專利名稱：一種沙棘提取物及其制備方法與在抑制脂肪酸合酶活性中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種沙棘提取物及其制備方法與在抑制脂肪酸合酶活性中的應用。
背景技術：
脂肪酸合酶是生物細胞內合成脂肪過程中最重要的酶。田維熙等對家禽脂肪酸合酶的研究發現，家禽腹腔的脂肪水平和脂肪酸合酶活性有很高的正相關，并提出控制脂肪酸合酶活性是控制動物體脂水平的有效方法的理論(田維熙，1994.動物的體脂水平和脂肪酸合酶活性的調控.生命的化學，14，(I) :184;田維熙等，1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合酶活性的關系.生物化學雜志，12(2) :234-236;Mei Li et al. . 1999. Factors influencing the levels of fatty acid synthase complex activity in fowl.Biochemistry and Molecular Biology International, 47 (I) : 63-69)。2000 年，霍普金斯大學Loftus等對小鼠脂肪酸合酶的研究結果證明，抑制脂肪酸合酶可造成丙二酸單酰輔酶A的積累，而后者抑制與進食相關的下丘腦神經肽Y的表達，在不影響小鼠活動能力的情況下使食欲下降，體重降低。T. Loftus等指出，脂肪酸合酶可以作為控制體重潛在的治療靶位(Loftus. T. M. et al.，2000. Science, 288(5475) :2379-2381)。此外，許多研究發現脂肪酸合成酶(FAS)的活性和表達在幾乎所有的非病態成人組織中表現出極低的水平，而在許多類型的癌組織如直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等中其活性顯著提高，表達顯著上調。同時，還有研究發現FAS的抑制劑cerulenin能夠殺死癌細胞和阻礙異種移植瘤的生長，其他FAS抑制劑如cerulenin的衍生物C75、β -內酯orlistat、EGCG及其他天然來源的黃酮類化合物如luteolin、quercetin、kaempferol等和抗生素triclosan也已被確認可以通過誘導細胞凋亡抑制腫瘤細胞的生長。以上結果表明，脂肪酸合酶可能是潛在的治療肥胖癥和腫瘤的雙重靶點。因此，研制和開發脂肪酸合酶的抑制劑將具有重大的現實意義及開發潛力。沙棘(Hippophaerhamnoides Linn.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)的一種落葉灌木，不僅是一種被廣泛用于水土保持的生態植物資源，而且是一種傳統的藥食兩用的植物資源。根據藏醫巨著《四部醫典》的記載，沙棘具有止咳、平喘、活血化瘀、治療胃潰瘍等功效。現有研究報道，沙棘可降低膽固醇，緩解心絞痛發作，還有防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。中國專利CN102000284A公開了一種以沙棘果汁為主要原料配以其他植物的提取液后制備成具有止咳功效的口服液。公開號CN102228545A的中國專利發明了一種沙棘水煎液為主，配以鹿茸、黃芪、桅子、肉桂、大棗等植物水煎液后制備成具有治療消化性潰瘍功能的口服液。又如公開號CN101897967A的中國專利發明了一種治療血脂異常的沙棘復方制劑。以上專利中發明的藥物制劑，都是基于沙棘的傳統藥用功效。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種沙棘提取物的制備方法。本發明提供的方法，包括如下步驟I)將沙棘果實依次經去除果汁和脫脂處理，得到脫脂后沙棘籽皮混合物；2)將步驟I)得到的脫脂后沙棘籽皮混合物和有機溶劑A水溶液混勻，得到混合液，再將所述混合液經酸化處理得到酸化混合液；所述有機溶劑A水溶液為乙醇水溶液、丙醇水溶液、甲醇水溶液和丙酮水溶液中的任意一種； 3)將步驟2)得到的酸化混合液超聲，收集超聲產物，即得到沙棘提取物。上述方法步驟I)中，所述脫脂為用有機溶劑B對所述沙棘果實去除果汁后的產物進行回流提取；步驟2)中，所述酸化處理為將所述混合液的pH值調至I. 5-3. 5 ；步驟3)中，所述超聲功率大于100W ;所述超聲的方式為超聲1-3次，每次超聲為持續超聲，每次所述持續超聲的時間為10-30min。上述方法中，步驟I)中，所述有機溶劑B為石油醚；
步驟2)中，所述有機溶劑A水溶液的濃度為50%_75% (體積百分含量)。上述方法中，步驟I)中，所述回流提取的溫度為30_90°C，時間為7-12小時；步驟2)中，所述脫脂后沙棘籽皮混合物和所述有機溶劑A水溶液的配比為Ig:5_20ml ；所述調節pH值的試劑具體為乙酸、鹽酸、甲酸、三氟乙酸中的任意一種。上述方法中，步驟I)中，在所述去除果汁后和所述脫脂前還包括粉碎的步驟；步驟3)中，在所述收集超聲產物的步驟后，還包括如下步驟先向所述超聲產物中加入乙酸乙酯進行萃取，收集有機相，再去除乙酸乙酯，得到沙棘提取物。上述萃取為在室溫(25°C )下萃取，并靜止待自然分層。上述方法中的所述超聲產物和所述乙酸乙酯的體積比為I: (1-4)。上述方法中，在所述收集超聲產物的步驟后和所述先向所述超聲產物中加入乙酸乙酯進行萃取的步驟前，還包括去除所述超聲產物中所述有機溶劑A的步驟。上述方法中，去除乙酸乙酯和去除所述超聲產物中所述有機溶劑A均采用在30-55°C、壓力為O. 01-0. IMPa的條件下減壓壓縮。由上述的方法制備的沙棘提取物也是本發明保護的范圍。上述的沙棘提取物在抑制脂肪酸合酶或制備抑制脂肪酸合酶產品或制備用于減肥產物或制備用于抗癌產品中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的另一個目的是提供一種脂肪酸合酶抑制劑。本發明提供的脂肪酸合酶抑制劑，其活性成分為上述的沙棘提取物。本發明的實驗證明，本發明與現有技術相比具有以下優點I、本發明從沙棘中可制取得到一種可以抑制的脂肪酸合酶活性的提取物，是一種天然的、植物源的、無毒的脂肪酸合酶抑制劑；2、本發明得到的提取物可以顯著地抑制脂肪酸合酶的活性，其活性大小比目前已知的幾種脂肪酸合酶抑制劑，如cerulenin、EGCG、槲皮素、鞣花酸等，高出10-250倍；
3、由于脂肪酸合酶活性的強弱直接影響到生物細胞內合成脂肪的多少和腫瘤細胞合成脂肪酸的能力，因此，抑制脂肪酸合酶的活性，一方面可以使生物細胞內合成脂肪的過程弱化，脂肪含量即會得到控制甚至減少；另一方面可以使腫瘤細胞合成脂肪酸的能力下降，從而可以抑制腫瘤細胞的生長；因此，以本發明的提取物作為活性成分制成各種劑型的減肥藥物或抗癌藥物具有功效活性顯著、作用機理清楚、靶點明確等特點，符合藥物制劑開發的要求；
4、由于沙棘是一種傳統的藥食兩用的植物資源，用本發明從沙棘中制取的提取物作為原料制成減肥或抗腫瘤的保健食品、功能化妝品、普通食品等，符合國家對于保健食品及普通食品的原料的限定和法規要求，因此，本發明的具有抑制脂肪酸合酶活性的提取物具有更為廣闊的應用開發前景。總之，本發明不僅豐富了純天然脂肪酸合酶抑制劑的來源，也開拓了具有地域特色和資源優勢的沙棘植物新的功效及應用價值。


圖I為本發明提取物與幾種目前已知的脂肪酸合酶抑制劑的半抑制濃度的對比結果圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例是對本發明的進一步詳細說明，但不意味著對本發明的任何限制。在不脫離本發明上述思想的情況下，根據本領域普通技術知識和常規手段做出的各種替換方式或變更，均包含在本發明之內。實施例I、沙棘提取物的獲得及檢測I、沙棘提取物的獲得及檢測I)將沙棘果實榨去果汁、粉碎過20目后，再用石油醚在溫度30°C下回流提取7個小時脫脂，得到脫脂后沙棘籽皮；2)向步驟I)得到的脫脂后沙棘籽皮中按料液比Ig 15ml (質量體積比)加入50%(體積百分含量)的乙醇，再加乙酸調節至PH值為I. 5，得到酸化混合液；3)將步驟2)得到的酸化混合液于常溫下(25°C)超聲提取(XH-2008DE超聲波萃取儀，北京祥鵠科技發展有限公司)，超聲功率200W，提取3次，每次持續lOmin，收集合并提取液，并于溫度為35°C、壓力為O. OSMPa的條件下減壓濃縮至無醇味(除去乙醇)，得到粗提液；4)向步驟3)得到的粗提液中加入4倍體積的乙酸乙酯，在室溫(25°C)下進行萃取并靜止待自然分層，收集有機相于溫度為35°C、壓力為O. OSMPa的條件下減壓濃縮至揮盡溶劑，干燥至恒重，即得到沙棘提取物A。2、沙棘提取物的檢測I)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)的制備脂肪酸合酶FAS的粗提新鮮雞肝臟稱重后按1:1.8 (g/mL)加入4°C的抽提緩沖液(O. lmol/L KH2PO4-K2HPO4, ImmoI/L EDTA, ImmoI/L DTT，O. 07mol/L KHCO3, ρΗ8·0)，勻漿50秒。測量勻漿液體積后以8000r / min速度4°C下離心15min。上清液經紗布過濾，測量體積后，再以35000r / min速度4°C下離心30min。上清液經紗布過濾后分裝于耐低溫塑料瓶_20°C過夜，剩余置于_80°C保存備用。硫酸銨分步沉淀將冷凍的高速離心上清液置水浴化凍，化凍后置于冰盒中，磁力攪拌狀態下按三分之一體積量滴加4°C的pH7. O的飽和硫酸銨(含lmmol/L DTT)至25%飽和度。攪拌IOmin后用10000r/min速度4°C下離心15min,棄去沉淀。取樣測定上清液的FAS活性。再于攪拌狀態下滴加上清液四分之一體積的4°C pH7. O的飽和硫酸銨(含lmmol/LDTT)至40%飽和度，攪拌IOmin后用10000r/min離心15min。若測定上清中不含或只含很少FAS活性,棄去上清,保留沉淀。
離子交換層析DEAE纖維素DE52經處理后用4°C緩沖液A(5mmol/L KH2PO4-K2HPO4含lmmol/L EDTA, lmmol/L DTT，pH7. O)平衡。上述沉淀控干后溶于適量4°C緩沖液A，測定電導值不大于5. 5ms/cm即可上樣。上樣后用4°C緩沖液A洗滌至雜蛋白的吸收為0，再依次用 4°C 50mmol/L、160mmol/L、250mmol/L、lmol/L KH2PO4-K2HPO4 緩沖液(皆含 lmmol/L EDTA,lmmol/L DTT, pH7.0)洗脫。分別收集洗脫峰，測量體積、蛋白含量及FAS活性。層析過程使用LKB蛋白監測儀和記錄儀監測。親和層析BlueSepharose6B 樹脂用 4°C 緩沖液 B (50mmol/L KH2PO4-K2HPO4 含lmmol/L EDTA, lmmol/L DTT, ρΗ7·0)平衡。將 DEAE 層析的 250mmol/L KH2PO4-K2HPO4 緩沖液洗脫收集液上樣。上樣后用4°C緩沖液B洗滌，再依次用4°C含0. 35mol/L,2mol/L NaCl緩沖液B洗脫。分別收集洗脫峰，測量體積、蛋白含量及FAS活性。濃縮保存攪拌狀態下按含有0. 35mol/LNaCl緩沖液B洗脫收集液三分之二體積緩慢加入4°C飽和硫酸銨溶液至40%飽和度以沉淀FAS。攪拌IOmin后以10000r/min速度4°C下離心15min。棄去上清液，控干沉淀后溶于少量儲存緩沖液(0. ImoI/LKH2PO4-K2HPO4,lmmol/L EDTA, IOmmoI/L DTT，20% 甘油，pH7. 0)中，使 FAS 濃度在 10mg/mL 左右，取少量樣品測定蛋白濃度和FAS活性，其余分裝完畢后經-20°C過夜后轉置_80°C冷凍保存備用，得到脂肪酸合酶。脂肪酸合酶活性采用乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、NADPH為底物的標準測活方法進行測定(W. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem.，260(20) :11375-11387 ；田維熙等，1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合酶活性的關系.生物化學雜志，12(2):234-236)。以上分離提純過程的所有步驟均在4_8°C低溫下進行。終樣品脂肪酸合酶經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，分子量為270kD。2)沙棘提取物對脂肪酸合酶的抑制作用取10. 9mg由I得到的沙棘提取物A溶于218mlDMS0中作為受試樣品溶液；脂肪酸合酶活性采用乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、NADPH為底物的標準測活方法進行測定(w. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem.，260(20) :11375-11387 ；田維熙等，1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合酶活性的關系.生物化學雜志，12(2):234-236)。
將一定濃度的待測樣品溶液加入測活體系中，37°C恒溫，然后加入一定量的由I)得到的FAS啟動反應，測得酶活性為Aitl加樣品溶劑對照測得的酶活性是AyAiAtl即為FAS的剩余活性(Remaining Activity, R. A.)。該值越小,貝U表明樣品對FAS的抑制能力越強。這種方法測定的抑制作用通常情況下是可逆的，即表示抑制劑與酶的結合是非共價結合。脂肪酸合酶(FAS)活性被抑制的程度用IC50 (半抑制濃度)來表示，其計算方法為以底物中只加入相應提取溶劑的為對照，測定其脂肪酸合酶活性值，該值用A0表示，并設定其為100%。底物中加入脂肪酸合酶抑制劑提取液的為實驗組，測得其脂肪酸合酶活性的數值為A0的50%時，抑制劑的濃度為IC50值。該值越小，表明樣品對FAS的抑制能力越強。
結果表明沙棘提取物A對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為O. 087 μ g/mL。采用上述方法分別用脂肪酸合酶抑制劑cerulenin (淺藍菌素)、EGCG (表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、槲皮素、鞣花酸(均購自Sigma公司)進行實驗，將對脂肪酸合酶的半抑制濃度和沙棘提取物A對于脂肪酸合酶的半抑制濃度作圖如圖I所示，a為沙棘提取物A、b為cerulenin、c為EGCG、d為槲皮素、e為鞣花酸，可以看出，沙棘提取物A對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為O. 087 μ g/mL, cerulenin對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為20 μ g/mL、EGCG對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為24 μ g/mL、槲皮素對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為I. 3 μ g/mL、鞣花酸對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為I. 31 μ g/mL。從上述結果可以表明，沙棘提取物A對脂肪酸合酶的活性有強烈的抑制作用，并且所需的有效劑量很低。實施例2、沙棘提取物的獲得及檢測I、沙棘提取物的獲得及檢測I)將沙棘果實榨去果汁、粉碎過20目后，再用石油醚在溫度90°C下回流提取10個小時脫脂，得到脫脂后沙棘籽皮；2)向步驟I)得到的脫脂后沙棘籽皮中按料液比Ig 20ml加入60% (體積百分含量)的乙醇，再加10%的稀鹽酸，調節至pH值為3，得到酸化混合液；3)將步驟2)得到的酸化混合液于常溫下(25°C )超聲提取2次，超聲功率200W，提取3次，每次持續20min，收集合并提取液并于溫度為55°C、壓力為O. OlMPa的條件下減壓濃縮至無醇味(除去乙醇)，得到粗提液；4)向步驟3)得到的粗提液中加入I倍體積的乙酸乙酯，在室溫(25°C)下進行萃取并靜止待自然分層，收集有機相于溫度為55°C、壓力為O. OlMPa的條件下減壓濃縮至揮盡溶劑，經干燥得到沙棘提取物B。2、沙棘提取物的檢測I)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制備與實施例I的2的I)相同。2)沙棘提取物對脂肪酸合酶的抑制作用方法與實施例I的2的2)相同，結果表明沙棘提取物B對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為O. 082 μ g/mL。說明沙棘提取物B對脂肪酸合酶的活性有強烈的抑制作用，并且所需的有效劑量很低。實施例3、沙棘提取物的獲得及檢測I、沙棘提取物的獲得及檢測I)將沙棘果實榨去果汁、粉碎過20目后，再用石油醚在溫度60°C下回流提取12個小時脫脂，得到脫脂后沙棘籽皮；2)向步驟I)得到的脫脂后沙棘籽皮中按料液比Ig 5ml加入75% (體積百分含量)的乙醇，再加乙酸調節至pH值為3. 5，得到酸化混合液；3)將步驟2)得到的酸化混合液于常溫(25°C)下超聲提取I次，每次持續30min，收集合并提取液并于溫度為30°C、壓力為O. IMPa的條件下減壓濃縮至無醇味，得到粗提液；4)向步驟3)得到的粗提液中加入2倍體積的乙酸乙酯在室溫(25°C)下進行萃取 并靜止待自然分層，收集有機相于溫度為30°C、壓力為O. IMPa的條件下減壓濃縮至揮干溶齊U，經干燥得到沙棘提取物C。2、沙棘提取物的檢測I)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制備與實施例I的2的I)相同。2)沙棘提取物對脂肪酸合酶的抑制作用方法與實施例I的2的2)相同，結果表明沙棘提取物C對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為O. 078 μ g/mL。說明沙棘提取物C對脂肪酸合酶的活性有強烈的抑制作用，并且所需的有效劑量很低。
權利要求
1.一種沙棘提取物的制備方法，包括如下步驟 1)將沙棘果實依次經去除果汁和脫脂處理，得到脫脂后沙棘籽皮混合物； 2)將步驟I)得到的脫脂后沙棘籽皮混合物和有機溶劑A水溶液混勻，得到混合液，再將所述混合液經酸化處理得到酸化混合液； 所述有機溶劑A水溶液為乙醇水溶液、丙醇水溶液、甲醇水溶液和丙酮水溶液中的任意一種； 3)將步驟2)得到的酸化混合液超聲，收集超聲產物，即得到沙棘提取物。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述脫脂為用有機溶劑B對所述沙棘果實去除果汁后的產物進行回流提取； 步驟2)中，所述酸化處理為將所述混合液的pH值調至I. 5-3. 5 ； 步驟3)中，所述超聲功率大于IOOW ;所述超聲的方式為超聲1-3次，每次超聲為持續超聲，每次所述持續超聲的時間為10-30min。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述有機溶劑B為石油醚； 步驟2)中，所述有機溶劑A水溶液的濃度為50%-75% (體積百分含量)。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述回流提取的溫度為30— 90°C，時間為7-12小時； 步驟2)中，所述脫脂后沙棘籽皮混合物和所述有機溶劑A水溶液的配比為lg:5—20ml ； 所述調節pH值的試劑具體為乙酸、鹽酸、甲酸、三氟乙酸中的任意一種。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 步驟I)中，在所述去除果汁后和所述脫脂前還包括粉碎的步驟； 步驟3)中，在所述收集超聲產物的步驟后，還包括如下步驟先向所述超聲產物中加入乙酸乙酯進行萃取，收集有機相，再去除乙酸乙酯，得到沙棘提取物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述超聲產物和所述乙酸乙酯的體積比為 I: (1-4)。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于 在所述收集超聲產物的步驟后和所述先向所述超聲產物中加入乙酸乙酯進行萃取的步驟前，還包括去除所述超聲產物中所述有機溶劑A的步驟。
8.由權利要求1-7中任一所述的方法制備的沙棘提取物。
9.權利要求8所述的沙棘提取物在抑制脂肪酸合酶或制備抑制脂肪酸合酶產品或制備用于減肥產物或制備用于抗癌產品中的應用。
10.一種脂肪酸合酶抑制劑，其活性成分為權利要求8所述的沙棘提取物。
全文摘要
本發明公開了一種沙棘提取物及其制備方法與在抑制脂肪酸合酶活性中的應用。本發明提供一種沙棘提取物的制備方法，包括如下步驟1)將沙棘果實依次經去除果汁和脫脂，得到脫脂后沙棘籽皮混合物；2)將步驟1)得到的脫脂后沙棘籽皮混合物和有機溶劑A水溶液混勻，得到混合液，再將所述混合液酸化處理得到酸化混合液；所述有機溶劑A水溶液為乙醇水溶液、丙醇水溶液、甲醇水溶液和丙酮水溶液中的任意一種；3)將步驟2)得到的酸化混合液進行超聲提取，收集超聲產物，即得到沙棘提取物。本發明的實驗證明，本發明從沙棘中可制取得到一種可以抑制的脂肪酸合酶活性的提取物，是一種天然的、植物源的、無毒的脂肪酸合酶抑制劑。
文檔編號A61P35/00GK102755359SQ20121025134
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者王小艷, 王洪倫, 王祎, 田維熙, 索有瑞, 馬曉豐 申請人:中國科學院研究生院, 中國科學院西北高原生物研究所