專利名稱：亞健康治療用自體造血干細胞技術的制作方法
技術領域：
本發明是利用自體血細胞培養擴增出能用于亞健康治療的干細胞，涉及基礎醫學、健康科學領域。
背景技術：
“亞健康”指的是介于健康和疾病之間的一種生理功能低下的狀態，主要表現為出現明顯身心不適現象但機體無結構和代謝的異常。亞健康狀態是沒有明顯臨床癥狀的，也不能用相關臨床診斷指標確診。常見"亞健康"狀態表現:渾身無力，容易疲倦，思想渙散，頭痛，耳鳴，眼睛疲勞，鼻塞眩暈，咽喉異物感，手足發涼麻木，便秘，頸肩僵硬，胃悶不適，睡眠不良，心悸氣短，容易暈車，起立時眼前發黑，早晨起床有不快感等。目前，亞健康已經被醫學界公認為是與艾滋病并列的21世紀人類健康的大敵，世界衛生組織最近公布的一項預測性調查表明，全世界由于心理、體能應激等因素造成的亞健康人群總比例已占到75% ;在我國，亞健康狀態人群約占我國人口的70%。關于亞健康病因學說，當前比較流行的是免疫學說和自由基學說。亞健康的治療目前常用的方法有中醫療法、自然療法、運動療法、營養療法等，這些療法具有一定的效果，但不能很好地改善亞健康人群身體狀況。干細胞(Stem Cell, SC)是一類具有自我復制、高度增值和多向分化潛能的細胞群體。它們可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，從而構成機體各種復雜的組織器官。按照發育時間，干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞，按照干細胞的分化潛能又可分為造血和非造血干細胞，非造血干細胞包括脂肪干細胞、神經干細胞、皮膚干、肝臟干、心臟干、生殖干、肌肉干等；造血干細胞包括骨髓干、外周干、臍帶血干細胞、胎肝血干細胞。自20世紀70年代以來，骨髓移植和外周血干細胞移植在血液病、實體瘤、遺傳性疾病方面取得了良好的臨床療效。1988年，法國人Gluckman成功地對一名5歲范可尼貧血患兒進行了世界上首例臍帶血造血干細胞移植，此后，法、美、澳等相繼成功完成了幾例此類干細胞移植。美國紐約血液中心于1993分別完成HLA相合的非血緣的和HLA不相合的同胞間的臍帶血造血干細胞移植，均獲得成功。干細胞不僅在血液系統疾病的治療顯現神威，在神經系統疾病、骨關節疾病、心血管疾病、代謝性疾病如糖尿病、自身免疫性疾病，以及在亞健康治療、抗衰老、美容等方面都有很好的應用。國內外研究表明，外周血含有較為豐富的造血干細胞，這些干細胞的增殖能力較強，并能夠分化為造血細胞、免疫細胞等并能生成相關因子。在白血病移植治療中，外周血可以促進免疫功能的重建，同時采用自體血干細胞不僅可以免去移植配型，還可以免去病毒的檢測。因此，自體血干細胞為亞健康人群的康復治療提供了新途徑。 然而不論是對于疾病的治療，還是亞健康的康復，如何獲得充足的造血干細胞是長期以來醫療界面臨的難題。早期擴增造血干細胞多采用聯合應用造血生長因子如SCF、FL、TPO、GM-CSF, G-CSF, IL_3、IL_6、Lif、bFGF等不同組合方式體外擴增造血干細胞，但均存在細胞擴增倍數不充足、擴增后細胞可能已經具有定向分化能力等問題，因此其臨床應用受到局限。本發明采用間充質干細胞作為鋪墊細胞，同時配以營養因子培養擴增造血干細胞，為亞健康者移植治療提供了良好的技術。

發明內容
本發明的目的是提供一種亞健康治療用造血干細胞技術，它是獲取亞健康人群外周血，并在100級GMP廠房中以臍帶間充質干細胞為鋪墊細胞，添加相關營養因子培養擴增造血干細胞。經質檢合格后再回輸給亞健康者本人，達到其康復的作用。此種干細胞移植無需配型，無需檢測特定的病毒，簡單易行、安全可靠，為亞健康者的康復治療提供了良好的方法。
具體實施例方式通過本實施例來具體說明本發明亞健康治療用自體造血干細胞技術，這里用自體外周血干細胞為例說明具體步序如下:(I)基質細胞培養，簽訂產婦臍帶捐獻同意書，在產房無菌條件下取得產婦臍帶，36小時內在GMP車間的100級層流罩內將臍帶組織的血管去除，剪成lmm3大小的組織塊，接種于T75細胞培養瓶，DMEM完全培養液并添加營養因子，S卩10ng/ml ITS (胰島素、轉鐵蛋白、硒)，100u/ml 青霉素，100u/ml 鏈霉素,20ng/ml of rEGF), 20ng/ml of rPDGF-bb),lOng/ml of LIF，20ng/ml of bFGF，放置于 37°C、5% C02 的培養箱中培養。7-10 天后，間充質干細胞從組織塊邊緣長出，換液，并補充營養因子。細胞匯合度達80 %時，干細胞用
0.25%的胰酶消化并過濾，細胞懸液用800r/min離心6min，以DMEM完全培養液重懸，并傳代于T 175ml培養瓶(Pl代)，補充營養因子，之后的傳代按照1: 3比例傳。(2)自體造血干細胞培養，無菌狀態下抽取亞健康者外周靜脈血10毫升，用肝素(20U/mL)抗凝，在100級GMP廠房中，應用干細胞分離機采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血中干細胞(CD34+ 細胞)。取肝素抗凝靜脈血與等量Hank ‘s液或DMEM完全培養基充分混勻，加入1.077g/mL Ficoll淋巴細胞分離液3mL，注意保持清楚的界面，水平離心2000rpmX20分鐘。離心后管內分為三層,上層為血衆和Hank ‘s液,下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，此外，還含有血小板。用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞，置入另一短管中，加入5倍以上體積的Hank ‘s液或DMEM完全培養基，1500rpmX 10分鐘，洗滌細胞三次，并重懸于DMEM完全培養基。單核細胞以I X IO5Cells/mL密度種植于T175培養瓶(其中已含有P2代已處于60%細胞匯合度的基質臍帶間充質干細胞)，補充營養因子:50ng/mL of SCFU0U/M1 of TP0、50ng/mL of G_CSF、2.7% 甲基纖維素、100ng/mLGM-CSF、lX500UI/ml of IL_l、10ng/ml of IL_3、10ng/ml of Flt3_L，每三天換液一次。(3)造血干細胞的傳代培養，先將間充質干細胞培養上清液取出，800r/min離心6min，離心上清液再過濾以出去雜質，少許濾液重懸干細胞沉淀。將另一處于60%細胞匯合度的P 2代臍帶間充質干細胞培養(T 175ml培養瓶)上清液過濾，三分之一加入原培養瓶，原造血干細胞培養液三分之一用于重懸的造血干細胞，另補充三分之一新鮮培養液并補充營養因子(間充干和造血干培養營養因子)，放置于37°C、5% C02培養箱飽和濕度培養，每3d換一次。(4)自體造血干細胞移植，將擴增的造血干細胞進行質檢:干細胞離心上清液做細菌涂片染色、微生物培養(厭氧菌、需氧菌培養、真菌和霉菌)、有核細胞計數、干細胞活力計數、CD34+細胞計數、干細胞集落形成實驗。干細胞移植前簽訂知情者同意書，自體外周血干細胞經質檢合格后，以3X105/KG的干細胞劑量回輸給亞健康者。剩余的干細胞凍存(將制備好的自體干細胞 加入10% DMSO和1% BSA，存入-196°液氮罐保存)。
權利要求
1.亞健康治療用自體造血干細胞技術，其特征是，它按如下步序進行: (1)基質細胞培養，無菌條件下取得產婦臍帶，在GMP車間處理臍帶并培養臍帶間充質干細胞。
(2)自體造血干細胞培養，在無菌條件下取得外周靜脈血，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血干細胞，并接種于以臍帶間充質干細胞為基質的培養體系。
(3)造血干細胞的傳代培養，先將間充質干細胞培養上清液取出，離心，貼壁細胞接種于另一臍帶間充質干細胞培養。
(4)自體造血干細胞移植，將擴增的造血干細胞通過靜脈移植亞健康者本人。
2.根據權利要求1所述的亞健康治療用自體造血干細胞技術，其特征是:所述步序(I)基質細胞培養，與產婦簽訂臍帶捐獻同意書并在無菌條件下取得產婦臍帶，100級GMP車間將臍帶的血管和外膜去除并剪成碎塊培養:DMEM完全培養液、10ng/ml ITS(胰島素、轉鐵蛋白、硒)、100u/ml 青霉素、100u/ml 鏈霉素、20ng/ml of rEGF、20ng/ml of rPDGF-bb>lOng/ml of LIF、20ng/ml of bFGF。干細`胞匯合度達 80%時傳代。
3.根據權利要求1所述的亞健康治療用自體造血干細胞技術，其特征是:所述步序(2)自體造血干細胞培養，無菌條件下抽取亞健康者靜脈血10毫升，肝素(20U/mL)抗凝，在100級GMP廠房用Ficoll密度梯度離心法分離干細胞(⑶34+細胞)。用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞洗滌三次，以I X IO5ceIlsAiL密度種植于T175培養瓶(其中含有P2基質臍帶間充質干細胞)，補充營養因子:50ng/mL of SCFU0U/M1 of TP0、50ng/mL of G-CSF,2.7% 甲基纖維素、lOOng/mL GM-CSF、I X 500UI/ml of IL_l、10ng/ml of IL_3、10ng/ml ofFlt3-L，每三天換液一次。
4.根據權利要求1所述的亞健康治療用自體造血干細胞技術，其特征是:所述步序(3)造血干細胞的傳代培養，先將造血干細胞培養液取出，離心，過濾，將另一處于60%細胞匯合度的P2代臍帶間充質干細胞培養上清液過濾。原造血干細胞培養液過濾液、另一 P2間充干培養液過濾液和新鮮培養液各三分之一加入上述P2代間充干，造血干細胞的三分之一用于傳代并添加相關營養因子。
5.根據權利要求1所述的亞健康治療用自體造血干細胞技術，其特征是:所述步序(4)自體造血干細胞移植，擴增的自體造血干細胞進行質檢包括微生物檢查、有核細胞計數、干細胞活力計數、CD34+細胞計數、干細胞集落形成實驗。質檢合格的干細胞于亞健康者手背靜脈輸注，細胞移植劑量為3X105/KG。剩余的干細胞凍存用10% DMSO和I % BSA存入-196°液氮罐保存。
6.根據權利要求1所述的亞健康治療用自體造血干細胞技術，其中所說自體造血干細胞包括骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞、臍帶血干細胞，均適合本發明技術范圍。
全文摘要
一種利用亞健康者自體的血源性細胞分離純化并培養出能夠用于亞健康治療的干細胞，涉及基礎醫學、健康保健醫學領域。從亞健康者體內取出血源性細胞分離純化干細胞，并在特定的培養體系中進行擴增培養，在干細胞總數達到一定數目后，通過靜脈輸注，治療亞健康者。造血干細胞能夠重建機體的免疫系統功能，能用于亞健康者自身的康復。本培養擴增體系可以迅速擴增干細胞并保持干細胞特性，移植時無需配型，用于亞健康者的保健或治療，無毒副作用和不良反應，并具有良好效果。同時，不像其它亞健康治療法如中醫療法、自然療法、運動、營養療法等，自體造血干細胞移植后可以替代衰老的機體細胞，為亞健康人群治療提供了良好的康復途徑。
文檔編號A61K35/28GK103255106SQ201210035300
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者孫勇 申請人:孫勇