專利名稱：紅景天在預(yù)防和治療肌萎縮疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物藥紅景天的新用途，具體涉及紅景天或紅景天提取物在預(yù)防和治療肌萎縮疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨骼肌按照本身的代謝類型特性可分為慢肌和快肌，分別由慢肌纖維蛋白和快肌纖維蛋白組成。生理狀態(tài)下，骨骼肌蛋白及其快慢肌纖維蛋白的合成和降解處于動態(tài)平衡。但臨床肌營養(yǎng)不良性疾病(如杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓側(cè)索硬化癥等)、廢用性肌萎縮(長期臥床、外傷制動、航天飛行中失重性肌萎縮等)、去/失神經(jīng)性肌萎縮、老年性肌萎縮、惡性疾病(如癌癥晚期惡病質(zhì)、心臟衰竭、腎衰竭、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、艾滋病及長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等疾病)晚期的肌萎縮等，骨骼肌蛋白質(zhì)代謝失衡，表現(xiàn)為骨骼肌重量明顯減輕、肌纖維橫截面積的減小、肌纖維類型相關(guān)蛋白(即慢肌纖維蛋白和快肌纖維蛋白)的選擇性丟失等特征性改變，導(dǎo)致肌力下降、運動障礙、易疲勞和代謝紊亂等，嚴(yán)重影響日常工作和生活。但目前臨床尚無很好的治療方法。骨骼肌中蛋白質(zhì)的含量占到了肌肉總重量的80%以上，骨骼肌的生理功能主要由蛋白質(zhì)完成，因此，骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的平衡在維持骨骼肌以及機體的正常狀態(tài)和功能中起著關(guān)鍵的作用。國內(nèi)外研究表明，在肌萎縮過程中，蛋白質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡受到破壞，蛋白質(zhì)降解增加是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的根本原因(Russell AP, Clinical and ExperimentalPharmacology and Physiology，37，378 - 384，2010;Glass DJj Curr Opin Clin Nutr MetabCare 13:225 - 229，2010)。目前已公認(rèn)，包括骨骼肌營養(yǎng)不良性疾病、廢用性肌萎縮、去神經(jīng)性肌萎縮以及癌癥晚期惡病質(zhì)和艾滋病等嚴(yán)重疾病并發(fā)性肌萎縮等幾乎所有類型肌萎縮，其最終的共同改變是骨骼肌特異的萎縮因子Atoogin-I表達(dá)增加，骨骼肌蛋白降解大于合成，引起骨骼肌纖維橫截面積減小以及肌纖維類型相關(guān)蛋白改變，導(dǎo)致肌萎縮的發(fā)生(Bodine SC, et al. Science, 294:1704-1708, 2001;Foletta VC, et al. Pflugers Arch-Eur J Physiol, 461:325-335，2011)。因此，通過抑制Atrogin-1的表達(dá)、增加肌纖維橫截面積和調(diào)節(jié)肌纖維類型相關(guān)蛋白含量，可預(yù)防和治療骨骼肌萎縮疾病的發(fā)生發(fā)展，提高工作和生活能力。紅景天拉丁文學(xué)名Rhodiola rosea,英文名Roseroot,是景天科多年生草木或灌木植物，生長在海拔800-2500米高寒無污染地帶的珍稀野生植物。盡管已知紅景天素有“高原人參”的美稱，具有抗缺氧、抗輻射以及對神經(jīng)、認(rèn)知和決策能力等的調(diào)節(jié)保護(hù)作用，可開發(fā)應(yīng)用于深海、高原等特殊環(huán)境中的工作人員，以提高機體對惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力，故稱為“適應(yīng)原”藥材(Panossian A, et al. Phytother Res, 19 (10) : 819-38，2005)。但迄今為止，未見紅景天作為主要有效成分用于預(yù)防和治療骨骼肌萎縮的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)紅景天的新用途。具體目的是通過實驗證明紅景天能夠抑制肌萎縮發(fā)生過程中肌萎縮特異因子Atoogin-I的表達(dá)、骨骼肌纖維橫截面積的減少，并能調(diào)控肌萎縮中肌纖維類型相關(guān)蛋白的含量，使慢肌纖維蛋白增加和快肌纖維蛋白減少，從而對抗肌萎縮的發(fā)生。最終用紅景天制備出預(yù)防和治療骨骼肌萎縮性疾病的藥物。本發(fā)明用以下實驗證實了紅景天的新功能I、抑制肌肉萎縮過程中萎縮特異因子Atrogin-I的表達(dá)喂食安慰劑對照組及紅景天組獼猴，-10度頭低位臥床28天后，利用實時定量real time PCR方法,檢測肌萎縮特異因子Atrogin-1 mRNA表達(dá)的變化,檢測結(jié)果表明
對照組獼猴肌萎縮特異因子AtIOgin-ImRNA的表達(dá)增加了 I. 3倍(#Ρ〈0· 01)；紅景天組獼猴比目魚肌內(nèi)Atrogin-ImRNA的表達(dá)僅增加67% (**Ρ<0. 01)，與對照組相比，Atrogin-ImRNA的表達(dá)受到了明顯抑制($Ρ〈0. 05)。詳見實驗一。2、抑制肌肉萎縮過程中肌纖維橫截面積的減小用安慰劑或紅景天提取物，按照O. lg/kg的劑量每日喂食獼猴，對照組獼猴頭低位臥床28天后，比目魚肌肌纖維橫截面積比臥床前下降了 22%(#P〈0. 01)，而喂食紅景天實驗組獼猴比目魚肌肌纖維橫截面積下降僅6. 8% (*P<0. 05);下降率較未喂食紅景天對照組獼猴的變化顯著減少($$P〈0. 01)，提示紅景天對抗了肌萎縮形成中肌纖維橫截面積的下降，即抑制了肌纖維的萎縮。詳見實驗二。3、抑制肌肉萎縮過程中慢肌纖維蛋白的丟失和快肌纖維蛋白的增加對照組獼猴頭低位臥床28天后，比目魚肌內(nèi)慢肌纖維標(biāo)志性蛋白(TiOponinI-SS)的表達(dá)相對于臥床前(O天)減少了 26% (**P<0. 01),快肌纖維蛋白增加；而喂食紅景天實驗組稱猴比目魚肌內(nèi)慢肌纖維標(biāo)志性蛋白(Troponin I_SS)的表達(dá)相對于臥床前(O天)增加了 15% (*P〈0. 05)，與對照組臥床后相比增加了 55% (##P〈0. 01);快肌纖維標(biāo)志性蛋白(Troponin I_FS)的表達(dá)與對照組臥床后相比減少了 15% (#P〈0. 05)。提示紅景天抑制了肌萎縮形成過程中慢肌纖維蛋白的丟失和快肌纖維蛋白的增加。詳見實驗三。以上實驗所用受試品紅景天提取物，購買自北京四環(huán)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號軍藥證字Z2009001。本發(fā)明的有益效果是首次發(fā)現(xiàn)和證實了紅景天對于治療肌肉萎縮性疾病的新功能。本發(fā)明通過實驗證明紅景天能夠抑制肌肉萎縮發(fā)生過程中肌萎縮特異因子的表達(dá)和肌纖維橫截面積的減小。并發(fā)現(xiàn)紅景天具有抑制肌萎縮的慢肌纖維減少和快肌纖維增加的作用。而抑制肌萎縮特異因子的表達(dá)，增加肌纖維橫截面積和肌肉中慢肌纖維蛋白含量是公認(rèn)的改善肌萎縮狀態(tài)的先決條件。因此，本發(fā)明證明了利用紅景天作為原料藥物可用于制備預(yù)防和治療肌肉萎縮性疾病的藥物。


圖I. Real time PCR檢測對照組及喂食紅景天組獼猴頭低位臥床28天前后比目魚肌內(nèi)肌萎縮特異因子Atrogin-1 mRNA的表達(dá)變化。圖2.組織免疫熒光顯示對照組及喂食紅景天組獼猴頭低位臥床前(O天)及臥床28天后比目魚肌肌纖維的橫截面積。圖3. Image-Pro Plus6. O軟件統(tǒng)計對照組及喂食紅景天組獼猴頭低位臥床前(O天)及臥床28天后比目魚肌肌纖維的橫截面積的變化。圖4. Western blot檢測對照組及喂食紅景天組獼猴頭低位臥床28天前后比目魚肌內(nèi)快、慢肌纖維蛋白(Troponin I-FS、Troponin I-SS)的表達(dá)變化。Troponin IFS和Troponin I-SS是肌鈣蛋白抑制亞單位存在于快肌纖維和慢肌纖維中的亞型，分別可以反映快肌纖維蛋白和慢肌纖維蛋白的含量；beta Actin為內(nèi)參，可以反映總蛋白上樣量的一致。圖5. Image-Pro Plus6. O軟件統(tǒng)計對照組及喂食紅景天組獼猴頭低位臥床前(O天)及臥床28天后比目魚肌內(nèi)慢肌纖維蛋白的相對表達(dá)量。圖6. Image-Pro Plus6. O軟件統(tǒng)計對照組及喂食紅景天組稱猴頭低位臥床前(O天)及臥床28天后比目魚肌內(nèi)快肌纖維蛋白的相對表達(dá)量。
具體實施例方式以下實驗中所用的實驗動物及材料來源如下實驗動物獼猴30只，年齡6-8歲，體重10-11公斤，體長85_95厘米，雄性。北京協(xié)爾鑫生物資源研究所提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK (京)2010-0007。受試藥物紅景天提取物膠囊。受試品紅景天提取物，購買自北京四環(huán)制藥有限公司。其原料為景天科植物大株紅景天Rhodiola Kirilowii (Regel)Regel的干燥根及根莖，主要產(chǎn)地為西藏、四川、青海，本品符合中國藥典2005版紅景天項下有關(guān)規(guī)定。其它材料來源組織包埋劑購自Thermo公司；兔源Iaminin抗體購自Abcam公司；羊抗兔FITC突光標(biāo)記二抗購自Invitrogen公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；SYBR 購自 ABI 公司。兔源Troponin I-SS抗體購自Aviva公司；兔源Troponin I-FS抗體購自Aviva公司；兔源beta actin 抗體購自 Santa Cruz 公司；主要器械Bio_Rad電泳儀，Bio-Rad電泳槽及濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)槽，ABI Step-one plusreal time PCR儀，三洋冰凍切片機，Leica激光共聚焦顯微鏡。實驗一紅景天對獼猴肌萎縮形成過程中肌萎縮特異因子AtiOgin-I表達(dá)的影響I.實驗?zāi)康谋緦嶒炌ㄟ^提取對照組及紅景天組獼猴臥床前后比目魚肌RNA，利用realtimePCR的方法，檢測紅景天對獼猴肌萎縮形成過程中比目魚肌內(nèi)肌肉萎縮特異因子Atrogin-I基因水平表達(dá)的影響。2.實驗方法2. I獼猴骨骼肌萎縮模型的建立及分組按照國際動物實驗倫理學(xué)和操作規(guī)程要求，根據(jù)國際公認(rèn)的獼猴骨骼肌萎縮模型方法(Shenkman BS, et al. J Gravit Physiol. 7 (2) :P101_2, 2000),制備本實驗所用的稱猴骨骼肌萎縮模型。主要步驟為通過綁定的方式安全可靠地將獼猴固定于實驗床，其裝置能精確固定獼猴于一 10°頭低位臥床狀態(tài)，飲食裝置滿足獼猴在此臥床狀態(tài)下可自由取食、飲水。實驗室過程中，最大限度地減少生理損傷和應(yīng)激反應(yīng)，使受試獼猴心理感受平穩(wěn)，確保獼猴的基本生活和生理體征相對穩(wěn)定。將30只獼猴按照年齡和體重相近的原則分為兩組，在頭低位臥床28天期間，按照O. lg/kg的劑量每日喂食安慰劑或紅景天膠囊。2. 2組織取材獼猴頭低位臥床前(O天)及28天后，將對照組及喂食紅景天組獼猴用異氟烷將動物全身麻醉，在無菌外科手術(shù)間，按照文獻(xiàn)實驗方法(Fitts RH, et al.Am J PhysiolRegulatory Integrative Comp Physiol, 279: R1546 - R1557, 2000)取材。重要步驟為用外科剪分別在左側(cè)(O天)及右側(cè)(28天)下肢外側(cè)中段剪開一 3-4cm切口，鈍性分離以暴露比 目魚肌，用外科剪或手術(shù)刀循肌纖維走向橫向切取比目魚肌，用于后續(xù)研究。2. 3組織RNA的提取、檢測與定量A、組織裂解取50_100mg組織加入到Iml Trizol中研磨，注意樣品總體積不要超過Trizol體積的10%，待充分勻漿后放置30min.B、各相分離按0. 2ml氯仿/lml Trizol的比例加入氯仿，蓋緊劇烈混勻15秒，室溫放置2-3分鐘。4°C，12000g離心15分鐘。之后吸取上清水相置于另一新的EP管中。C、沉淀RNA:按0. 5ml異丙醇/lml Trizol的比例，向吸取的水相中加入異丙醇，顛倒混勻，室溫放置15分鐘。4°C，12000g離心10分鐘得到RNA沉淀。D、漂洗RNA:棄去上清，按lml75%乙醇/lml Trizol的比例，加入75%的乙醇洗滌RNA沉淀兩次，然后4°C，7500g離心沉淀5分鐘，棄去上清。E、重溶RNA:室溫空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘，以適量DEPC水溶解RNA沉淀，550C -60°C水溶10分鐘。F、RNA純度檢測及定量取I μ I RNA溶液加入99 μ I DEPC水中混勻，用紫外分光光度計測定Α260/Α280的比值和濃度。2. 4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)25 μ L反應(yīng)體系操作步驟a取0. 5mL EP管，依次加入oligodT LOyLRNA 樣品 2. Oyg 加入DEPC水至總體積8 μ L。b 輕甩后，70°C IOmin,放 _20°C 3 5min,輕甩。c在a管內(nèi)加入5 X Buffer 5 μ LdNTP 10 μ LRNasin I μ LM-MLV I μ Ld42°C 90min, 95 °C IOmin
e合成的cDNA于_20°C保存?zhèn)溆谩?. 5引物設(shè)計根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫序列利用DNAMAN軟件設(shè)計引物，然后根據(jù)退火溫度和序列特異性選擇合適的引物進(jìn)行合成(見表I)。表I目的基因Atrogin-I及內(nèi)參GAPDH引物序列
權(quán)利要求
1.紅景天在制備預(yù)防和治療肌萎縮的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述肌萎縮是骨骼肌纖維橫截面積減小。
3.權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述肌萎縮是肌萎縮特異因子(Atrogin-I)表達(dá)的增加。
4.權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述肌萎縮是慢肌纖維蛋白含量減少。
5.權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述肌萎縮是快肌纖維蛋白含量增加。
6.權(quán)利要求I 5中任一所述的應(yīng)用，所述紅景天包括紅景天提取物。
7.一種預(yù)防和治療肌萎縮的藥物，制成有效成分的原料是紅景天或紅景天提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及紅景天在預(yù)防和治療肌萎縮疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明通過實驗證明紅景天能夠抑制肌萎縮發(fā)生過程中肌萎縮特異因子Atrogin-1的表達(dá)、骨骼肌纖維橫截面積的減少，并能調(diào)控肌萎縮中肌纖維類型相關(guān)蛋白的含量，使慢肌纖維蛋白增加和快肌纖維蛋白減少，從而對抗肌萎縮的發(fā)生。因此，本發(fā)明證明了利用紅景天作為活性成分可制備預(yù)防和治療骨骼肌萎縮性疾病的藥物。
文檔編號A61P21/00GK102727560SQ201210236548
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者劉紅菊, 張鵬, 白延強, 范明, 闞光捍, 陳曉萍, 高月 申請人:中國航天員科研訓(xùn)練中心