一種提取早期造血前體干細胞的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取早期造血前體干細胞的方法及其應用。一種大量提取造血前體干細胞的方法，包含以下步驟：(1)從胎盤中分離單個核細胞；(2)從單個核細胞中先分選出CD133+陽性細胞群，然后再從CD133+陽性細胞群中分選出其中的CD133+CD34+細胞群，而流出的細胞群即為CD133+CD34-的造血前體干細胞。本發明發現在胎盤中含有比臍帶血濃度高10倍以上，含量高30倍以上的CD133+CD34-干細胞群，這種細胞群不但是造血干/祖細胞的起始細胞，具有長期重建造血細胞的能力，是移植給宿主后可以長期植活的干細胞，而且還具有較強的可塑性，在再生醫學和治療細胞損傷等疾病中具有廣泛的應用前景。
【專利說明】-種提取早期造血前體干細胞的方法及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，涉及一種大量提取造血前體干細胞的方法及其應用， 具體涉及一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細胞的方法及其應用。

【背景技術】
[0002] 隨著科學技術的進步，人們發現干細胞在特定條件下可經誘導分化為其它種類細 胞，人們期望將來用該種方法進行組織修復，用于治療帕金森癥、糖尿病、老年性癡呆、也臟 病、脊髓損傷等。我們的專利"從胎盤組織中提取造血干細胞用于建立造血干細胞庫的方 法"，專利號；ZL011311908,國際專利主分類號；C12N5/08中指出胎盤中含有豐富的造血干 細胞，因此可W代替異體骨髓來恢復重建患者的骨髓，換言之，即用它來置換骨髓。同時在 我們的另一篇專利中也提出了 "一種從剖腹產胎盤組織中提取原始間充質和造血干/祖細 胞方法"（專利號：200610098886)。該種方法可W用來收集來自于胎盤組織的單個核細胞 去建立造血前體干細胞庫。應用該些方法可W收集并長期凍存現在廢棄的新生兒胎盤內的 細胞，胎盤組織內的造血干細胞，建立自體或異體的胎盤造血前體干細胞儲存庫，提供全國 乃至全世界患者選擇胎盤造血前體干細胞為細胞治療應用。
[000引 CD34分子一直被認為是服C/造血祖細胞她C)的表面標記。血液界到目前為止 都W CD34+的HSC的含量作為移植能否成功的值標。1997年有科學家發現在哺乳動物體內 存在一群CD34-細胞也有重建造血的功能，表明CD34+是較為成熟的細胞，而CD34 -細胞是 更原始的服C。W后又有人提出表達CD133,不論是CD34陽性或陰性的服C/HPC移植到免 疫缺陷小鼠可W形成異位造血組織。同時發現CD133巧SC具有更強的促進血管形成的作用。 廝血CD133+細胞群中不僅富含服C (實際上當時沒有人認識到廝帶血只含有少量的CD34-細胞，大部分是CD34+細胞），而且該一群細胞具有更強的增殖潛能和長期造血重建功能，該 些提示CD133是比CD34更原始更幼稚的干細胞標志。研究證實，處于G。期的CD133+細胞 較處于Gi期的CD133-細胞更易大量富集而被激活參與造血，其長期造血功能優于CD34+細 胞群。
[0004] 自從發現、純化、標記抗CD34單克隆抗體開始，使流式細胞定量檢測在廝帶和胎 盤血或骨髓中的CD34陽性造血干細胞成為了可能。CD34抗原存在于各種祖細胞上，其中包 括多能干細胞和間充質干細胞。CD34抗原的分子量為105-120KD，具有一個高度糖基化的 類粘蛋白的結構。在流式細胞儀檢測中，對全血進行溶血來去除紅細胞，標本中直接加入英 光標記的CD34抗體進行染色，然后用流式機進行分析和計算。人CD34陽性細胞是造血干 細胞移植時的關鍵細胞，決定著移植成功與否的重要條件。目前，臨床上對是否能夠移植都 WCD34陽性細胞數量為唯一重要標準。人CD133抗原為5次跨膜糖蛋白，目前發現的同源 性抗原有CD133_1和CD133_2。其基因分別定位在人類的4號和2號染色體上。CD133首 先是作為造血干/祖細胞表面標志物而被發現，并被認為是比CD34更早期的表面抗原。利 用取自人類骨髓血經增生后的CD133+，帶有該種標記的細胞也稱為血管先驅細胞。細胞直 接注入也肌梗塞的大鼠也臟，有也肌細胞恢復的功能。從外周血中也可W分離出CD34+細 胞，在體外將其誘導分化成內皮細胞，植入動物下肢缺血模型中局部形成新生血管。還可能 治療缺血性疾病如也肌梗死、動脈硬化閉塞癥、糖尿病等，該些引起了人們的廣泛興趣。近 來發現CD133分子是服Cs (造血干細胞）特異性標志。CD133是一個新發現的造血干細胞 表面標志，在服Cs分化成熟過程中，CD133的含量迅速降低，而CD34抗原開始表達，當向血 液細胞分化時，CD34抗原表達開始消失。
[0005] 上述大量的臨床實踐已證實，來自于骨髓、動員周圍血及廝帶血中含有大量的造 血干/祖細胞，即CD34+細胞，該種細胞能夠重建受損傷的造血組織恢復造血功能。而該種 CD34+細胞來自于其更早期的細胞，即從CD133陽性細胞分化而來，而正是該種CD133+CD34+ 或CD33+CD34-細胞群移植給宿主后可W長期植活。廝帶血中僅含有少量CD133+CD34-細胞， 該也造成廝帶血移植后，部分造血干細胞不易植活，或需要植活的時間長的重要原因之一。


【發明內容】

[0006] 本發明首先發現廝帶血中不含有CD33+CD34-細胞，而胎盤血和胎盤組織富含該類 細胞，僅管骨髓也有該類細胞，但骨髓不能規模提取。本發明的目的是針對現有技術的上述 不足，提供一種從胎盤大量提取早期造血前體干細胞的方法。
[0007] 本發明的另一目的是提供胎盤造血前體干細胞的應用。
[000引本發明的目的可通過W下技術方案實現：
[0009] 本發明從胎盤血和胎盤組織中發現一種新型的干細胞群，命名為胎盤早期造血前 體干細胞：
[0010] (1)該種細胞群來自于去除廝帶血后殘留在胎盤內的血液或是從胎盤組織中經過 機械處理（沖洗、擠壓、碼磨），或酶消化（膜酶、膠原酶、木瓜酶）等獲得的單個核細胞。
[0011] (2)該種細胞群在流式細胞儀（FACS)的檢測中為CD133+CD34XDl(n-CD29-CD3r， 幾乎不存在于正常人周圍血和廝帶血中。
[001引 做造血前體干細胞為一群CD133+CD34-和CD133+CD34+的干細胞群，而 〔0133+〔034^為早期造血前體干細胞，該種干細胞存在于提取的胎盤干細胞內，它可^通過 胎盤分離濃縮后于液氮內長期保存。
[0013] (4)該種細胞群在干細胞集落培養試驗中，其形成集落細胞（即每個細胞能擴增 成50個細胞W上）遠較CD133-CD34+細胞為晚，在培養后的24小時，后者即可形成大量 成堆的細胞群的集落，而早期造血前體干細胞細胞需96小時W上。CD133-CD34+細胞能 生成早期集落，但不易長期生長，而是CD33+細胞可W長期穩定生長，移植標準應該W程度 CD133+的含量多少來預測移植物的植活效果
[0014] (5)該種細胞群可W和干細胞生長因子佑-CSF、GM-CSF、SCF等）或血管內皮生長 因子（VEG巧等共同培養，該細胞群可貼壁生長，具有明顯的遷移性，形成單層細胞，具有向 內皮細胞分化的功能，即該類細胞可分化為CD133+的血管內皮干/祖細胞。
[0015] (6)該類細胞在有干細胞刺激因子佑-CSF，EP0)的培養液中，具有大量增殖的功 能，可W擴增到1000倍W上，其擴增后的終未細胞主要為紅細胞系，巧PO的刺激下），但如 果和白細胞刺激因子共同培養，也可擴增為大量的白細胞。
[0016] (7)該類細胞具有更大的可塑性，在體外培養系統中，當該類細胞貼壁生長W后， 加入組織細胞相應的刺激因子，具有向肝臟細胞，骨細胞，也臟細胞，神經細胞等形成的能 力。
[0017] (8)在移植免疫免疫缺陷病小鼠動物模型中，W同等劑量，用來自胎盤的早期造血 前體干細胞CD133+CD34-細胞群和CD133+CD34+細胞群注射給干細胞移植小鼠動物，早期造 血干細胞具有長期植活效能。
[0018] (9)早期造血前體干細胞的標志為CD133+CD34-，而CD133分子量為120邸a,具有5 個跨膜區，它在體外培養中，可W形成各種紅細胞，（CFU-E)，白細胞（CFU-GM和CFU-GEMN) 集落群。可W采用MACS磁珠分選的方法，體外純化該種造血前體干細胞。
[0019] 一種大量提取早期造血前體干細胞的方法，優選包含W下步驟：
[0020] (1)從胎盤組織或胎盤血中分離單個核細胞；
[0021] (2)從單個核細胞純化CD133陽性細胞中的早期造血前體干細胞。
[0022] 其中，所述的從胎盤中分離的單個核細胞優選進行濃縮后在進行分選。
[0023] 步驟（2)從單個核細胞純化CD133陽性細胞中的早期造血前體干細胞優選W下任 一方法，進一步優選W下的磁珠法。
[0024] (1)磁珠法，0)流式法，0)雙抗體法，（4)活體培養法
[00巧]磁珠法：采用帶抗CD133抗體的磁珠和來自胎盤的單個核細胞混合，賠育，然后通 過一個和磁珠相結合的分離柱，所有帶有CD133抗原的細胞都結合在柱子上，其它的細胞 均沖洗掉。然后改變酸堿度的緩沖液沖洗殘留在柱子內的帶CD133抗原的細胞，該個細胞 群為所有CD133+的細胞，該種方法回收率在80% W上，純度可高達90%。把濃縮后的CD133 陽性細胞，再經過含抗CD34抗體的磁珠，用同樣的方法分離，所有CD133+CD34-細胞先行洗 脫下來，殘留在柱子體內的為CD133+CD34+細胞群。
[0026] 流式細胞儀分選法；采用流式細胞儀雙抗體帶各種英光標記方法，可W從單個細 胞分選所需要的細胞，在此采用的是抗CD133抗原及抗CD34抗原的雙抗體，能夠從胎盤分 離和濃縮后的單個核細胞分選所需要的CD133+CD34-和CD133+CD34+的細胞群。
[0027] 雙抗體法：此時采用當抗體和具有該抗原的細胞給合后，再加入抗第一抗體的第 二抗體，則可把該細胞從溶液中分流出來。該兒也是采用如鼠抗人CD133抗體，鼠抗人CD34 抗體，然后再加入羊抗鼠IgG的抗體，則可成功的把所需要的細胞分離出來。
[0028] 活體培養法；采用無免疫功能的小鼠，把大量從胎盤中分離，濃縮后的單個核細胞 輸注給小鼠，在一定的時間，如2,4周，從小鼠骨髓中提取干細胞，其內含有大量人來源的 能維持長期植活的造血干細胞，然后再結合著磁珠或流式分選法，分選出具有CD133+的細 胞。
[0029] 步驟（1)所述的從胎盤血和胎盤組織中分離單個核細胞的方法優選：
[0030] (1)收集胎盤，向廝帶靜脈內注入含有25到50毫升抗凝劑和抗生素的生理等滲溶 液或緩沖液，采用廝帶動、靜脈灌注法收集胎盤血。
[0031] (2)采用有機溶劑及生理緩沖液清除胎盤組織和廝帶外表的透明質粘液，采用機 械擠壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液；
[0032] (3)離也收集胎盤組織干細胞；將胎盤組織、羊膜和絨毛膜組織用生理鹽水洗涂 后剪碎，采用0. 25%的膜酶、0. 1-1 %的膠原酶II、0. 5% Dispense II酶，或加入0. 05到 0. 2%的邸TA,在37C溫箱內賠育或攬拌30到60min，收集、過慮、離也獲得的細胞為胎盤單 個核細胞。
[0033] 其中，步驟（3)所述的過濾、離也的蓋體方法為：
[0034] 過濾；收集后的胎盤血和組織干細胞均通過各層尼龍或鋼絲濾網，最小的為 50um,最大的為100mm，收集單個核細胞；
[0035] 離也；將W上細胞收集到50毫升的離也管內，在離也機中W l，500g離也10分鐘， 去掉70 %的液體，然后按照W下任一方法進行處理：
[0036] (a)收集的細胞和淋己細胞分離液按1:4的比例混合，在離也機中W 2500g離也 30分鐘，去掉殘存紅細胞W及成熟的粒細胞，收集液面間的細胞，細胞用1640培養液洗二 次；
[0037] 化）將提取的含有胎盤組織或胎盤血干細胞溶液和6%高分子輕己基淀粉按1:3 到1:6比例混合，150化pm, 4°C離也5到20min，棄去紅細胞，保留上清液，然后用低分子右 旋糖酢（含鹽）將其洗涂H次，把所收集的細胞制成單個核細胞混息液。
[0038] 按照本發明所述的方法提取的胎盤CD133+CD34-早期造血前體干細胞在制備幫助 和促進干細胞再生的藥物中的應用。采用胎盤組織造血前體干細胞移植能夠幫助、加速干 細胞移植的存活。
[0039] 按照本發明所述的方法提取的胎盤早期CD133+CD34-造血前體干細胞在制備治療 腦積水、也腦血管疾病、肝壞死、肝硬化、糖尿病、關節炎、肺纖維化（塵肺）自體免疫性病、 脊髓損傷性疾病、紅斑狼瘡、硬皮病、腎炎、性細胞功能障礙性疾病、先天性或后天性疾病的 藥物中的應用。
[0040] 所述的也腦血管疾病優選腦溢血，腦血栓、也肌梗塞、冠也病中的任意一種；所述 的糖尿病優選重型糖尿病，或膜島素依賴性糖尿病；所述的關節炎優選關節退化的骨關節 炎；所述的性細胞功能障礙性疾病優選性冷淡或陽瘦；所述的先天性或后天性疾病優選肌 肉服大癥、腦萎縮或老年性癡呆癥中的任意一種。
[0041] 在造血干細胞移植中，組織配型相符的前體造血干細胞可W和廝帶血、胎盤間充 質干細胞、骨髓血、或動員周圍血干細胞同時輸注給病人，加速造血干細胞的植活。
[0042] 當應用于臨床時，可W采用新鮮胎盤前體造血前體干細胞，也可采用冷凍保存，再 融化，再培養的前體造血前體干細胞。
[0043] 采用胎盤早期造血前體干細胞用于臨床時，可W不用或僅需要做HLA低分辨配 型，不會有排斥反應，可W在病人體內長期存活，有長期植活的功效。
[0044] 胎盤早期造血前體干細胞可W在體外培養后應用于病人。每次應用為IXIOVkg 至5X10 Vkg體重。
[0045] 所采用的胎盤早期造血前體干細胞可W制備成針劑，袋裝靜脈輸液袋，也可制備 成瓶裝輸液瓶。在病人臨床應用時，由我公司直接制備成各種針、水劑，直接供病人應用，也 可W冰凍袋在-8(TC的條件下，輸送到病人所在醫院應用。如果是W冰凍袋或保存袋的形式 到醫院直接供病人應用，需按照我公司的說明書，即用4C的生理鹽水，等滲葡萄糖液，DMEM 培養液或含高滲葡萄糖的PBS (磯酸鹽緩沖液）進行稀釋，離也后才能應用。
[004引發明詳述
[0047] 收集胎盤：把胎盤放于無菌盒子內運輸到無菌間，向廝帶靜脈內注入含有25?50 毫升抗凝劑和抗生素的溶液，該抗凝劑可W是肝素，或構稼酸軸，抗生素是1 %的青霉素，鏈 霉素，慶大霉素，也可加制霉菌素，溶液可W是0. 9%的生理鹽水等滲磯酸緩沖液或DMEM細 胞培養液，然后用夾子夾住廝帶，豎起廝帶一分鐘（用手順著廝帶往胎盤處向下持，讓溶液 進入胎盤。把整個胎盤無菌的放到無菌容器和采集箱。
[0048] 收集胎盤血；在無菌環境下，向廝帶靜脈內注入含抗生素，如1%的青霉素，鏈霉 素，慶大霉素，也可加制霉菌素，溶液可W是0.9%的生理鹽水等滲磯酸緩沖液或DMEM細胞 培養液，然聯接廝帶動脈，中間聯接生物粟，形成循環，時間在1到24小時，收集來自于胎盤 內的血，命名為胎盤血，胎盤血內的細胞為單個核細胞。
[0049] 清洗胎盤組織：當胎盤進入無菌環境后，采用有機溶劑及生理緩沖液清除胎盤組 織和廝帶外表的透明質粘液和母血。采用1號消毒劑（酒精、氯化軸、磯酸氨二軸、磯酸二氨 軸和楓），該消毒劑內，酒精濃度為50 %?75 % W及含有0. 1?0. 5 %的楓和0. 1到0. 25M 的磯酸緩沖液，抑為7. 2到7. 6之間，用于清洗胎盤及廝帶表面，殺滅任何可能存在胎盤 膜和廝帶表面上的微生物污染，清除胎盤組織和廝帶外表的透明質粘液。采用2號有機溶 劑（在1號消毒劑的基礎上減去楓，該消毒劑內，酒精濃度為50%?75%，含0. 1?0. 25M 磯酸緩沖液，抑為7. 2到7. 6之間）用于清洗胎盤及廝帶表面。3號消毒劑清潔液（酒精 和0. 9%氯化軸，其中，酒精濃度為50%?75%，氯化軸濃度為0. 9%，抑為7. 2到7. 6之 間）用于清洗胎盤及廝帶表面，也可W用磯酸緩沖液（pH7. 4)或低分子右旋糖酢或細胞培 養液（DMEM)清洗。采用機械擠壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液。 該緩沖液可W含有抗菌素，像青霉素（lOOU/ml)，鏈霉素（lOOg/ml)也可含有2500到10， 000單位的無防腐劑的肝素；該生理緩沖液的成分可W是生理鹽水，低分子右旋糖甘，磯酸 緩沖液（phosphate-buffered saline)或細胞培養液，像 1640，DMEM值U化ecco's modified Eagle' S medium)，其所含單個核的細胞稱為單個核細胞，細胞總量在0. 3到10. 5X109間。
[0050] 收集胎盤組織單個核細胞細胞；采用輸液器（可W用注射器或輸液粟）從廝帶靜 脈或廝帶動脈注入0. 25%膜酶（Tirpsion)，或0. 1-1 %膠原酶II (Collegenase)，或0. 5% Dispense II 酶，也可加入 0.05 到 0.2% 的巧thylene diamine tetra acetic acid) (邸TA)，在37°C溫箱內賠育含有組織細胞分離酶的胎盤30分鐘到90分鐘，然后在廝帶靜脈 或廝帶動脈內灌注生理緩沖液沖洗，該生理緩沖液的成分可W是生理鹽水，低分子右旋糖 甘，磯酸緩沖液（phosphate-buffered saline)或細胞培養液，像1640, DMEM值U化ecco' S modifie祀agle'S medium),每沖洗一次，然后擠壓一次，收取含有W胎盤單個核細胞為主的 血液和組織液的混合液，沖洗，擠壓3到5次，時間在30到90分鐘之間，該樣收取的緩沖液 的混合物為含有胎盤單個核細胞，其體積在100到800毫升之間。該緩沖液可W含有抗菌 素，像青霉素（lOOU/ml)，鏈霉素（lOOg/ml)也可含有2500到10,000單位的無防腐劑的肝 素。該種用酶消化，攬拌，擠壓，洗涂等方法收集的細胞稱為胎盤組織單個核細胞。
[0051] 收集胎盤組織（膜）單個核細胞；從胎盤組織分離羊膜和絨毛膜組織，用生理鹽 水洗涂后剪碎，采用0. 25%的膜酶（Tirpsion)或0. 1-1 %的膠原酶II (Collegenase)，或 0.5% Dispense II 酶，或加入 0.05 到 0.2%的巧th}dene diamine tetra acetic acid) (邸TA)，在37度溫箱內賠育或攬拌30到60分鐘，收集、過慮、離也獲得的細胞為胎盤組織 單個核細胞。（從膜或胎盤組織內一起獲得的細胞統稱為胎盤組織單個核細胞）圖1可W 清楚的看到染色單個核細胞。
[0052] 收集到的胎盤單個核細胞均通過下述處理方法：
[0053] 1)收集的胎盤血或組織干細胞均通過各層尼龍或鋼絲濾網，最小的為50um，最大 的為100mm，收集單個核細胞。
[0054] 2)將來自于胎盤的細胞收集到50毫升的離也管內，在離也機中W l，500g離也10 分鐘，去掉70%的液體。然后可有W下二種方法。
[0055] 2. 1)收集的細胞和淋己細胞分離液按1:4的比例混合。在離也機中W 2500g離 也30分鐘，去掉殘存紅細胞W及成熟的粒細胞，收集液面間的細胞，細胞用1640培養液洗 二次。
[0056] 2. 2)另一種方法是將提取的含有胎盤組織原始間充質和造血干/祖細胞溶液和 6%高分子輕己基淀粉Ofespan,大于60,000道爾頓）按1:3到1:6比例混合，150化pm巧00 到1，OOOg), 4度離也5到20分鐘，棄去紅細胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酢（含 鹽）將其洗涂H次，把所收集的細胞為濃縮單個核細胞，將其制成單個核細胞混息液，并做 單個核細胞計數，測定細胞活性，計算CD34、CD4、CD8細胞含量及做體外培養的白細胞集落 (CFU-GM)，紅，白細胞集落（CFU-GEMM)和間充質集落（CFU-F)。圖2為濃縮后的胎盤細胞， 染色的細胞為單個核細胞。
[0057] 將做完各種檢測，包括，病毒，細菌培養和組織配型的廝帶血（是采用廝帶血做 檢測而不是用于提取），胎盤血和胎盤組織干細胞按照上述方法分別制成單個核細胞，W IXlO 7到IXlO8Ail的濃度和DMSO (二甲亞諷）混合，且W 10 %的終濃度DMSO和低分子右旋 糖酢降溫到零下8(TC，然后轉移到液氮（-186C)液相中深低溫分別保存保存，W備移植時 應用。
[005引提取胎盤造血前體干細胞；VlM'消枝術已經成為細胞磁性可W分選CD34陽性和 CD133陽性的細胞金標準，有其強大的優勢和廣泛的用途；從小量分選到大規模分選，從高 頻細胞到稀有亞群的細胞分選，可W高效的、可重復的及高質量的細胞分離結果來自于胎 盤內的干細胞群，可W實現細胞的全自動分選，而不需要專口的人員或技巧。細胞分選試劑 可W從各種物種和樣品中獲得幾乎所有類型的細胞，選柱用于快速分選被MACS磁珠標記 的細胞，細胞即可被分選柱放大的磁場捕獲。溫和的分選環境，在保證細胞的回收率和純度 的同時，更保護了細胞表面抗原表位，因此，分選得到的細胞表位完好，細胞功能不受影響， 用于從抗凝處理的全血中快速進行細胞的陰性分選，最多一次處理30血全血，無需密度梯 度離也等步驟，可W加速紅細胞的沉降，W便去除非目的細胞，即可方便地從上清液中獲得 目的細胞。先采用含抗CD133的磁珠抗體從胎盤干細胞中濃縮純化含CD133的細胞，再用 抗CD34磁珠抗體從含CD133的細胞群內分離出CD133+CD34-的干細胞群，也稱為早期造血 前體干細胞，像圖2所示，采用磁珠純化后的細胞染色，著色細胞大，細胞核幾乎占據整個 細胞，細胞質疏松。
[0059] 胎盤早期造血前體干細胞的培養；取塑料IOOcm2或75cm2的培養皿或培養瓶，在培 養皿內放到l-5ml的培養液，培養液可用DMEM或2-Mebicm，或1640培養液，其中含有10% 的血清，該血清可W是胎盤血清（FB巧，也可W是無血清培養液，含有細胞刺激因子，像纖維 細胞生長因子，白細胞生長因子等，培養時間為每3天換液一次，此時，細胞經過用培養液 清洗后，可W再次培養和再次保存，胎盤早期造血前體干細胞仍然保持原有的特性。
[0060] 對胎盤早期造血前體干細胞的檢測；胎盤自進入實驗室或公司后，首先要做各種 病毒的推測，像己型肝炎表面抗體，丙型肝炎病毒抗體，艾滋病毒抗體，巨瞻細胞病毒抗體 W及梅毒抗體，只有在各種檢測為陰性時，才能進行下一步的胎盤沖洗和清除殘留紅細胞 程序。在獲得胎盤造血前體干細胞后，首先要進行胎盤霉菌培養，只有在各種培養陰性后， 提取的胎盤早期造血前體干細胞需進行組織配型（HLA)的分子生物學低、高分辨檢測，HLA 一類抗原（A，B)和HLA二類抗原值時，所有資料將由電腦軟件和條形碼控制和管理。所有 培養后的胎盤造血前體干細胞需要流式細胞儀檢測。圖3,為采用磁珠分離后的胎盤造血 前體細胞流式檢測。該圖為磁珠抗CD133抗體純化后的細胞，可見有CD133和CD34雙陽性 的細胞，圖4為再次采用抗CD34磁珠抗體純化去除CD34陽性細胞，為CD133陽性的細胞群。 圖5為白細胞集落檢測（CFU-GM)和圖6為紅一白細胞集落檢測（CFU-GEMM)，每一堆細胞都 是來自于一個早期造血前體干細胞。
[0061] 胎盤造血前體干細胞的臨床適應癥：縱上所述，胎盤造血前體干細胞的治療機理， 一是利用該干細胞的多能分化型，他可W在特定的環境下，分化成人體組織的各種細胞，像 神經，皮膚，骨骼，軟骨，肌肉，肝臟，也臟，脂肪和膜島細胞，二是利用該細胞能分化各種細 胞趨化因子和細胞刺激因子來幫助受損細胞核組織修復和幫助受損細胞再生，據此該干細 胞在臨床上可用于下列疾病的治療：
[0062] 腦血管病；腦出血、腦血塞、老年癡呆等
[0063] 也血管病：也肌梗塞、也絞痛、也肌病
[0064] 內分化性疾病；糖尿病
[0065] 消化性疾病；肝硬化
[0066] 呼吸系統疾病：肺硬化肺巧
[0067] 自體免疫性疾病；紅細胞疾病肺纖維化，紅斑狼瘡，硬皮病，腎小球腎炎
[0068] 免疫排斥性疾病：移植物抗宿主病
[0069] 造血前體干細胞臨床使用方法；經過培養收集后的胎盤造血前體干細胞在臨床使 用前，需要再次進行下列檢測：
[0070] ①流式細胞儀分析；其早期造血前體干細胞中為CD133+和CD34-陰性細胞需占整 個細胞群體的70% W上。
[0071] ②培養胎盤造血前體干細胞的上清液需再次做細菌培養，必須確認無任何微生物 生長和外來動物蛋白。
[0072] ③復查HLA配型，需用的胎盤造血前體干細胞其HLA低分辨中的I類和II類抗原 必須有4個W上任意和使用者的HLA配型相符。
[0073] ④檢測胎盤造血前體干細胞的活性，要求在需使用時，其活性要大于90% W上。
[0074] ⑥檢測胎盤造血前體干細胞的數量，要求再次給予病人的造血前體干細胞數要大 于1.0X 1〇5/公斤體重。
[00巧]輸注胎盤造血前體干細胞的輸液袋，要求是無菌，無毒，符合國家衛生部要求，輸 液袋要有明顯的標簽，XX胎盤造血前體干細胞的含量，活性和HLA配型W及生產廠家和生 產日期，失效日期等。
[0076] 該專利提供了一種采用胎盤造血前體干細胞用于免疫調節的方法，描述了如何生 產和培養、篩選有活性的胎盤造血前體干細胞。來自于胎盤的造血前體干細胞，在體外通過 培養和擴增，至少具有下列細胞表面標志；CD133+，W及不具有CD34, CD45。含有胎盤早期 造血前體干細胞的塑料輸液袋，該輸液袋為密封和無菌，中間有管道用于靜脈輸液。本專利 提供了一種從胎盤中提取，鑒定，培養，低溫保存和培養，擴增，保存的胎盤早期造血前體干 細胞。
[0077] 胎盤造血前體干細胞具有強烈的細胞分化和分泌體內各種刺激因子的功能，可用 于治療各種慢性炎癥性疼痛，也血管疾病和肝硬化，糖尿病及自身免疫疾病。
[0078] 按照我們的方法，提取的胎盤早期造血前體干細胞都是活性大于90% W上。能 分泌巧tokines (化-1，alpla,比-1，beta, IFN-gamma, TFN,蛋白小分子激素（Hormones, an化Ogen,雌激素，膜島素，prolectin素，膠原蛋白等。至少1. 7X lOVkg，最好是2. 5X IO6/ kg造血前體干細胞可用于抗炎癥（anti-inflammation)的效果，可用于任何炎癥疾病，而 且該種炎癥可W表現在任何組織，任何器官，像肌肉，神經，腦，脊髓，周圍神經，血管組織， 也臟，膜島，腸，消化道，肝臟，肺，腎，生殖系統，內皮和內分泌系統，也可W用來治療自身 免疫疾病，尤其是伴有炎癥時，像糖尿病，amylotrophic lateral sclerosis, myasthenia fravis diabeticmeutropaathy, inpus,Alzheimer' s,Pakinson' s.sickle cell anemia, pompe' S diseases, pheny化etonuria(PKU)胎盤早期造血前體干細胞非常適合外傷W 后，細胞和組織的恢復，該些外傷包括但不限于中樞神經系統疾病損傷，像腦出血，腦血 栓，脊髓或周圍神經損傷，也肌損傷，像也肌梗塞，也肌缺血，肌肉或骨骼損傷（像肌肉或 初帶損傷），骨折，消化系統損傷，像肝硬化，肝炎，結腸炎，生殖系統損傷，像不育癥，泌尿 系統損傷，像腎小球腎炎，內分泌系統損傷，像膜島素依賴型糖尿病，W及一切由于物理 原因的皮膚或黏膜損傷，像燒傷，核放射，凍傷等。該種早期造血前體干細胞也非常適合 于老年性細胞退行性變而引發的疾病，像老年性關節炎，阿莫而氏病ACS，帕金森綜合癥 (Parkinson' S)。
[0079] 本專利提出HLA相符的胎盤早期造血前體干細胞治療能夠大大增強維持干細胞 的療效，因而采用自體胎盤早期造血前體干細胞保存，不但能維持自體保存人的應用，而且 可造福于整個家族，對于異體早期造血前體干細胞的應用，也是要建立一個鹿大的異體早 期造血前體干細胞庫，并對自體保存每一例的早期造血前體干細胞HLA配型，在臨床使用 時，HLA有分子生物學低分辨4個W上位點相符（HLA:A，B，DR)胎盤早期造血前體干細胞在 使用前的保存溫度，如果是在冰凍時保存，應該W干冰形式運輸，也可W在小型液氮罐中， 如果是已經在培養液中存活的細胞，則應保存在4-l(TC。根據細胞狀態，保存時間不一；在 液氮管中可W長期保存，在干冰中可W保存18-21天，而在培養液內為24-48小時。
[0080] 胎盤早期造血前體干細胞的使用劑量；應用胎盤造血前體干細胞作為細胞治療， 必須要給病人高劑量的細胞才能發揮療效，小劑量的注射只能對病人有害，使病人發生免 疫反應，產生過度應激狀態，我們采用2倍W上的造血干細胞移植的劑量，如在造血干細 胞移植時應用1 X IO9單個核細胞，如若是來自于骨髓血，則相當于0. 1-0. 6X IO7造血干 細胞，而我們采用的胎盤造血前體干細胞的含量為1-10 X IO5/每體重公斤胎盤造血前體 干細胞的使用量，該些干細胞可W-次性注入，也可W間隔數天分多次注入。注射的部位 多通過周圍靜脈輸注，但根據病情，也可W局部應用，像周圍靜脈注射，脊髓腔注射，腦部 注射，關節腔內注射或也冠狀動脈注射，也可在體內任何組織或器官損傷部位注射含胎盤 造血前體干細胞的輸液袋。培養，擴增后的胎盤早期造血前體干細胞保存在無菌輸液袋 中，該袋子的長為18,寬為15,高為10,為一透明無毒無菌國家衛生部口許可應用與人類 靜脈輸注的輸液袋該袋子的外部標有出廠單位，時間，袋內胎盤造血前體干細胞的數量，活 性，名稱，保存溫度，保存時間W及血型和HLA配型。胎盤造血前體干細胞的輸液袋需裝 在一個不怕損壞的鉛盒中，W保證該輸液袋在運輸過程中不會被損壞，該種鉛盒，長19,寬 19,高12,打開鉛盒后可W放入輸液袋，然后蓋上鉛盒，盒的上方有一開口，可W觀察輸液 袋內的情況。在該輸液袋內除含有胎盤造血前體干細胞W外，還可含有細胞刺激因子，像 GM-CSF，紅細胞刺激因子巧PO),干細胞刺激因子（FIT)等，也可含有各種白介素刺激因子， 像比-2,比-4,比-6, CD401，IFN-alpha，TNF-alpha，IFN-beta-3,也可 W含有各種細胞組織 的干細胞刺激因子，像肝細胞刺激因子化巧atowte growth化Ctor),也肌細胞刺激因子 (cardiotropin-l)，血管緊張刺激因子 I，II ,III (angiotensin)，IFN-famma,內皮細胞刺激 因子，巧piciermalf;row1:h factor),纖維細胞刺激因子化asic fibroblast growth factor), 也可W含有抗菌素，像10-100單位/ml的青霉素和10-100微克的鏈霉素。
[0081] 凍融和造血前體干細胞移植治療；當臨床確認需應用某例胎盤干細胞時，在病人 床前從液氮內取出干細胞，于37C電動水浴箱內融化，在血細胞幾乎即將凍融完畢時，加入 低分子右旋糖酢等量混合，按順序給病人輸注。
[0082] 根據病人的病情需要，可W分別凍融多種來源的干細胞，也可一次性的凍融多種 細胞聯合給病人應用。對體重小于10公斤的病人可W只用一袋廝帶血，對體重大于10公 斤小于30公斤的病人可W用廝帶血和胎盤血干細胞，對體重大于30公斤W上的病人廝帶 血、胎盤血造血干細胞W及胎盤組織造血前體干細胞。
[0083] 本發明制備的胎盤組織早期造血前體干細胞一般W靜脈輸入為主，但也可W局 部直接進入到骨髓組織內，也可通過任何其它的途徑，像動脈注入等方法輸注給病人。本 發明主要應用的藥學成分或含有生理鹽水、低分子右旋糖酢、廝帶血漿、DMEM值U化ecco' S Modified Essential Medium)培養液、注射用水等。W上所用溶液均是無菌、無熱原制備W 及可用臨床移植的病人。
[0084] 有益效果：
[0085] 干細胞是具有自我復制和向各種細胞分化潛能的原始細胞，是形成生命機體各組 織器官的起源細胞。人類個體的發育過程實際實質就是干細胞的自我更新和增殖分化的過 程，而各個器官的細胞也是分別來源于各個器官的干細胞，像肝臟，神經，腦組織，膜腺，皮 膚等。按干細胞的種類有：
[008引 1.胚胎干細胞
[0087] 胚胎干細胞是最原始，可分化程度最高的細胞，也是受精卵結合后形成胚胎的初 始階段，它可W分化成各種細胞，甚至可W采取核移植的方法，利用自體體細胞分化成各種 細胞。臨床應用時必須破壞胚胎，讓其分化成其它細胞，由于細胞的高度分化性，易形成腫 瘤細胞，因而不可能用該類細胞提取任何造血干細胞。
[0088] 2轉基因多能干細胞
[0089] 轉基因多能干細胞，也稱為induced pluripotent stem cell (iP巧是由日本科學 家（獲得諾貝爾獎）首先發現的自體成體細胞在基因轉染后具有胚胎干細胞的功能，但最 大疑問就是轉染細胞也可W同時具有腫瘤細胞的可能性，要全面應用于臨床，還需要大量 的科研和時間，因而不可能用該類細胞提取任何造血干細胞，它的主要用途還是用于組織 修復。
[0090] 3成體干細胞：
[0091] 成體干細胞是人出生W后，各器官還自行保留能再生的細胞。該種干細胞是越年 輕的機體，含量越豐富，可分化程度越高。1998年，在美國Wisconsin大學首先發現在成人 骨髓中也具有能分化成各種組織細胞的干細胞，隨后人們認識到人體內各種組織細胞都存 在著該種細胞，稱為成人干細胞（ASC細胞），它具有和胚胎干細胞同樣的功能。成體干細胞 可分為：
[0092] 3. 1成人骨髓干細胞：主要是含有能分化成人體血液細胞的干細胞，像白細胞，紅 細胞，血小板等。有人采用骨髓研究，MACS分選后CD133+細胞功能性研究表明，CD133+細 胞具有長期培養起始細胞（Long-term州hure-initiating cells,LTC-IC)和長期重建造 血細胞（Long term r巧opulation cells, LTRC)的能力，為最原始的造血細胞，移植給宿主 后可W長期植活。此外，最近研究發現LTC-IC主要見于AC133+CD34+亞群，一小群CD1337 CD34-細胞也具有長期增殖潛能。顯然，由于來源的困難，采用骨髓只能用于科研，不能用于 大規模提取。
[0093] 3. 2周圍血干細胞；正常人周圍血內不含有或有很少量的干細胞，但是在應用了 一種稱為白細胞刺激因子的藥物后，骨髓血中的干細胞可W釋放到周圍血中，所W也稱為 周圍動員血干細胞，該類細胞W CD34+細胞為主，只含有少量的CD133+細胞，同骨髓一樣，由 于來源的困難，采用周圍血干細胞只能用于科研，不能用于大規模提取。
[0094] 3. 3廝帶血干細胞。是新生兒出生后，廝帶血中的干細胞，它含有豐富的造血干細 胞。由于來源方便，取材容易，所W對它的研究最為廣泛，所做的廝帶血CD34和CD133分選 研究發現同一份標本的CD34+細胞擴增潛能低于CD133+細胞。因此AC133分選可能優于 CD34分選。但正如在我們表1中指出的那樣，廝帶血中含有豐富的CD133+CD34+細胞，但幾 乎不含有CD133+CD34 -細胞，而胎盤血正好相反，血中含有豐富的CD133+CD34-細胞，但僅含 有只占10%左右的CD133+CD34+細胞，因而，廝帶血的工作僅是造血前體干細胞，而不是早 期造血前體干細胞。那么，為何沒有人研究胎盤干細胞；該主要是：
[0095] 1)把廝帶血干細胞的科技帶到國內是由本發明人在1996年首先在國內開發的。
[0096] 2)發現胎盤血內含有豐富的造血干細胞的國內外第一篇論文也是本作者在2004 年首先發表。
[0097] 3)本作者在2005年申請了胎盤干細胞專利。
[0098] 4)更重要的是本作者掌握了如何無菌，保證細胞活性，是提取胎盤干細胞的關鍵， 而該正是本作者獲得成功，在該個基礎上，在此前，沒有任何人想到和發現廝帶血和胎盤血 在該方面有如此巨大的差異，我們發現了胎盤內含有廝帶血中不含或很少量的早期造血前 體干細胞。
[0099] 表1 ;廝帶血和胎盤血組份的比較
[0100]

【權利要求】
1. 一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細胞的方法，其特征為：所述的早 期造血前體干細胞為一群⑶133+⑶的細胞群，來源于去除臍帶血后殘留在胎盤內的血 液或是從胎盤組織經過機械處理或酶消化獲得的單個核細胞，在流式細胞儀的檢測中為 ⑶133+CD34TD105TD29XD3r，幾乎不存在于正常人周圍血和臍帶血中。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 從胎盤血或胎盤組織中分離單個核細胞； (2) 從單個核細胞中先分選出CD133+陽性細胞群，然后再從CD133+陽性細胞群中分選 出其中的⑶133+⑶34+細胞群，而流出的細胞群即為⑶133+CD34_的造血前體干細胞。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的從胎盤中分離的單個核細胞進行濃 縮后再進行分選。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于步驟（2)通過從濃縮后的胎盤單個核細胞 中采用MACS磁珠分選出CD133+CD341 勺早期造血前體干細胞，或者從濃縮后的胎盤單個核 細胞中采用任何抗CD34或抗CD133的抗體和生物反應素結合，或者和第二抗體結合去分選 ⑶133+CD3C的早期造血前體干細胞。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于采用MACS磁珠分選的方法，用抗CD133磁 珠單克隆抗體從單個核細胞中先分選出CD133+陽性細胞群，然后再從CD133+陽性細胞群 中應用抗CD34磁珠單克隆抗體分選出其中的CD133+CD34+細胞群，而流出的細胞群即為 ⑶133+CD3C的早期造血前體干細胞。
6. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的從胎盤血或胎盤組織中分離單個核 細胞的方法為： (1) 收集胎盤，向臍帶靜脈內注入含有25?50毫升抗凝劑和抗生素的生理等滲溶液或 緩沖液；采用臍帶動、靜脈灌洗法收集胎盤血；其中，所述的抗生素選自青霉素、鏈霉素或 制霉囷素； (2) 采用有機溶劑及生理緩沖液清除胎盤組織和臍帶外表的透明質粘液，采用機械擠 壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液； (3) 離心收集胎盤組織干細胞：將胎盤組織、羊膜和絨毛膜組織用生理鹽水洗滌后剪 碎，采用0. 25%的胰酶、0. 1-1 %的膠原酶II、0. 5% Dispense II酶，或加入0. 05到0. 2% 的EDTA，在37°C溫箱內孵育或攪拌30到90min，收集、過濾、離心獲得的細胞為胎盤組織干 細胞。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟（3)所述的過濾、離心的具體方法為： 收集的胎盤血干細胞和胎盤組織干細胞均通過各層尼龍或鋼絲濾網，最小的為50um， 最大的為100mm，收集單個核細胞； 將來自于胎盤或胎盤血的單個核細胞收集到50毫升的離心管內，在離心機中以 1，500g離心10分鐘，去掉70 %的液體，然后按照以下二種方法之一進行處理： (a) 收集的細胞和淋巴細胞分離液按1:4的比例混合，在離心機中以2500g離心30分 鐘，去掉殘存紅細胞以及成熟的粒細胞，收集液面間的細胞，細胞用1640培養液洗二次，得 到濃縮后的胎盤單個核細胞； (b) 將提取到的濃縮后的胎盤單個核細胞和6%高分子羥乙基淀粉按1:3到1:6比例 混合，1500rpm，4°C離心5到20min，棄去紅細胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酐（含 鹽）將其洗滌三次，把所收集的細胞制成單個核細胞混懸液。
8. 按照權利要求1?7中任一項所述的方法提取的早期造血前體干細胞在制備幫助和 促進干細胞再生的藥物中的應用。
9. 按照權利要求1?8中任一項所述的方法提取的期造血前體干細胞在制備治療腦積 水、心腦血管疾病、肝壞死、肝硬化、糖尿病、關節炎、肺纖維化（塵肺）自體免疫性病、脊髓 損傷性疾病、紅斑狼瘡、硬皮病、腎炎、性細胞功能障礙性疾病、先天性或后天性疾病的藥物 中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述的心腦血管疾病為腦溢血，腦血栓、 心肌梗塞、冠心病中的任意一種；所述的糖尿病為重型糖尿病，或胰島素依賴性糖尿病；所 述的關節炎為關節退化的骨關節炎；所述的性細胞功能障礙性疾病為性冷淡或陽痿；所述 的先天性或后天性疾病選自肌肉肥大癥、腦萎縮或老年性癡呆癥中的任意一種。
【文檔編號】A61P15/10GK104357396SQ201410610588
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】周勝利, 鄭超 申請人:賽歐帕克（江蘇）干細胞生物工程有限公司