活血組和雞血藤組含藥血清干預MCF7細胞24h后，電鏡下可見大量空泡狀雙層膜包繞的自噬體，解毒組亦可見少量自噬體。GY II全方20%含藥血清雖較10%含藥血清誘導MCF7細胞凋亡率有明顯提高，但是與同濃度正常血清組比較卻無明顯差異，進一步行AV-PI法檢測GY II以及拆方含藥血清誘導凋亡結果發現,全方組、益氣組、活血組、解毒組、雞血藤組含藥血清誘導MCF7細胞少量早期凋亡(不超過5 %)。基于以上實驗，本發明申請人發現固本抑瘤II號作為制備調控自噬抗腫瘤藥物的應用。所述調控自噬抗腫瘤藥物為誘導腫瘤細胞自噬性死亡藥物，生物毒化療藥物增敏的藥物，自噬性免疫療法抗腫瘤藥物，和/或誘導自噬缺陷細胞死亡的藥物。即，固本抑瘤II號作為制備誘導腫瘤細胞自噬性死亡藥物的應用。固本抑瘤II號作為制備生物毒化療藥物增敏的藥物的應用。固本抑瘤II號作為制備自噬性免疫療法抗腫瘤藥物的應用。固本抑瘤II號作為制備誘導自噬缺陷細胞死亡的藥物的應用。所述固本抑瘤II號可以是全方組、益氣組、活血組、解毒組或雞血藤組。所述全方組由黨參、茯苓、白術、生黃芪、女貞子、枸杞子、仙靈脾、活川芎、雞血藤、 莪術、苦參、腫節風和浙貝母組成。優選的,所述全方組由黨參15重量份、獲茶10重量份、白術10重量份、生黃苗30 重量份、女貞子15重量份、枸杞子15重量份、仙靈脾10重量份、川芎10重量份、雞血藤30 重量份、莪術10重量份、苦參12重量份、腫節風15重量份和浙貝母15重量份組成。本發明進一步優選,所述全方組由黨參15g、獲茶10g、白術10g、生黃苗30g、女貞子15g、枸杞子15g、仙靈脾10g、川芎10g、雞血藤30g、莪術10g、苦參12g、腫節風15g和浙貝母15g組成。所述益氣組由黨參、茯苓、白術、生黃芪、女貞子、枸杞子和仙靈脾組成。
所述活血組由川芎、雞血藤和莪術組成。所述解毒組由苦參、腫節風和浙貝母組成。所述雞血藤組為單味藥雞血藤。所述固本抑瘤II號全方組、益氣組、解毒組、活血組或雞血藤組的各組分的具體選擇及具體含量，均是現有技術。其可以采用郁仁存等國家級名老中醫的復方，也可以采用現有技術中經過改變、替代或者優化的復方。由于上述復方均是現有技術，所屬技術領域的技術人員能夠自行獲知其配方并能自市場購買得到，例如各期刊均披露有固本抑瘤II號的配方，北京中醫醫院中藥房等地也可以購得固本抑瘤II號藥物，因此本發明不再就固本抑瘤II號配方及其具體方案做探討。本發明的有益技術效果是，所述的固本抑瘤II號含藥血清可用作自噬誘導物，應用于抗腫瘤藥物的研發，開拓了固本抑瘤II號的新用途，為通過調控自噬抗腫瘤藥物提供了新選擇。具體的說，在制備固本抑瘤II號誘導腫瘤細胞自噬性死亡藥物中的應用；在制備生物毒化療藥物增敏的藥物中的應用；在制備自噬性免疫療法抗腫瘤藥物中的應用；在制備誘導自噬缺陷細胞死亡的藥物中的應用。


圖I是本發明GY II及其拆方含藥血清對MCF7細胞MDC及Hoechst 33342雙染色影響(X400)圖。其中，1-6分別為空白、全方、益氣、活血、解毒、雞血藤含藥血清組。圖2是熒光顯微鏡下GY II及其拆方含藥鼠血清對MCF7細胞MDC染色陽性率觀察圖。其中，與空白血清組比較，#P <0.01。圖3是激光共聚焦顯微鏡下GY II及其拆方含藥鼠血清對MCF7細胞LC3II蛋白表達的影響圖。 其中，1-6分別為空白、全方、益氣、活血、解毒、雞血藤含藥血清組。
具體實施例方式下面結合附圖并通過具體實施方式
來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅用于幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。實施例I固本抑瘤II號由黨參、茯苓、生白術、生黃芪、川芎、雞血藤等13味藥組成，均購于北京中醫醫院中藥房。全方組分別加10倍水煎煮45分鐘，兩次，合并藥液，濃縮至生藥I. 5g/mL。益氣組(黨參、茯苓、白術、生黃芪、女貞子、枸杞子、仙靈脾)水煎濃縮至生藥 O. 825g/mL，活血組(川芎、雞血藤、莪術)水煎濃縮至生藥O. 375g/mL，解毒組(腫節風、苦參、浙貝母)水煎濃縮至生藥O. 315g/mL，雞血藤組水煎濃縮至生藥O. 225g/mL。該工作在北京市中醫研究所生藥室完成。將Wistar大鼠隨機分為6組，每組10只，2-6組大鼠分別按13mL/kg灌胃給予2_6 號水煎劑，空白對照組給予等體積生理鹽水灌胃，早晚各一次，連續5次。末次灌胃Ih后， 2%異戊巴比妥鈉(O. 2mL/100g)麻醉后腹主動脈取血，室溫靜置2h，3500r/min離心20min，分離分裝血清，經56°C滅火30min，_80°C保存備用。實施例2實驗動物健康清潔級雌性Wistar大鼠60只，體質量(211 ± 11) g，由中國中醫科學院提供，質量合格證號為SCXK (京)2009-0007。藥物固本抑瘤II號由黨參、茯苓、生白術、生黃芪、女貞子、枸杞子、仙靈脾、川芎、雞血藤、莪術、腫節風、苦參、浙貝母13味藥組成，均購于北京中醫醫院中藥房。分組固本抑瘤II號全方組(Q)益氣組⑴(黨參、茯苓、白術、生黃芪、女貞子、枸杞子、仙靈脾)活血組(H)(川芎、雞血藤、莪術)解毒組(J)(腫節風、苦參、浙貝母)雞血藤組(D)(單味藥雞血藤)空白對照組(C)C組給與正常鼠血清；Q、Y、H、J、D組分別給與固本抑瘤II號、益氣組、活血組、解毒組、雞血藤組中藥的含藥鼠血清。MDC及Hoechst 33342雙染色熒光顯微鏡觀察細胞爬片培養24h，各組含藥血清作用48h后，甲醇固定，O. lmmol/LMDC染液染色，37°C溫育60min ;MDC染色45min時加入 5yL Hoechst 33342 (10 μ g/mL)，繼續37°C溫育60min。PBS洗細胞，吸去上清，封片，熒光顯微鏡下觀察(激發濾色片365nm、分光鏡395nm、吸收濾色片420nm)，數碼相機拍照，在40 倍光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，計數陽性細胞。MDC陽性見核周區域呈綠色點狀染色。頭驗結果顯不MDC及Hoechst 33342雙染色(圖I，圖2)滅光顯微鏡結果顯不， 活血組、解毒組、雞血藤組含藥血清干預MCF7細胞24h后，MDC染色陽性細胞率明顯高于空白血清組(P < O. 01)。實施例3實驗動物、藥物及分組見實驗2。①細胞爬片培養24h ;②加入各組20%含藥血清作用48h ;③甲醇固定，O. lmmol/L MDC 染液染色，37°C溫育 60min ；@ MDC 染色 45min 時加入 5 μ LHoechst 33342 (10 μ g/ml)， 繼續37°C溫育60min PBS洗細胞，吸去上清，封片；⑥熒光顯微鏡下觀察(激發濾色片 365nm、分光鏡395nm、吸收濾色片420nm),數碼相機拍照,在40倍光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，計數陽性細胞。MDC陽性見核周區域呈綠色點狀染色。結果顯示，活血組、解毒組、雞血藤組含藥血清作用于MCF7細胞24h后，LC-3II染色陽性細胞率明顯高于空白血清組(圖3)。申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細技術方案，但本發明并不局限于上述詳細技術方案，即不意味著本發明必須依賴上述詳細技術方案才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
權利要求
1.一種固本抑瘤II號作為制備調控自噬抗腫瘤藥物的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于，所述調控自噬抗腫瘤藥物為誘導腫瘤細胞自噬性死亡藥物，生物毒化療藥物增敏的藥物，自噬性免疫療法抗腫瘤藥物，和/或誘導自噬缺陷細胞死亡的藥物。
3.固本抑瘤II號作為制備誘導腫瘤細胞自噬性死亡藥物的應用。
4.固本抑瘤II號作為制備生物毒化療藥物增敏的藥物的應用。
5.固本抑瘤II號作為制備自噬性免疫療法抗腫瘤藥物的應用。
6.固本抑瘤II號作為制備誘導自噬缺陷細胞死亡的藥物的應用。
7.如權利要求1-6任一項所述的應用，其特征在于，所述固本抑瘤II號可以是全方組、 益氣組、活血組、解毒組或雞血藤組。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述全方組由黨參15重量份、茯苓10重量份、白術10重量份、生黃芪30重量份、女貞子15重量份、枸杞子15重量份、仙靈脾10重量份、川芎10重量份、雞血藤30重量份、莪術10重量份、苦參12重量份、腫節風15重量份和浙貝母15重量份組成；所述益氣組由黨參、茯苓、白術、生黃芪、女貞子、枸杞子和仙靈脾組成；所述活血組由川芎、雞血藤和莪術組成；所述解毒組由苦參、腫節風和浙貝母組成；所述雞血藤組為單味藥雞血藤。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于,所述全方組由黨參15g、獲茶10g、白術10g、 生黃芪30g、女貞子15g、枸杞子15g、仙靈脾10g、川芎10g、雞血藤30g、莪術10g、苦參12g、 腫節風15g和浙貝母15g組成。
全文摘要
本發明公開了固本抑瘤II號含藥血清誘導腫瘤細胞自噬的用途。所述的固本抑瘤II號含藥血清可用作自噬誘導物，應用于抗腫瘤藥物的研發，開拓了固本抑瘤II號的新用途，為制備通過調控自噬抗腫瘤的藥物提供了新選擇。
文檔編號A61P37/04GK102580001SQ201210078710
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者于明薇, 張甘霖, 楊亨, 楊國旺, 王笑民 申請人:首都醫科大學附屬北京中醫醫院