專利名稱：：作為體內造血刺激劑的tat-hoxb4h重組蛋白質及其醫療組成物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種C-端含有組胺酸標記的H0XB4重組蛋白質，特別涉及一種C端含有六個組胺酸殘基(residue)的重組蛋白質。
背景技術：
：在再生醫學發展蓬勃的今日，各種關于尋找器官特異干細胞或可自我更生(self-renewing)細胞的研究不斷。所述可自我更生細胞中最常被研究的是造血干細胞，因為從癌癥、新陳代謝疾病到免疫不全，造血干細胞皆是較好的治療選擇。“造血”是指血液細胞生成的過程，可通過位于骨髓中的造血干細胞的分裂而取代紅血球及白血球。造血干細胞(HSCs)是一群具有自我更新能力與分化為所有血球或免疫細胞能力的細胞。然而，控制造血干細胞自我更新與分化的基因機轉多半仍屬未知。目前，自成人骨髓、動員后周邊血液以及臍帶血移植的人類造血干細胞，已在臨床上用于治療血癌(白血病與淋巴瘤)，以及用于幫助免疫系統由非血癌的高劑量化療復原。然而有效的移植需要大量的不同來源的造血干細胞，并且可能需要進行干細胞增生(expansion)。造血干細胞可來自骨髓、周邊血液以及臍帶血。取出骨髓細胞需要進行手術以及相當痛苦的步驟，因而成為較差的手段。使用周邊血液細胞也有缺陷，因為很難由造血機能受損的罹病或化療患者取得合適與足量的造血干細胞。臍帶血相對容易取得并且造血干細胞的質量也較好，然而此法所能取得的造血干細胞數量仍有限。每次取得的細胞數量足夠用于小孩，但要用于成人就可能不足。為解決上述問題，就必須干擾干細胞自我更生過程來加速造血干細胞體外增生。新近的證據指出轉錄調控因子在調控干細胞的基因表現、與干細胞的發育過程扮演重要角色(Orkin、S.H.Nat.Rev.Genet1,57-64,2000)轉錄調控因子可通過與目標基因的結合與否或是本身濃度來構成復雜的細胞生理調控機制。一群稱為DNAbindinghomebox(HOX)的轉錄因子被發現在胚胎發育扮演重要角色，并且在近年來發現HOX轉錄因子家族在造血干細胞發育也扮演了重要角色(Buske、C.et.al.J.Hematol.71,301-308、2000)ο蒙特婁大學(UniversityofMontreal)的蓋·薩瓦格(GuySauvageau)博士曾經探討骨髓中造血干細胞的HOX轉錄因子調控造血干細胞更新的現象，它的研究顯示同位序列基因(homeoboxgene)H0XB4對于造血干細胞自我更新的調控十分重要,可維持造血干細胞在骨髓中的群集大小。最早證明HOX基因會在血球細胞表現，是利用人類及老鼠的細胞株(cellline)而證實的。有些HOX基因在不同的細胞形態有明顯廣泛的表現，有些HOX基因則只活化表現于特定細胞中。例如人類的HOXB串群中的八個成員會在紅血球細胞發育之初表現，有些HOXB基因包括H0XB4及H0XB7也會在T細胞及B細胞表現。Sauvageau等人證實有九個HOXA基因、八個HOXB基因及四個HOXC基因會在CD34+骨髓細胞內表現，其中又以H0XB2、H0XB9及H0XA10在CD34+的細胞族群內的紅血球原始細胞表現最多。另夕卜，實驗結果也檢測出在⑶34_的細胞群中，沒有HOX基因表現。因此，“H0XB4”蛋白已最常被用于做為活體外造血干細胞(HSC)增生之有效刺激劑。近來已證實人類，“H0XB4”基因可以病毒或重組蛋白質形式來有效增生造血干細胞。TAT-H0XB4H重組蛋白質，在實驗室等級，已被用于增生干細胞而不會有反轉錄病毒插入之風險或與骨髓基質細胞共培養之風險(參見Krosl、J.etal.、NatureMedicine9,1428-1432,2003)因此，“H0XB4”蛋白已常用于做為促進活體外造血干細胞增生的刺激劑。最近已有證據指出在H0XB4的N端加上一TAT蛋白質序列后，外源的H0XB4即可被運送至細胞內。此TAT序列系可導引H0XB4由細胞外至細胞內的運輸。一旦進入細胞質，H0XB4可藉由護衛蛋白(Chaperon)HSP90而重新折迭成其原始的構形。TAT-H0XB4能夠促進造血干細胞增生達2-6倍(AmselIem>S.等人，NatureMedicine9、1423-1427,2003;及Krosl.J.等人，NatureMedicine9、1428-1432，2003)。然而，該TAT-H0XB4重組蛋白質自大腸桿菌宿主的純化回收產率偏低，且多為不可溶形式。為了增加該TAT-H0XB4重組蛋白質的產率，已發展出C-端另具有一段6個組胺酸殘基(His-6)標記的TAT-H0XB4H重組蛋白質制造方法，其產率較原始蛋白質的純化效率高出3-5倍。此制造方法已詳細描述于PCT/CN2006/000646。上述TAT-H0XB4H重組蛋白質可用于人類周邊血液或臍帶血干細胞增生，并且所增生的干細胞仍保有其多能性(pluripotency)。此外,將上述TAT-H0XB4H重組蛋白質處理過的干細胞加入在非肥胖型糖尿病合并重度聯合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)的骨髓內之后,可以在其周邊白血球中發現人類白血球，由此可知小鼠免疫與造血機能已成功重建。然而，TAT-H0XB4H重組蛋白質從未被用于做為體內造血的刺激劑，特別是，從未被用于增進造血機能重建、擴增、骨髓重生(re-population)以及增加周邊循環干細胞的數目，特別是在化療或放射線治療之后。Krosl等人(2003)以及Amsellem等人(2003)無法獲得擴增造血干細胞臨床研究所需的大量高純度且高度安定的H0XB4蛋白質。使用現有技術由一公升培養液純化而得的TAT-H0XB4H重組蛋白質總量約為1_2毫克，產率較低。使用現有技術方法表現TAT-H0XB4H蛋白質的pTAT-HA_H0XB4質體，是加拿大蒙特婁大學(UniversityofMontreal)的蓋·薩瓦格(GuySauvageau)博士所贈，Krosl等人(2003)曾報告說，在血清培養4小時后，其純化的TAT-H0XB4H蛋白質會喪失大部分。
發明內容本發明基于后述研究結果當TAT-H0XB4H重組蛋白質給予一有需要的使用者之后，其可增加骨髓內以及周邊血液內的造血干細胞的數目。本發明一方面提供了一種TAT-H0XB4H蛋白質制造方法。該方法包含(a)提供一宿主細胞，其包含一具有上述蛋白質編碼的載體；(b)在該宿主細胞內表現該蛋白質；(C)收取該表現蛋白質的一不純溶液；(d)以下列步驟由該溶液純化該蛋白質(i)將該溶液通入一HisTrap管柱；(ii)沖洗該HisTrap管柱；(iii)將該部分純化的蛋白質由該HisTrap管柱溶離出，而形成一部分純化的蛋白質溶液；(iv)將該部分純化的蛋白質溶液通入一MonoSP管柱；(V)沖洗該MonoSP管柱；(vi)將純化的蛋白質，呈變性形式，由該MonoSP管柱溶離出；(e)利用疏水性化合物將溶離出的變性蛋白質以下列步驟再折迭(i)將該溶離出的變性蛋白質與一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白質與疏水性化合物溶液；()將該蛋白質與疏水性化合物溶液去鹽而得一蛋白質與疏水性化合物去鹽溶液；(iii)利用超過濾制程將該疏水性化合物由該蛋白質與疏水性化合物去鹽溶液中移除。本發明另一方面提供了一種促進造血干細胞由骨髓動員至周邊血液的方法。該方法包含a)給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質；b)允許該TAT-H0XB4H重組蛋白質增加該使用者骨髓內造血干細胞的絕對數目，由此促進造血干細胞動員至該使用者的周邊血液。本發明再一方面向提供了一種用以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的方法。該方法包含a)給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質；b)允許該TAT-H0XB4H重組蛋白質增加該使用者骨髓內造血干細胞的絕對數目。本發明再一方面提供了一種用以促進造血干細胞由一有需要的使用者的骨髓動員至周邊血液的醫療組成物。本發明的醫療組成物包含一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質，其足以增加該使用者骨髓內造血干細胞的絕對數目，由此促進造血干細胞動員至該使用者的周邊血液。本發明所述醫療組成物可給予進行自體造血干細胞移植的患者，用以改善其造血干細胞移植后的恢復時間。本發明所述醫療組成物，可作為顆粒球細胞生長因子(G-CSF)的替代物，給予G-CSF不敏感患者，用以動員造血干細胞至周邊血液。本發明所述醫療組成物可給予造血干細胞捐贈者，由此可以由捐贈者之外圍血液以較不具侵略性的方式取得足量的造血干細胞以供移植，而不須由其骨髓取得。本發明再一方面提供了治療先天性造血干細胞缺乏而造成的疾病，其通過全身性給藥方式，給予上述疾病患者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質或其醫療組成物。所給予的TAT-H0XB4H重組蛋白質會增加該使用者骨髓內造血干細胞的絕對數目。本發明再一方面提供了一種用以改善造血干細胞移植患者的恢復時間的方法，其通過全身性給藥方式，給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質或其醫療組成物。本發明再一方面提供了一種用以改善放射線治療患者或化療患者的造血干細胞回復的方法，其通過全身性給藥方式，給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質或其醫療組成物。圖I為本發明中造血干細胞(HSC)從體內擴增動員至外圍血液(PB)的示意圖2為本發明中PTAT-H0XB4H的選殖與構筑在修改過的pET21b質體內的示意圖；圖3為本發明中pTAT-H0XB4H的DNA序列圖；(ρΤΑΤ_Η0ΧΒ4ΗΝ_端及C-端額外的六個組胺酸殘基加底線標示，并且標上TAT)圖4為本發明中ρΤΑΤ-Η0ΧΒ4Η的蛋白質序列圖；圖5為本發明中以10%SDS-poIyacryIamide凝膠(I.5mm)證明TAT-H0XB4H蛋白質的純化，其以coomassieblue染色分析圖示pTAT_H0XB4H的蛋白質序列；其中M:分子量標記(M),O.3μg;laneI:來自未誘導BL21(DE3)pLysSTAT-H0XB4H蛋白質表現細胞的細胞溶解產物，Iμg蛋白質；Iane2:來自誘導后BL21(DE3)pLysSTAT-H0XB4H蛋白質表現細胞的細胞溶解產物，Iμg蛋白質；Iane3:純化的TAT-H0XB4H，O.7μg蛋白質；Iane4:純化的TAT-H0XB4(O.2μg蛋白質)；用以表現TAT-H0XB4蛋白質(lane5)的pTAT-HA_H0XB4質體,是加拿大蒙特婁大學(UniversityofMontreal)的蓋·薩瓦格(GuySauvageau)博士所贈。lane3及lane4是加入相同體積的由MonoSP管柱收集的流份(fraction)。圖6為本發明中以SDS-polyacrylamide凝膠分析純化后TAT-H0XB4H蛋白質的安定性圖；(其儲存在PBS，40C，O小時(A)與16小時(B)，其中M代表分子量標記，O代表在40CO小時，16代表在4°C16小時)圖7為本發明中以SDS-polyacrylamide凝膠以及coomassie染色分析TAT-H0XB4H蛋白質儲存在_4°C以及_20°C，PBS以及MDM緩沖液的安定性圖；(箭頭指示TAT-H0XB4H蛋白質band)圖8A為本發明中以流式細胞儀分析G-CSF對于小鼠骨髓中⑶34+干細胞數目的刺激效果圖；圖8B為本發明中以流式細胞儀分析PBS對于小鼠骨髓中CD34+干細胞數目的刺激效果圖；圖8C為本發明中以流式細胞儀分析TAT-H0XB4H蛋白質對于小鼠骨髓中⑶34+干細胞數目的刺激效果圖；圖9A為本發明中以流式細胞儀分析G-CSF對于恒河猴骨髓中⑶34+干細胞數目的刺激效果圖；。圖9B為本發明中以流式細胞儀分析TAT-H0XB4H蛋白質加上G-CSF對于恒河猴骨髓中CD34+干細胞數目的刺激效果圖；圖9C為本發明中以流式細胞儀分析TAT-H0XB4H蛋白質對于恒河猴骨髓中⑶34+干細胞數目的刺激效果圖；圖9D為本發明中以流式細胞儀分析PBS對于恒河猴骨髓中CD34+干細胞數目的刺激效果圖；圖10為本發明中TAT-H0XB4H蛋白質對于NOD-SCID小鼠的造血回復影響圖；圖11為本發明中TAT-H0XB4H蛋白質對于接受Cisplatin化療后Balb/c小鼠的造血回復影響圖。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明的實施例作進一步的詳細說明。I·TAT-H0XB4H蛋白質本發明由一公升培養液純化而得的TAT-H0XB4H重組蛋白質總量約為6_10毫克，而本發明的TAT-H0XB4H蛋白質純化方法具有體內給予蛋白質所需提升的產率。本發明的TAT-H0XB4H蛋白質，即使在血清培養4星期后，仍顯出明顯較佳的安定性，此處將TAT-H0XB4H蛋白質用于臨床研究的關鍵。本發明所提供的TAT-H0XB4H蛋白質的制造方法，具有能夠提高產率以及安定性的優點，使得上述蛋白質可用于體內給藥。此TAT-H0XB4H蛋白質為包含三個基因片段(element)(TAT、H0XB4以及組胺酸標記)的構體(construct)。H0XB4是轉錄調控因子HOX家族的一員，其可促進造血干細胞增生。TAT使得H0XB4部分得以被輸送至細胞核內。組胺酸標記可使重組表現源的初始純化產率增加，本發明的制造方法可進一步增加蛋白質產率。pTAT-H0XB4H的構筑如圖2所示，DNA序列系如圖3所示。TAT-H0XB4H重組蛋白質系指C端含有六個組胺酸殘基(residue)標記(參見圖4)的TAT-H0XB4融合蛋白質。除非另外指明，蛋白質的氨基酸序列(或稱“初級結構”或“初級序列”)是由氨基端至羧基端。在非生物系統(例如使用固態合成者)，蛋白質(包含雙硫(半胱氨酸)鍵位置)的初級結構可由使用者自訂。“刪除(deletion)”是指氨基酸(或核苷酸)序列由于缺失一個或一個以上的氨基酸殘基(或核苷酸)所造成的改變。“插入(insertion)或增加”是指氨基酸(或核苷酸)序列的改變造成在一分子或其表現物，相較于一參照序列(例如自然存在分子所發現的序列)，增加一個或一個以上的氨基酸殘基(或核苷酸)。“取代”是指一個或一個以上的氨基酸(或核苷酸)被不同的氨基酸(或核苷酸)取代。與本發明序列相似或同源(例如序列有70%相同)的序列也是本發明的一部分。在某些實施例中，序列相同度可以是90%、、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。此外，實質相同也存在于當核酸片段可以與其互補股雜交(例如在高度嚴格的條件下)時。核酸可出現在全細胞、細胞溶解物或呈半純化或純化形式。兩序列間“同源性”或“序列相同性”(兩者在此處可交換使用)的計算方法如下所示。先將序列以最適合比較的方式對齊(例如可在第一或第二氨基酸(或核酸)序列加上缺口(gap)以最適合比較，并且比較時可去掉不同源的片段)。在本發明的一個優選實施例中，參照序列用于對齊比較的長度可以是參照序列長度的至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、更佳至少60%、更佳至少70%、80%、90%、100%。然后比較對應位置上的氨基酸殘基(或核苷酸)。當第一序列以及第二序列相對應位置相同的氨基酸殘基(或核苷酸)時，則在該位置相同(在此氨基酸(或核酸)“相同”指等同于氨基酸(或核酸)“同源”)。兩序列之間的相同度百分比指兩序列間共同擁有相同位置的數目的函數，其需考慮為了最佳化對齊所加入的缺口的數目與每一缺口的長度。兩序列之間的序列比較與相同百分比可以利用一數學算法達成。在本發明的一個優選實施利中，兩氨基酸序列之間的相同百分比可以利用已并入GCG軟件包(http://www.gcg.com)GAP程序的NeedlemanandWunsch(1970)(J.MoI.Biol.48:444-453)算法決定，使用Blossum62matrix或PAM250matrix以及16、14、12、10、8、6或4的缺口加權與1、2、3、4、5或6的長度加權。在本發明的另一個優選實施利中，兩氨基酸序列之間的相同百分比可以利用GCG軟件包(http://www.gcg.com)決定，使用NWSgapdna.CMPmatrix以及40、50、60、70或80的缺口加權與1、2、3、4、5或6的長度加權。一組優選的參數組(當不確定哪些參數可用以決定一分子是否為本發明相同或同源的序列時，可使用此組參數)為，使用Blossum62scoringmatrix以及12的缺口罰分(penalty)、4的缺口延伸罰分與5的框架位移(frameshift)缺口罰分。兩氨基酸(或核苷酸)序列之間的相同百分比也可以利用已并入ALIGN程序(2.O版)的E.Meyersandff.Miller((1989)CABI0S,4:11-17)算法決定，使用PAM120weightresiduetable以及12的缺口長度罰分與4的缺口罰分。II.TAT-H0XB4H重組蛋白質制造方法A.選殖與表現用于在各種宿主細胞中選殖與表現蛋白質的系統，在本領域中已經廣為人知。適用于制造蛋白質的細胞，例如Fernandezetal.(1999)GeneExpressionSystems。簡而言之，適合的宿主細胞包含哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母細胞或原核細胞(例如E.coli)ο本領域中用于異源蛋白質表現的哺乳動物細胞，包含淋巴細胞株(例如NS0)、HEK293cells、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、COScells、HeLacells、幼倉鼠腎細胞、卵母細胞以及來自基因轉殖動物的細胞，例如乳腺上皮細胞。合適的載體可以構筑成含有適當的調節序列，包含啟動子序列、基因終止序列、多聚腺苷化序列、增強子序列、標記基因以及其它序列。載體可含有質體或病毒骨架。細節參見Sambrooketal.MolecularCloningALaboratoryManuals2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。許多載體相關技術，包含操作、制備、形成突變、序列解讀以及DNA轉染(transfection)描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,SecondEdition,Ausubeletal.eds.,JohnWiley&Sons(1992)。本發明還提供了一種將核苷酸送入宿主細胞的方法。對于原核細胞，適合的轉染技術包含磷酸鈣、DEAE-Dextran,電穿孔、脂小體中介轉染以及利用反轉錄病毒或其它病毒，例如牛痘病毒(vaccinia)或桿狀病毒(baculovirus)。對于細菌細胞,適合的技術包含氯化鈣轉化(transformation)、電穿孔以及利用脂小體中介轉染以及利用噬菌體轉染。DNA送入之后，可以接著以選擇方法(例如藥物抵抗)來選擇含有核苷酸的細胞。B.純化與在再折迭TAT-H0XB4H蛋白質可以利用本領域任何已知的適當手段由重組宿主細胞單離。例如當蛋白質可被分泌時，其可以由細胞上清液中分離；或者蛋白質可由細胞溶解產物中分離。TAT-H0XB4H蛋白質可以利用層析法純化，其包含(a)將細胞溶解產物或細胞上清液(假如蛋白質可被分泌)通入一HisTrap管柱；(b)以一緩沖溶液沖洗該HisTrap管柱；(c)將該部分純化的蛋白質由該HisTrap管柱溶離出；(d)將由HisTrap管柱收到的部分純化的蛋白質通入一MonoSP管柱；(e)以一緩沖溶液沖洗該MonoSP管柱；(f)將純化的蛋白質由MonoSP管柱溶離出。細胞溶解產物或細胞上清液(假如蛋白質可被分泌)可以在4°C下以20，OOOxg離心30分鐘使其澄清。將上清液調整至IOmM咪唑并加入HisTrap螯合管柱(AmershamPharmacia)。以8M尿素，20mMHEPES,0.5mMDTT，IOOmMNaClρΗ8·0緩沖溶液以及IOmM咪唑沖洗管柱，以移除未結合蛋白質。部分純化的蛋白質可利用高濃度的咪唑以及鹽由該HisTrap管柱溶離。進一步純化指將由HisTrap管柱收到的部分純化的蛋白質通入MonoSP管柱(AmershamPharmacia)。以4M尿素，20mMHEPES,5OmMNaClpH6.5緩沖溶液一緩沖溶液沖洗管柱，以移除未結合蛋白質。結合的TAT-H0XB4H可利用高濃度的鹽溶離。此純化步驟所得的TAT-H0XB4H蛋白質系呈變性形式。接著，利用疏水性化合物將由HisTrap管柱溶離的呈變性的TAT-H0XB4H蛋白質以下列步驟再折迭(i)將該溶離出的變性蛋白質與一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白質與疏水性化合物溶液；(ii)將該蛋白質與疏水性化合物溶液去鹽而得一蛋白質與疏水性化合物去鹽溶液；(iii)利用超過濾制程將該疏水性化合物由該蛋白質與疏水性化合物去鹽溶液中移除。本發明中，“疏水性化合物”是指任何可以在變性去鹽步驟中，保護蛋白質使其不產生不溶性沈積的疏水性化合物。適用于本發明的疏水性化合物系描述于Oganesyanetal.、Pharmagenomics(2004)71、22-26。合適的疏水性化合物包括TritonX-100、tween_20或多苯環化合物。該超過濾制程或緩沖溶液轉換可藉由蛋白濃縮管柱(centricontube)或蛋白超濾膜(stircell)進行。該超過濾制程或緩沖溶液轉換的條件視蛋白質的種類而定。在本發明的一個實施例中，在含有H0XB4H蛋白質的去鹽溶液中的疏水性化合物系藉由5-10次的緩沖溶液轉換(每次以1000-2500xg離心10分鐘)來移除，該緩沖溶液轉換系以由低至高濃度的大分子疏水性物質(例如環糊精(cyclodextrin))溶液進行,藉此使變性的H0XB4H蛋白質再折迭恢復成天然形式(nativeform)。在本發明又一實施例中，純化的TAT-H0XB4H蛋白質可儲存在MDM(HyClone)培養基(儲存緩沖溶液I)中，4°C或_20°C。在本發明又一實施例中，純化的TAT-H0XB4H蛋白質可儲存在DMEM(HyClone)培養基(儲存緩沖溶液2)中，4°C或_20°C。在本發明又一實施例中，TAT-H0XB4H蛋白質C端的組胺酸標記可以在進行體內給藥的前移除。在本發明又一實施例中，TAT-H0XB4H蛋白質N端的組胺酸標記可以在進行體內給藥的前移除。在本發明又一實施例中，TAT-H0XB4H蛋白質N端的及C端的組胺酸標記可以在進行體內給藥的前移除。C.制備醫療組成物當與藥學上可接受的載劑結合時，TAT-H0XB4H可作為醫療組成物使用。除了TAT-H0XB4H蛋白質與載劑之外，此醫療組成物可包含各式各樣的稀釋劑、填充劑、鹽類、緩沖劑、安定劑、助溶劑以及本領域中其它已知的材料。“藥學上可接受”是指不會干擾活性劑生物活性的有效性的無毒材料。載劑的特性視給藥途徑而定。由于劑量均一以及服用方便，將組成物配方成劑量單元形式系較有利的。劑量單元形式在此處指，用于被治療對象單元劑量的物理上可分開的單元。每一單元含有一預先設定量的活性劑，用以結合所要的醫藥載體，產生所要的治療效果。本發明劑量單元形式的規格系視活性劑的獨特性質、所要達成的特定治療效果而定。典型的給藥路徑，包含口服、外用、非腸道(例如舌下或口含)、舌下、直腸、陰道以及鼻內。“非腸道(parenteral)”在此處包含皮下的(subcutaneous)、皮內的(intracutaneous)、靜脈內的(intravenous)、肌肉注射(intramuscular)、胸骨內的(intrasternal)、陰莖海綿體內注射、鞘內的(intrathecal)、耳道內(intrameata)、尿道內(intraurethral)注射以及任何適當的注入技術。醫療組成物指配方成容許其所含有的活性劑在給予患者時具有生物可利用性。醫療組成物可以一個或一個以上的劑量單元給予患者，例如一個錠劑可以是單一劑量單元，而以噴霧劑形式的容器可含有復數個劑量單元。當以口服給予治療有效量的TAT-H0XB4H蛋白質時，結合劑可以是以錠劑、膠囊、藥粉、溶液或酏劑(elixir)的形式。當以錠劑形式給藥時，本發明的醫療組成物可另包含固體載劑例如明膠，或佐劑。錠劑、膠囊、藥粉可含有5%至95%的結合劑(bindingagent)，優選為含有25%至90%的結合劑。也可加入顯色劑或調味劑。可使用膜衣層。當以液體形式給藥時，可加入液體載劑例如水、石油(petroleum)、動物油或植物油(例如花生油、礦物油、大豆油、芝麻油)或合成油。以液體形式的醫療組成物可另包含生理食鹽水、葡萄糖或其它醣類溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當以液體形式給藥，醫療組成物可含有O.5%至90%的結合劑，優選為含有I%至50%的結合劑。當以靜脈、皮膚或皮下注射給予一治療有效量的TAT-H0XB4H蛋白質時，可以是無致熱原的非腸道(parenteralIy)可接受的水溶液的形式。制備具有應有的pH值、等張性、安定性的非腸道可接受蛋白質溶液，屬于該
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的公知技術。在某些實施例中，用于靜脈、皮膚或皮下注射的醫療組成物可包含等張載體，例如氯化鈉注射液、林格氏液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化鈉注射液、乳酸林格注射液或其它本領域公知的載體。本發明的醫療組成物還可包含安定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或其它本領域公知的添加劑。在進行本發明治療方法或使用本發明時，先將治療有效量的TAT-H0XB4H蛋白質給予使用者，例如一哺乳類動物，當然，也可以是人類。“治療有效量”在此處指該醫療組成物中活性劑的總量足以產生積極的效果，例如癥狀減輕、治愈或增加治愈率。當用在單一活性劑且單獨給藥時，“治療有效量”單指該活性劑。當用于一組合時，“治療有效量”指所有活性劑足以產生治療效果的總合量，不論該些活性劑指系列性組合給藥或同時組合給藥。TAT-H0XB4H蛋白質在本發明醫療組成物中的含量視欲治療癥狀的嚴重性與本質、患者先前接受的治療本質以及患者的年齡及性別而定。最后，主治醫師可以決定個別患者活性劑給藥量。剛開始，主治醫師可以給予低劑量的活性劑，并觀察患者的反應。可給予較大劑量的活性劑直到患者得到適當的治療效果，此時一般不會再增加劑量。用以實施本發明方法的醫療組成物可含有每公斤體重約Ig至約Img的TAT-H0XB4H蛋白質。給予使用者的劑量范圍可選自IUg/kg至lmg/kg、Iμg/kg至0.5mg/kg、lμg/kg至0.lmg/kg、10μg/kg至0.5mg/kg、10μg/kg至0.lmg/kg、100μg至0.5mg/kg、250μg/kg至0.5mg/kg。此外，劑量范圍可選自50μg至100mg、100μg至50mg、500μg至50mg、lmg至50mg。使用本發明醫療組成物的靜脈注射時間視欲治療的疾病嚴重性以及個別患者的特異反應而定。在本發明又一實施例中，施以本發明TAT-H0XB4H蛋白質的時間可以是12至24小時的連續靜脈注射。在本發明又一實施例中，本發明TAT-H0XB4H蛋白質可持續使用，只要患者繼續在進行化療或放射線治療。TAT-H0XB4H蛋白質可以靜脈注射10-100μg/kg，一天兩次，4.5至5天。一次治療循環可能就足以在體內擴增造血干細胞。最后，主治醫師可以決定使用本發明醫療組成物的適當靜脈注射時間。化合物毒性以及治療效價可以標準的藥劑學程序以細胞培養或實驗動物決定，例如LD5tl(總數50%致死劑量)以及ED5tl(總數50%有效治療劑量)。毒性以及治療間的劑量比例即為治療指數，其可以LD5(i/ED5(i表示。細胞培養與實驗動物的數據可以用來評估用于人類的劑量范圍。化合物劑量可以在包含ED5tl且毒性小或無毒的循環濃度范圍內。視所使用的劑型與給藥途徑，劑量可在上述范圍內變化。TAT-H0XB4H的有效治療劑量可以由細胞培養試驗初步估計。在動物模型中，劑量可以是達到包含IC5tl(也即測試蛋白質達到最大癥狀抑制一半的濃度)的循環血漿濃度范圍，就如同細胞培養決定的方式。血漿濃度可以利用高效液相層析測定。任何特定劑量的效果可以藉由適當的生物檢定法(Bioassay)監測。適合的生物檢定法包含，但不限于，利用標記有熒光探針(例如FITC)的CD34+干細胞抗體來量測在單核細胞內的CD34+干細胞，以及利用流式細胞儀量測在外圍血液或骨髓造血干細胞中的LY5細胞比例。本發明的多核苷酸與蛋白質系預期可展現下述的一個或一個以上的用途或生物活性。本發明蛋白質的用途或活性可以由給藥或使用此蛋白質的方式提供，也可由給藥或使用編碼此蛋白質的多核苷酸的方式(例如基因療法或適用于送入DNA的載體)提供。III.體內造血刺激方法A.需要治療的患者本發明的醫療組成物可用于治療自體免疫疾病、免疫不全癥以及血液疾病。此外，本發明的醫療組成物可用于改善造血干細胞移植后的恢復時間。本發明的醫療組成物可用于治療罹患淋巴瘤、白血病、霍奇金氏癥以及骨髓增生性疾病的患者。此外，造血干細胞缺乏而造成的先天性疾病以及再生不良貧血也可以本發明的醫療組成物治療。此外，本發明的醫療組成物可用于造血干細胞捐贈者以及顆粒球細胞生長因子(G-CSF)不敏感患者。在本發明又一實施例中，TAT-H0XB4H是被用來動員造血干細胞的唯一活性劑，并且氟脲嘧啶(5-FU)并未給予捐贈者，不論是作為預處理或綜合治療計劃。可以用本發明醫療組成物治療的額外的疾病或與增加細胞生存相關的癥狀包括惡性腫瘤及相關疾病的進行及/或轉移，例如早幼粒細胞白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細胞性白血病，急性髓細胞性白血病(包括髓細胞、早幼粒細胞、粒細胞、單核細胞、紅白血病))和慢性白血病(例如慢性粒細胞(顆粒細胞)白血病和慢性淋巴細胞白血病)，骨髓形成異常癥(myelodysplasticsyndrome),真性紅血球增多癥(polycythemiavera)，淋巴瘤(例如霍奇金氏癥和非霍奇金氏癥)，多發性骨髓瘤，Waldenstr5m巨球蛋白血癥以及實體瘤，包括肉瘤和癌瘤，例如纖維肉瘤，黏液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內皮細胞肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內皮瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結腸癌，胰臟癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細胞癌，肝癌，膽道癌，絨癌，精母細胞瘤，胚胎瘤，威姆氏瘤，子宮頸癌癌，睪丸腫瘤，肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，膠質瘤，星形細胞瘤，髓母細胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果腺瘤，血管母細胞瘤，聽神經瘤,膠質瘤,黑色素瘤,神經母細胞瘤以及視網膜母細胞瘤。本發明并不限于特定的方法、實驗計劃、細胞株、動物物種或屬或下述的試劑。所用來描述特定實施例的術語不能用以限定本發明的范圍，本發明的范圍應以權利要求書的范圍為準。此處使用的，單數形式的“一”與“該”，除非文意另有所指外，也包含復數個。因此，舉例來說，“一個細胞”是指一個或多個細胞，并且包括本
技術領域：
中已知的均等物。除非另外定義，否則所有的技術和科學所用詞匯具有與本發明所屬
技術領域：
中熟悉此技術者相同涵義的理解。雖然任何方法，組件和材料相似或均等于在此描述的，都可用于實踐或試驗本發明，優選的方法，組件和材料于現在描述。所有此處提及的刊物和專利在此并入用以描述和公開，舉例來說，描述于刊物內的構造和方法，可與目前所描述的發明結合。先前以及本文中討論的刊物僅提供作為本案有效日期前的公開。所有皆不可解釋為承認發明人無法憑借先前發明來預見此公開。定義“干細胞”是一種多能或多潛能細胞，其有能力自我更新，以保持未分化，以及成為已分化。干細胞，至少在動物自然存在的一生中，可以無限分裂。干細胞并非末期分化，即它們不是在分化途徑末端。當干細胞分裂，每個子細胞，可仍然是一個干細胞或可以走向出一條導致末期分化的路。“嵌合體”干細胞是指干細胞的一部分DNA屬于一個異種生物體。“造血”細胞是指涉及造血過程(也即前體細胞形成成熟血液細胞的過程)的一種細胞。在成人，造血發生在骨髓。在發育早期，在不同發育階段，造血發生在不同的地點；原始血液細胞出現于卵黃囊，后來，血液細胞形成在肝、脾和骨髓。造血有復雜的調控，包括激素(例如紅血球生成素，生長因子(例如集落刺激因子和細胞因子(例如介白素)))。此處使用的“載體”是指能夠運送另一種核酸的核酸分子，該另一種核酸連接于該核酸分子上。一種類型的載體是一個“質體”，這指的是一個圓形雙股DNA環，額外的DNA片段可接合在其中。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可接合在病毒基因體中。某些載體有能力在所送入的宿主細胞中自主復制(例如具有一個細菌復制來源的細菌載體和附加體質粒Gpisomal)哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體質粒(episomal)哺乳動物載體)可以在送入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因體中，從而隨著宿主基因體復制。此外，某些載體，是有能力指揮其所連接的基因表現。這種載體在此是稱為“重組表現載體”(或簡單地說“表現載體”)。一般來說，用于DNA重組技術的表現載體通常是以質體的形式。在本發明中，“質體”與“載體”可以互換使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本發明包括具有等同功能的其它形式的表現載體，例如病毒載體(例如復制缺陷的反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。此處使用的“轉化”是指將一個外源多核苷酸送入宿主細胞，不論用什么方法送入舉例來說，直接吸收轉化、轉染以及感染等。特定的轉染方法見于下文。外源多核苷酸可能是以未插入載體的形式(例如質粒)，或者可能被整合到宿主基因體中。一般來說，“蛋白質”是指任何兩個或兩個以上的個別氨基酸由勝肽鍵(peptidebond)接合的聚合物(不論是否自然發生)，該勝肽鍵指當鍵結在一個氨基酸(或氨基酸殘基)的α碳的羧酸基的羧基碳原子，與鍵結在相鄰氨基酸(或氨基酸殘基)的α碳的胺基的氨基氮原子，所形成的共價鍵結。該勝肽鍵連接及其所包含的原子(也即α碳原子、羧基碳原子(以及其氧原子取代基)以及氨基氮原子(以及其氫原子取代基))形成蛋白質的“多勝肽骨架”。此外，此處使用的“蛋白質”可以理解為包括“多勝肽”以及“勝肽”(其有時可以交互使用)。同樣，蛋白質片段，類似物，衍生物以及突變物可在此稱為“proteins”，除非另有說明，也應被視為是一“蛋白質”。蛋白質“片段”是指包含少于一個蛋白質所有氨基酸殘基的多勝肽。可以理解的是，蛋白質“片段”可能是一個在N端、C端或內部(例如受天然的剪接(splicing)所致)截短的蛋白質，可以是突變物及/或衍生物。蛋白質“功能區塊(domain)”也是一個片段，其包含賦予蛋白質生化活性所需的氨基酸殘基，對應于自然存在的蛋白質。“重組”在此處指一個核酸分子，基因組，基因，病毒，半合成，或合成的，其一部分或全部的多核苷酸并非天然。“重組”相對于一蛋白質或多勝肽而言，指以重組多核苷酸表現產生的多勝肽。一個“單離的”、“純化的”、“實質上單離的”或“實質上純化的”分子(如一個多勝肽或核苷酸)指被人為操作使相較于自然有較高的濃度。舉例來說，當標的蛋白質被單離、純化、實質上單離或實質上純化，指至少有50%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或以上的天然存在的非標的蛋白質物質被移除。此處使用的“單離的”、“純化的”、“實質上單離的”或“實質上純化的”分子包括重組分子。SCID“小鼠”指重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠模型，SCID會造成免疫系統發育的嚴重缺陷。無論是T或B淋巴球，這些小鼠皆不足或完全缺乏。該SCID突變似乎損害抗原受體基因的重組，導致缺乏功能性的T與B淋巴球。其它造血細胞類型可正常發展和運作。SCID小鼠隨時支持正常淋巴球分化，并且可與來自同基因或異基因小鼠的正常淋巴球重組或與人類淋巴球重組。這些小鼠還支持異基因和異種基因腫瘤的生長。因此，SCID小鼠允許一些人類腫瘤的擴散增長，特別是血液系統疾病以及惡性黑色素瘤，因此可用于研究惡性腫瘤。“使用者”、“個人”、“宿主”以及“病人”在此處可互換使用，用以指活的動物，包括人類和非人類的動物。使用者可能是，舉例來說，一個擁有免疫細胞的有機體，該免疫細胞能對抗源刺激產生反應，并且能對經由細胞表面的受體結合傳遞的刺激和抑制信號產生反應。使用者可以是一個哺乳類動物，例如人或非人類的哺乳動物，例如狗，貓，豬，牛，綿羊，山羊，馬，大鼠以及小鼠。“使用者”并不排除，相對于疾病或各方面，完全正常的個人。“治療”指的是一個治療性或預防性的措施。治療可施加于具有醫療疾病的使用者或最終會得到疾病者，用以預防、治療、延誤、減少嚴重性或改善一個或一個以上疾病或反復發生的疾病的癥狀，或用以延長使用者生存期間使其超過沒有治療所預期的生存期間。“治療有效量”是指主化合物可引起預期反應(例如經由研究員、獸醫、醫生或其它的臨床醫師所認定的組織、制度、動物、動物或人類的生物或醫學反應)的量。以下具體的例子是，以被視為僅僅是說明性的，無論在任何情況皆不是用以限定本發明的其它部分。本
技術領域：
中普通技術人員可基于本申請文件的敘述而實施本發明。實例例I:pET21b-His-TAT-H0XB4-His質體的構筑(a)N-端及C-端含有組胺酸標記及TAT訊號勝肽的pET21b質體的修改N-端含有組胺酸標記及TAT訊號勝肽的pET21b表現載體由在pET21b質體插入下列寡核苷酸而得5’-TATGCACCACCACCACCACCACTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGCGCCGCCGGCG-3’(正股(sense))及5，-CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3’(反股(antisense))。C-端組胺酸標記原本就存在于pET21b質體中。(b)將H0XB4選殖入修改后的pET21b表現質體含有H0XB4開放讀框(ORF)以及額外六組胺酸編碼序列的DNA片段，以MGC54130質體(GeneDiscovery,Taipei,Taiwan.Cat.No.5533346)為模板，利用聚合酵素鏈鎖反應(PCR)放大而得，將PCR所得的H0XB4cDNA片段次選殖(subclone)到修改后的pET21b表現質體。構筑的質體以及核酸序列系如圖2及圖3所示。實例例2:在大腸桿菌表現TAT-H0XB4H重組蛋白質將pET21b-His-TAT-H0XB4_His表現質體轉化至BL21(DE3)pLysS(Novagen)大腸桿菌株。令經轉化的細胞于37°C下生長過夜。將過夜培養物稀釋成起始0D_值為O.05，并置于37°C下生長至D6c值為O.5，接著以ImM異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)于37°C下進行誘導表現3小時，期間伴隨劇烈搖晃。實例例3TAT-H0XB4H重組蛋白質的純化在誘導作用后，將細胞以離心收集并再懸浮于緩沖液A(8M尿素，20mMHEPES,O.5mMDTT及IOOmMNaClpH8.O)中。將細胞懸浮液通過Frenchpress三次，并將細胞溶解產物以20，OOOXg于4°C下離心30分鐘使其澄清。將上清液調整至IOmM咪唑并加樣至HisTrap整合管柱(AmershamPharmacia)。將結合的蛋白以50、100及250mM配制于緩沖液A中的咪唑進行溶離。將含有TAT-H0XB4H的流份(fraction)加樣至存在緩沖液B(4M尿素，20mMHEPES及50mMNaClpH6.5)的MonoSP管柱，以I.5MNaCl及20mMHEPES(pH8.O)溶離。實例例4:ΤΑΤ_Η0ΧΒ4Η重組蛋白質的復性(renaturation)將溶離流份中的TAT-H0XB4H蛋白質溶解并變性于一含有變性鹽類(例如胍鹽酸鹽(guanidinehydrochloride))的溶液，然后將其與D-PBS-T緩沖溶液(含有0.I%TritonX-100的兩倍磷酸鹽緩沖溶液)混合。TAT-H0XB4H蛋白質溶液與D-PBS-T緩沖溶液的比例為I:4。將所成的混合液加入以水(10mlor3ml)前處理的10K蛋白濃縮管柱(centricontube)(50mlor15ml),離心3000rpm,10分鐘。在此步驟中，變性鹽類系被D-PBS-T緩沖液置換，D-PBS-T緩沖液中的TritonX-100系可與H0XB4H蛋白質的疏水性(Hydrophobic)區域結合接著以10K蛋白濃縮管柱(centricontube)進行超過濾或緩沖溶液置換步驟10次，以1000-2500g/min離心速度，依序將緩沖液置換為含lmM、2mM、3mM、4mM及5mMβ-環糊精(beta-cyclodextrin)的IMDM儲存緩沖液，其中于各離心速度下以每種濃度置換離心兩次。收集濃縮管柱中留存的樣品，并保存于_20°C冰箱。純化后TAT-H0XB4H蛋白質的均一性系以SDS-polyacrylamide凝膠以及coomassie染色分析。如圖5所不，經HisTrapandMonoSP純化的TAT-H0XB4H較原始TAT-H0XB4蛋白質的產率增加大約3-5倍。pTAT-HA_H0XB4質體，系加拿大蒙特婁大學(UniversityofMontreal)的蓋·薩瓦格(GuySauvageau)博士所贈。pTAT-HA_H0XB4質體系轉化至BL21(DE3)pLysS(Novagen)，TAT-H0XB4蛋白質的純化系如Krosl等人(2003)所述。實例例5TAT-H0XB4H重組蛋白質的安定性TAT-H0XB4H的安定性系以SDS-polyacirlamide凝膠分析。儲存時，全長的TAT-H0XB4H可能會降解為30kD與IOkD片段。如圖6所示，本發明的TAT-H0XB4H蛋白質即使在PBS，-4°C中儲存16小時依然安定。此外，儲存在-4°C以及-200C，PBS以及MDM緩沖液的TAT-H0XB4H，以10%SDS-polyacrylamide凝膠電泳以及coomassie染色分析。如圖7所示，當儲存在IMDM儲存緩沖液中，本發明的TAT-H0XB4H蛋白質可維持4星期。實例例6TAT-H0XB4H重組蛋白質對于Balb/c小鼠的造血影響TAT-H0XB4H重組蛋白質對于造血干細胞由骨髓動員至外圍血液的可能影響系利用Balb/c小鼠研究。每天四次皮下注射4天給予小鼠TAT-H0XB4H重組蛋白質(在PBS中)。為了解劑量反應性，試驗組(η=21)的劑量為lug、5ug、10ug、15ug...to100μg/kg體重。一組對照組只施打PBS，另一組對照組則每天兩次皮下注射4天5μg/kg體重的G-CSF0取各組周邊血液進行流式細胞儀分析，可得到CD34+干細胞在單核細胞(MNC)中的比例。結果以平均值土標準差的形式列于表一。表一組另IjTAT-H0XB4H(g/kg)CD34+/MNC(%)~II0+0.03~250.3+0.05~100.45+0.03~150.42+0.015200.38+0.05~6250.41+0.02~300.35+0.21~8350.33+0.11~9400.29+0.16~10450.46+0.01~Π500.45+0.02~12550.42+0.06~13600.44+0.0權利要求1.一種用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于至少包含一有效量的TAT-H0XB4H重組蛋白質，該蛋白質的量系足以增加一有需要的使用者骨髓內造血干細胞的絕對數目。2.根據權利要求I所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一造血干細胞捐贈者。3.根據權利要求I所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一進行自體造血干細胞移植的患者。4.根據權利要求I所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一顆粒球細胞生長因子不敏感患者。5.根據權利要求4所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性造血干細胞缺乏而造成的疾病。6.根據權利要求5所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性再生不良貧血。7.根據權利要求I所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述使用者指罹患血液疾病、實體瘤或免疫疾病。8.根據權利要求7所述的用于活體內投藥以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，其特征在于所述血液疾病指選自由淋巴瘤、白血病、霍奇金氏癥以及骨髓增生性疾病所組成的族群。全文摘要本發明公開了一種作為體內造血刺激劑的TAT-HOXB4H重組蛋白質及其醫療組成物，涉及一種C-端含有組胺酸標記的HOXB4重組蛋白質。解決了現有技術中由培養液純化而得到的重組蛋白質產量少且安定性差的技術問題。本發明用以改善造血干細胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復時間的醫療組成物，至少包含一有效量的TAT-HOXB4H重組蛋白質，該蛋白質的量足以直接用于體內投藥，而增加使用者骨髓內造血干細胞的絕對數目。本發明應用于增加骨髓內以及周邊血液內的造血干細胞的數目。文檔編號A61P7/00GK102805859SQ20121027551公開日2012年12月5日申請日期2008年5月27日優先權日2008年3月4日發明者吳國瑞,黃濟鴻申請人:臺灣尖端先進生技醫藥股份有限公司