專利名稱：一種多功能的金銀核殼納米顆粒及制備方法
技術領域：
本發明涉及納米顆粒的制備領域，特別是涉及一種兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒的室溫原位制備方法。
背景技術：
現代放射影像學成像技術的飛速發展，使得諸多傳統醫學難以根治疾病(如惡性腫瘤，動脈粥樣硬化)的早期診斷成為了可能，其中，計算機斷層掃描成像技術(ComputedTomography, CT)由于其單次成像時間短(小于IOs),空間分辨率高(最低O. 5mm),相對于磁共振成像，在保證圖像精度的同時，可以有效減弱運動偽影對數據采集的影響。然而，由于人體組織及血液對X射線的耗散能力差別較小，病變部位與周圍正常的基質較低的區分度 使得在CT圖像中難以有效辨識病灶邊界，從而影響術中對病灶位置及切除范圍的判斷。CT造影劑的使用有效解決了這一問題，通過注射具有對X射線具有較強衰減能力的有機碘水溶液，利用病變部位和周圍正常組織對造影劑吸收度的差別，來實現增強CT成像，然后，由于有機碘分子小分子化合物的本質，其血液循環時間短，快速的代謝不僅增大了腎臟毒性，同時削弱了有效機體顯影時間，針對這一問題，雖然可以通過脂質體包埋，或者修飾高分子鏈段等方式延長其血液循環時間，但是繁瑣的工藝以及較大的顆粒尺寸限制了其進一步臨床應用。金納米顆粒作為一種生物相容性良好的材料，由于同時兼具極高的X射線衰減能力以及成熟的表面修飾手段，其作為新型CT增強對比劑的應用受到研究者廣泛關注。Dongkyu Kim等以朽1檬酸鈉為還原劑，通過Frens法制備了平均粒徑為30nm的金納米顆粒，通過表面修飾末端巰基化的聚乙二醇分子，獲得了血液循環時間為4h的血池CT造影劑，以原發性肝癌小鼠作為動物模型，表明該金納米顆粒CT造影劑可以實現對病灶區域的有效區分(Dongkyu Kim, Sangjin Park, et al. J. AM. CHEM. S0C. 2007, 129，7661 7665)
Wolfgang Eck等同樣采用Frens法制備了 28nm及38nm兩種粒徑的金納米顆粒，通過表面偶聯F19單克隆抗體，制備了淋巴靶向的CT造影劑，以大白鼠為動物模型，可見淋巴結經尾靜脈注射金納米顆粒對比劑后CT下顯著增強顯影(Wolfgang Eck, Anthony I.Nicholson, et al, Nano Lett. 2010, 10, 2318 - 2322)。史向陽等采用聚酰胺-胺(PAMAM)樹枝狀大分子為模板，以硼氫化鈉為還原劑，控制性合成了金納米顆粒包埋的高分子-無機物CT造影劑復合物，以荷瘤鼠為動物模型，采取瘤內注射和腹腔內注射兩種方式，確認了該造影劑的 X 射線衰減性能。(Chen Peng, Xiangyang Shi, et al, Biomaterials33 (2012) 1107-1119)(專利申請號201010543835. 3)。然而上述的研究都忽視了一個問題，注射是臨床上造影劑介入最常用的方式，難以避免會留下創口，統計發現，創口或者創傷位置病原體感染是抗生素耐受性細菌最重要的致病途徑，以甲氧西林耐受性金黃色葡萄球菌為例，感染患者往往對一線及部分二線抗生素表現較強耐受，常規治療方案通常對其無效，且預后較差，而同時兼具抗感染及X射線裳減能力的CT造影劑目如尚無相關報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種兼具抗感染能力及CT造影功能的多功能金銀核殼納米顆粒及制備方法，該方法制備過程簡單，在室溫下快速進行，制備的顆粒尺寸高度均一，可使金銀納米顆粒長時間均勻分散于水溶液當中，同時表面的銀納米殼層可以有效抑制病原體的增殖。為達到上述目的，本發明是通過下述技術方案加以實現的金銀核殼結構納米顆粒，超細金納米顆粒，以銀納米殼層包裹的金金納米顆粒的銀核殼結構納米粒子，并以尾端巰基化修飾的聚乙二醇分子對銀核殼結構納米顆粒進行表面修飾。其中金納米核顆粒尺寸在Γ20 nm之間，銀納米殼厚度在2 12 nm之間。所述X射線衰減能力較強的金銀核殼結構納米顆粒，是以經過堿液活化的四羥甲基氯化磷為還原劑，首先還原氯金酸制備超細金納米顆粒，再以該納米粒子做為晶核，還原硝酸銀溶液，制備銀納米殼層包裹的金銀核殼結構納米粒子，再通過尾端巰基化修飾的聚乙二醇分子對金銀核殼結構納米顆粒進行表面修飾，制備出具有長效血液循環時間同時兼具的抗感染能力的CT造影劑·
本發明一種兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒的制備方法，是室溫原位制備方法，它包括以下步驟
(I)量取(如20-100 μ L)四羥甲基氯化磷溶液，加入O. 05、. 9mol/L的氫氧化鉀或氫氧化鈉水溶液中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液。(2)在上述步驟(I)的溶液中加入氯金酸溶液，攪拌條件下反應5_20min后，再加入硝酸銀溶液，繼續攪攪拌反應O. 5-2h,將反應后的溶液離心純化后，棄去上清液，產物用去離子水洗滌分散后，重復上述洗滌過程，最終得到純化產品其中金納米核顆粒尺寸在3^20nm之間，銀納米殼厚度在2 12nm之間，核殼納米顆粒的粒徑在5 30nm之間。優選的，所述的一種兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒的室溫原位制備方法，它包括以下步驟
(I)量取5 40 μ L四羥甲基氯化磷溶液，加入10 50 mL濃度為O. 05^0. 9mol/L的氫氧化鉀水溶液或2(Tl00 mL濃度為O. 05^1 mol/L氫氧化鈉水溶液中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液。(2)在上述步驟(I)的溶液中加入5(Γ400 μ L濃度為O. 01、. I mol/L的氯金酸溶液，攪拌條件下反應5-20 min后，再加入濃度為O. θΓθ. I mol/L硝酸銀溶液5(Γ300 μ L，其中氯金酸與硝酸銀物質量比在5 Γ1 :4之間，而后繼續攪拌反應0.5-2 h，將反應后的溶液離心純化后，棄去上清液，產物用去離子水洗滌分散后，重復上述洗滌過程，最終得到純化產品其中金納米核顆粒尺寸在:Γ20 nm之間，銀納米殼厚度在2 12 nm之間。(3)在上述步驟(2)離心純化前的溶液加入尾端巰基化的聚乙二醇(巰基聚乙二醇)，分子量在2 10 kDa之間，攪拌過夜后，可得到表面聚乙二醇修飾的金銀核殼結構納米顆粒，其中單個顆粒表面聚乙二醇平均包覆數量為3(Γ500個。本發明的有益效果在于，制備過程簡單，反應迅速無能耗，以此制得的金銀核殼結構復合物納米顆粒呈球形，尺寸均一，粒徑均一，水溶性好，無明顯團聚，平均粒徑在5 30nm之間，通過表面聚乙二醇修飾后，能夠均勻長時間分散于水溶液中；經靜脈注射體內分布實驗表明，其血液循環時間最長可達4h，體內器官CT數值表明其具備良好X射線衰減能力，體外抗菌試驗表明，該金銀核殼納米顆粒具備廣譜抗菌能力，有效細菌增殖抑制能力可保持72 h，對大腸桿菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢菌，金黃色葡萄球菌的致死率分別為98% 100%，92% 100%，94% 100%。90% 100%。該核殼納米顆粒的對X射線的耗散能力較強，體內試驗證明，其有效血池顯影時間可達到30min，優于傳統造影劑碘佛醇的CT有效顯影時間。體外營養肉湯稀釋以及瓊脂糖稀釋抗菌試驗比表明，金銀核殼納米顆粒具備優異的殺菌能力，可有效抑制細菌通過造影劑注射窗口對機體的感染。


圖I為金銀核殼結構納米顆粒透射電鏡圖； 圖2為金銀核殼結構納米顆粒水溶液紫外-可見光吸收光譜 圖3為金銀核殼結構納米顆粒X射線光電子能譜 圖4為金銀核殼結構納米顆粒增強CT數據。具體實施方法
下面對本發明具體實施方式
進行詳細說明，但是以下實施例僅僅是作為例證，并不對本發明構成任何限制，實施例1-3為本發明的制備例，實施例4為體內增強CT實驗，實施例5-6為抗菌效果實驗實施例I
量取20uL四羥甲基氯化磷溶液，加入20mL O. 05mol/L氫氧化鉀水溶液當中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液，攪拌5min后靜置待用。將50 UL O. Olmol/L氯金酸溶液迅速加入到上述還原性有機磷前體溶液當中，攪拌條件下反應IOmin后，加入200 μ L O. 01mol/L硝酸銀溶液，而后繼續攪拌反應2h，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產物經過去洗滌后重新分散在去離子水中，重復上述洗滌再分散過程至少三次，最終得到純化產品，重新分散在無水乙醇當中，得到棕黃色金銀核殼結構納米顆粒溶膠，平均粒徑為15nm，其中金納米核尺寸為5nm，銀納米殼層厚度為IOnm0實施例2
量取30uL四羥甲基氯化磷溶液，加入30mL O. 07mol/L氫氧化鈉水溶液當中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液，攪拌IOmin后靜置待用。將IOOyL O. 05mol/L氯金酸溶液迅速加入到上述還原性有機磷前體溶液當中，攪拌條件下反應20min后，加入150 μ L O. 05mol/L硝酸銀溶液，而后繼續攪拌反應I. 5h，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產物經過去洗滌后重新分散在去離子水中，重復上述洗滌再分散過程至少三次，最終得到純化產品，重新分散在無水乙醇當中，得到紅棕色金銀核殼結構納米顆粒溶膠，采用紫外-可見光吸收光譜對其進行分析，所制備的金銀核殼結構納米顆粒水溶液在XXnm處具有最大吸收，吸收峰形狀為尖峰，證明所制備的納米粒子尺寸分布很窄。實施例3
量取40 μ L四羥甲基氯化磷溶液，加入50mL O. 45mol/L氫氧化鉀水溶液當中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液，攪拌20min后靜置待用。
將200 μ L O. 08mol/L氯金酸溶液迅速加入到上述還原性有機磷前體溶液當中，攪拌條件下反應8min后，加入300 μ L O. 08mol/L硝酸銀溶液，而后繼續攪拌反應lh，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產物經過去洗滌后重新分散在去離子水中，重復上述洗滌再分散過程至少三次，最終得到純化產品，重新分散在無水乙醇當中，得到橙黃色金銀核殼結構納米顆粒溶膠，采用X射線光電子能譜對其進行表面組成元素進行分析，再全譜掃描中可見屬于金及銀單質的特征吸收峰，可見作為核的金納米顆粒特征峰是由于作為納米殼的銀厚度為5nm，小于X射線光電子能譜的IOnm檢測限度，使得作為內核的金元素被探測到。實施例4
量取40 μ L四羥甲基氯化磷溶液，加入50mL O. 45mol/L氫氧化鉀水溶液當中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液，攪拌20min后靜置待用。將200 μ L O. 08mol/L氯金酸溶液迅速加入到上述還原性有機磷前體溶液當中，攪拌條件下反應8min后，加入300 μ L O. 08mol/L硝酸銀溶液，而后繼續攪拌反應lh，向該溶液中加入IOmg分子量5KDa末端巰基化的聚乙二醇分子，攪拌過夜后，將反應后的溶液·離心純化，棄去上清液，產物經過無水乙醇洗滌后重新分散在去離子水中，重復上述洗滌再分散過程至少三次，最終得到純化產品，重新分散在磷酸緩沖溶液中，以成年健康Wista大鼠為模式動物(250g)，首先采集大白鼠CT平掃圖像，而后經靜脈注射Iml金銀核殼結構納米顆粒磷酸緩沖溶液分散液后(金含量10mg/mL)，30min后采集大白鼠的增強CT掃描圖像，分析造影劑注射前后相應器官的增強情況可以發現，主動脈，下腔靜脈，肺靜脈等大血管均獲得不同程度的明顯增強，肝實質相對較低的信號上升提示改核殼結構CT造影劑肝內巨噬細胞吞噬程度較低，對應更長的血液循環時間。
實施例5
量取40 μ L四羥甲基氯化磷溶液，加入50mL O. 45mol/L氫氧化鉀水溶液當中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液，攪拌20min后靜置待用。將400 μ L O. lmol/L氯金酸溶液迅速加入到上述還原性有機磷前體溶液當中，攪拌條件下反應8min后，加入250 μ L O. 08mol/L硝酸銀溶液，而后繼續攪拌反應30min，向該溶液中加入IOmg分子量5KDa末端巰基化的聚乙二醇(巰基聚乙二醇)，攪拌過夜后，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產物經過無水乙醇洗滌后重新分散在去離子水中，重復上述洗滌再分散過程至少三次，最終得到純化產品，重新分散在磷酸緩沖溶液中，采用營養肉湯稀釋法檢驗該金銀核殼納米顆粒的抑菌能力，銀元素濃度為25 μ g/mL時，可有效抑制106CFU/mL的大腸桿菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌的增殖，四種細菌的致死率分別為99%，100%，95%，94%。
實施例6
量取40uL四羥甲基氯化磷溶液，加入50mL O. 45mol/L氫氧化鉀水溶液當中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液，攪拌20min后靜置待用。將200 μ L O. 03mol/L氯金酸溶液迅速加入到上述還原性有機磷前體溶液當中，攪拌條件下反應5min后,加入300 μ L O. lmol/L硝酸銀溶液,而后繼續攪拌反應lh,向該溶液中加入IOmg分子量IOKDa末端巰基化的聚乙二醇分子，攪拌過夜后，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產物經過無水乙醇洗滌后重新分散在去離子水中，重復上述洗滌再分散過程至少三次，最終得到純化產品，重新分散在磷酸緩沖溶液中，采用瓊脂糖稀釋法檢驗該金銀核殼納米顆粒的抑菌能力，銀元素濃度為43 μ g/mL時，可有效抑制108CFU/mL的大腸桿菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌的增殖，四種細菌的致死率分別為100%,100%，98%，96%。下表為金銀核殼結構納米顆粒增強CT數據
權利要求
1.多功能金銀核殼結構納米顆粒，其特征是以銀納米殼層包裹的金納米顆粒，并以巰基聚乙二醇分子對銀核殼結構納米顆粒進行表面修飾；其中金納米核顆粒尺寸在3 20 nm之間，銀納米殼厚度在疒12 nm之間。
2.根據權利要求I所述的多功能金銀核殼結構納米顆粒，其特征是所述X射線衰減能力較強的金銀核殼結構納米顆粒，是以經過堿液活化的四羥甲基氯化磷為還原劑，首先還原氯金酸制備超細金納米顆粒，再以該納米粒子為晶核，還原硝酸銀溶液，制備銀納米殼層包裹的金銀核殼結構納米粒子，再通過尾端巰基化修飾的聚乙二醇分子對金銀核殼結構納米顆粒進行表面修飾，制備出具有長效血液循環時間同時兼具的抗感染能力的CT造影劑。
3.多功能的金銀核殼納米顆粒的制備方法，其特征是步驟如下所述的制備兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒，在室溫下原位制備，它包括以下步驟 (1)量取5 40μ L四羥甲基氯化磷溶液，加入10 50 mL濃度為O. 05^0. 9mol/L的氫氧化鉀水溶液或2(Tl00 mL濃度為O. 05^1 mol/L氫氧化鈉水溶液中活化，制備具有還原活性的有機磷前體溶液； (2)在上述步驟(I)的溶液中加入50 400μ L濃度為O. 01 O. I mol/L的氯金酸溶液，攪拌條件下反應5-20 min后，再加入濃度為O. 01、. I mol/L硝酸銀溶液5(T300 yL，其中氯金酸與硝酸銀物質量比在5 Γ1 :4之間，而后繼續攪拌反應O. 5-2 h，將反應后的溶液離心純化后，棄去上清液，產物用去離子水洗滌分散后，重復上述洗滌過程，最終得到純化產品其中金納米核顆粒尺寸在3 20 nm之間,銀納米殼厚度在2 12 nm之間；核殼納米顆粒的粒徑在5 30nm之間。
4.根據權利要求3所述的多功能的金銀核殼納米顆粒的制備方法，其特征是在上述步驟(2)離心純化前的溶液加入尾端巰基化的聚乙二醇，分子量在2 10 kDa之間，攪拌過夜后，得到表面聚乙二醇修飾的金銀核殼結構納米顆粒，其中單個顆粒表面聚乙二醇平均包覆數量為30 500個。
5.根據權利要求3所述的兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒的室溫原位制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，四羥甲基氯化磷加入量在5 40 yL，氫氧化鉀水溶液總量在1(T50 mL，氫氧化鈉水溶液總量在2(Tl00 mL。
6.根據權利要求3所述的兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒的室溫原位制備方法，其特征在于所述步驟(2)中氯金酸溶液的濃度在O. 0Γ0. I mol/L，用量為50^400 μ L,硝酸銀溶液的濃度在0. 0Γ0. lmol/L,用量在5(Γ300 μ L，氯金酸與硝酸銀摩爾量之比為5 I :4。
7.根據權利要求3-6之一所述的兼具抗感染能力及CT造影功能的金銀核殼納米顆粒的室溫原位制備方法，其特征在于所述步驟(2)中所有反應溶劑均為去離子水，所有洗滌溶劑均為無水乙醇。
8.根據權利要求3-5之一所述的多功能的金銀核殼納米顆粒的室溫原位制備方法，其特征在于取所述步驟(2)離心純化前的溶液加入尾端巰基化的聚乙二醇，分子量2 10KDa，攪拌過夜后，得到表面聚乙二醇修飾的金銀核殼結構納米顆粒。
全文摘要
多功能金銀核殼結構納米顆粒，以銀納米殼層包裹的金納米顆粒，并以巰基聚乙二醇分子對銀核殼結構納米顆粒進行表面修飾；其中金納米核顆粒尺寸在3~20nm之間，銀納米殼厚度在2~12nm之間。尤其是以經過堿液活化的四羥甲基氯化磷為還原劑，首先還原氯金酸制備超細金納米顆粒，再以該納米粒子為晶核，還原硝酸銀溶液，制備銀納米殼層包裹的金銀核殼結構納米粒子，再通過尾端巰基化修飾的聚乙二醇進行表面修飾，制備出具有長效血液循環時間同時兼具的抗感染能力的CT造影劑。粒徑均一，水溶性好，無明顯團聚，該核殼納米顆粒的對X射線的耗散能力較強，優于傳統造影劑碘佛醇的CT有效顯影時間。并有效抑制細菌通過造影劑注射窗口的感染。
文檔編號A61K49/06GK102908633SQ20121026902
公開日2013年2月6日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者胡勇, 霍達, 趙慧玥, 周航, 周藝, 周正揚, 何健 申請人:南京大學