專利名稱：一種成體干細胞的組織分解、細胞黏附與萃取及培養技術的制作方法
一種成體干細胞的組織分解、細胞黏附與萃取及培養技術技術領域
本發明有關于制造一種生物制劑，藉由同時剝離切碎、分解消化及篩網過濾胎盤特定部位組織，經特定物質黏附及無血清培養萃取有效篩選大量成體干細胞的技術。
背景技術：
迄今，間葉干細胞已由各國著名專家經臨床測試證實是一種有價值的干細胞，其具備有抑制免疫力、幫助修復組織與彌補造血功能等功能，此外亦有專家公開指出具備上述若干功能的間葉干細胞，其細胞數量與功能發揮程度有關，細胞數量越多，功能發揮程度越高；細胞數量越少，則反之。間葉干細胞來源包括有胚胎干細胞(embryonic stem cell) 與成體干細胞(adult stem cell)，其中成體干細胞存在于包括有骨髓、臍帶、胎盤及血管壁等，本領域技術人員，皆以相似的培養技術進行擴增培養，可制成生物制劑產品，但現有技術中除取得成體干細胞的步驟過于繁瑣影響質量無法一致性，亦無法有效篩選獲得大量的初代培養(PO)成體干細胞，進而導致影響產量及產品功能性。
由于間葉干細胞具備有抑制免疫力、幫助修復組織與彌補造血功能等優點，為達到上述已被證實的有效功能，所需的細胞數量將是關鍵因素之一，本領域技術人員通常需要將取得的干細胞于體外培養數代，以期達到增加細胞數量的目的，于是在培養過程中將培養液加入不等量的人類血清或動物血清，因該血清內容物復雜，易造成產品批次間難以進行質量管控，甚或難以管控該血清引起人畜共通疾病的危險性，因此在產品應用上將產生不可預測的風險存在。目前坊間市售標榜以胎盤間葉干細胞為主的產品，實有購買者擔心該產品是使用含動物血清培養液及混雜整體胎盤組織生產出來的，因購買者擔心若該產品的成份與來源過于混雜，則易降低購買產品的意愿。
由于現有細胞取得來源復雜，產品質量保證難以落實，包括必須能夠在長時間擴增培養下，依然產生跟原本細胞一模一樣，另外亦必須能夠在長時間擴增培養下，經誘導培養液培養后，依然具有分化形成特定形態及功能的成熟細胞，且為能達到大量取得自胎盤特定組織部位中純化成體干細胞，同時必須避免使用含人類血清或動物血清培養液以隔絕污染風險，因此我們發明一種制造胎盤絨毛膜間葉干細胞(P Iacenta- chorion-membrane derived mesenchymal stem cell, pc_MSC)生物制劑的組織分解、細胞黏附與完全無血清 (serum-free)培養萃取生產技術。發明內容
由于胚胎干細胞的取得涉及倫理道德議題，本發明以成體干細胞為主，遂能避免這層障礙與產品購買者的疑慮。本發明提供了一種成體干細胞分離及增殖的方法，適用于不同個體胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)的分離及增殖，且經過多次繼代培養增殖后，仍然可以保持穩定的外觀形態與相同的識別度。未分化細胞，諸如組織前趨細胞、干細胞以及它們的類似物，具有使用于再生醫學或治療用組織工程的商業潛力，并且對于未分化細胞于再生醫學或治療用組織工程的應用而言，在體外培養呈現未分化狀態的未分化細胞的便利的方法是必要的。本發明提供了一種分離方法萃取特定部位組織，具有高穩定性，且培養過程中排除動物血清，培養條件均為已知物質，可確保臨床應用時無動物物質污染的風險。
目前已發表的學術研究成果中，源自骨髓或胎盤等來源的間葉干細胞，其分離、取得與培養方式皆與本發明技術有所差異，本發明技術特征包括(I)使用分解液浸潤組織且同時配合將胎盤特定的絨毛膜組織剝離切碎及篩網過濾程序，將切碎物置入涂固有特定物質器皿使其黏附于上作為取得間葉干細胞來源、(2)簡化現有技術中取得成體干細胞的步驟、(3)提供有效篩選胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)。本發明技術的實驗證明如下內容說明
(I)以涂固有不同物質的細胞培養皿進行孵育相同初始細胞的實驗顯示，胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)對特定涂固物質具有偏好性，其中以涂固有Human Collagen Type IV的細胞培養皿進行孵育時，該物質具備有效篩選非目標細胞的效果，請參閱圖1。(2)取得全體細胞后，藉由本發明技術內容所提的細胞增殖溶液進行增殖，實驗數據顯示全體細胞數量越多，則初始細胞增殖越多，請參閱圖2。(3)以本發明技術從來自不同捐贈者的胎盤中取得胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)，再以繼代培養方式完成不同繼代次數的實驗顯示可以保持穩定的外觀形態與相同的識別度的結果，請參閱圖3，因此本發明技術提供了一種成體干細胞分離及增殖方法，皆可適用于不同個體胎盤絨毛膜間葉干細胞 (pc-MSC)。(4)以本發明技術將胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)進行繼代擴增培養至二十代時，以細胞表面抗原鑒定技術進行確認鑒定，其中細胞標記⑶73、⑶90、⑶105及HLA-G的測試呈陽性反應；細胞標記⑶14、⑶34、⑶45的測試呈陰性反應，請參閱圖4。(5)以本發明技術將胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)進行繼代擴增培養至十代時，經誘導培養后，細胞分化潛力的實驗顯示胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)仍然保持具有分化多種胚層細胞的能力，其中，A與D為成骨細胞分化試驗，A為對照組，D為試驗組；B與E為軟骨細胞分化試驗，B為對照組，E為試驗組；C與F為脂肪細胞分化試驗，C為對照組，F為試驗組，請參閱圖5。


圖1 :以不同涂固材料的培養皿培養胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)的結果，由圖可見胎盤絨毛膜間葉干細胞(pc-MSC)對特定材料具有偏好性，于材料E上具有最佳的生長效率，本發明分離與培養方式與目前已發表學術成果中有關的間葉干細胞(源自骨髓或胎盤 等不同來源)不同。
圖2 :不同全體細胞數量對胎盤絨毛膜間葉干細胞生長影響的結果。
圖3 :不同捐贈者不同繼代次數生長情形的結果，由圖可見以此分離方法所得的細胞，來自不同捐贈者胎盤具有類似的形態，且經多次繼代培養仍能保持穩定的外觀形態。
圖4 :細胞表面抗原鑒定的結果，由圖可見符合一般對間葉細胞表面抗原信號的定義，其中具有⑶73、⑶90、⑶105的表達，并有HLA-G細胞表面抗原的表達且未偵測到 CD14、CD34、CD45 的信號。
圖5 :干細胞分化潛能試驗的結果，由圖可見胎盤絨毛膜間葉干細(pc-MSC)具有分化多種胚層細胞的能力，其中，A與D為成骨細胞分化試驗，A為對照組，D為試驗組；B與 E為軟骨細胞分化試驗，B為對照組，E為試驗組；C與F為脂肪細胞分化試驗，C為對照組，F為試驗組。
附圖中符號簡單說明
材料A:老鼠第一型膠原蛋白(Mouse CollagenTypeI);
材料B:層粘連蛋白(Laminin)；
材料C:纖維連接蛋白素(Fibronectin)；
材料D:人類第一型膠原蛋白(Human CollagenTypeI);
材料E:人類第四型膠原蛋白(Human CollagenTypeIV)；
材料F:無任何物質黏附(None Coating)。
具體實施方式
本發明將藉由下列實施方式做進一步的說明，這些實施方式并不限制本發明前面所揭示的內容。本發明所列實施方式除無菌操作、離心分離、細胞增殖培養、細胞表面抗原鑒定，可簡化現有技術中取得成體干細胞的步驟，亦可增加現有技術中起始PO (初代培養) 成體干細胞數量，本領域技術人員，雖可做些許的改良與修飾，但仍不脫離本發明的范疇。 本發明實施方式步驟如下說明
(一 )取自生物體經分娩后排出體外的胎盤，以組織潔凈溶液進行清潔洗凈，其中該溶液包含有HBSS配方培養基及濃度介于O. 9%至1. 1%的磷酸鹽緩沖液。
( 二)完成上述步驟后，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作方式使用手術刀剝離該胎盤的羊膜組織及絨毛膜組織。
(三)完成上述步驟后，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作方式使用步驟 (一)組織潔凈溶液清潔洗凈附著于該絨毛膜組織的血塊，清潔洗凈完畢后，將該絨毛膜組織移至細胞專用培養皿內。
(四)完成上述步驟后，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作方式使用組織分解消化溶液分解消化步驟(三)培養皿內的絨毛膜組織，并且應同時用手術刀切碎，其中該溶液包含有SMEM配方培養基、濃度介于O. 9mg/ml至1. lmg/ml的Protease 14、濃度介于 O. 9mg/ml 至1. lmg/ml 的 Collagenase B 及濃度介于1. 9mg/ml 至 2. lmg/ml 的 DNase I , 接著放置該培養皿于4攝氏度的環境空間，持續其消化時間介于12小時至16小時。
(五)完成上述步驟后，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作方式使用孔徑介于70微米至100微米的篩網過濾步驟(四)培養皿內的所有物質，接著藉由離心分離方式取得該過濾液中的全體細胞。
(六)完 成上述步驟后，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作方式使用未混合任何血清的細胞增殖溶液增殖步驟(五)全體細胞，增殖培養間期每三日更換新鮮的細胞增殖溶液直至細胞濃度介于IX IOfVcm2至9X IOfVcm2，其中該溶液包含有MCDB201配方培養基、濃度介于O. 9%至1. 1%的ITS及濃度介于O. 9%至1. 1%的磷酸鹽緩沖液。
(七)完成上述步驟后，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作方式使用涂固有濃度介于O. lmg/cm2至lmg/cm2的Human Collagen 4的細胞培養皿孵育篩選步驟(六) 細胞，持續孵育24小時后，接著藉由移除未貼附該培養皿的細胞，有效篩選獲得初代(PO) 胎盤絨毛膜間葉干細胞，濃度介于IX IOVcm2至9X 104/cm2。
(八)完成上述步驟后，以細胞表面抗原鑒定技術，確認鑒定步驟(七)胎盤絨毛膜間葉干細胞表面抗原特征，其中該細胞特征為細胞標記CD73、CD90、CD105及HLA-G的測試呈陽性反應，細胞標記⑶14、⑶34、⑶45的測試呈陰性反應。
(九)接續步驟(七)，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作細胞增殖培養方式使用未混合任何血清的干細胞增殖溶液增殖步驟(七)初代細胞的繼代培養，培養間期每三日更換新鮮的干細胞增殖溶液，其中該溶液包含有MCDB201配方培養基、濃度介于 O. 9%至1. 1%的ITS、濃度介于O. 9%至1. 1%的磷酸鹽緩沖液及濃度介于9ng/ml至llng/ml 的 EGF。
(十)接續步驟(九)，于無塵環境空間內實施本步驟，以無菌操作細胞繼代培養方式使用未混合任何血清的干細胞增殖溶液進行增殖至二十代(P20)時，以細胞表面抗原鑒定技術，再確認鑒定該胎盤絨毛膜間葉干細胞表面抗原特征，其中該細胞特征為細胞標記⑶73、⑶90、⑶105及HLA-G的測試呈陽性反應，細胞標記⑶14、⑶34、⑶45的測試呈陰性反應。
另外，本發明實施方式要求限于以下說明
(十一)僅限萃取胎盤絨毛膜的部位，必須移除胎盤絨毛膜以外組織。
(十二)以本發明技術取得全體細胞的任何過程中，其中該過程包含必須添加組織分解消化溶液且同時用手術刀細切至適當的大小均一，再以孔徑介于70微米至100微米的篩網過濾雜質及收集濾液，藉由離心分離方式，移除所有溶液，即可取得全體細胞，該過程中不可以使用研磨及/或震蕩方式處理。
(十三)組織分解消化溶液的組成成分，僅限使用SMEM配方培養基、PiOtease14、 Collagenase B及DNase I四種成分組成。
(十四)以本發明技術取得全體細胞過程中，僅限使用孔徑介于70微米至100微米的篩網進行過濾。
(十五)以本發明技術獲得的初始細胞，僅限使用涂固HumanCollagen Type IV 的細胞培養皿培養，才能有效篩選獲得初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細胞。
(十六)本發明技術實施過程中，僅限使用無人類血清及/或動物血清，亦不含任何未知成分血清的各種溶液。
(十七)以本發明技術擴增培養初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細胞，于培養期間使用干細胞增殖溶液的組成成分，僅限使用MCDB201配方培養基、ITS、EGF及磷酸鹽緩沖液四種成分組成。
權利要求
1.一種生物材料，其為胎盤絨毛膜間葉干細胞，并已保藏于臺灣財團法人食品工業發展研究所，保藏編號為BCRC960408。
2.一種促進組織再生、組織修復、血管新生、造血功能及輔助免疫調節的生物制劑，由權利要求1的生物材料與繼代培養以擴增該生物材料的溶液組成，其為可進行重復繼代培養仍可保持該生物材料穩定的外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
3.根據權利要求2的生物制劑，其中該生物材料獲自哺乳動物分娩后的胎盤絨毛膜組織。
4.根據權利要求3的生物制劑，其中該胎盤絨毛膜組織選自豬、牛、羊、犬、兔、鼠及人類的胎盤絨毛膜組織。
5.根據權利要求3的生物制劑，其中該胎盤絨毛膜組織為人類的胎盤絨毛膜組織。
6.根據權利要求3的生物制劑，其經連續步驟處理，包括(a)將胎盤清潔洗凈并以手術刀手動剝離該胎盤的絨毛膜組織；(b)將附于該絨毛膜組織的血塊清潔洗凈；(c)分解消化并同時以手術刀手動切碎該絨毛膜組織；(d)以篩網過濾該絨毛膜組織進而取得含該組織分離出來的細胞的濾液；(e)將該濾液以無血清細胞培養溶液進行細胞培養；(f)再將該細胞均勻分布于涂固有生物物質的培養載體，持續培養24小時后，移除未貼附該培養皿的細胞，最后，篩選獲得初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細胞以供使用。
7.根據權利要求6的生物制劑，其中步驟(a)與(b)中，該清潔洗凈溶液選自HBSS培養基，以及進一步包含O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
8.根據權利要求6的生物制劑，其中步驟(c)中，該組織分解消化溶液系選自SMEM培養基，以及進一步包含 O. 9mg/ml 1. lmg/ml Protease 14、0· 9mg/ml 1. lmg/mlCollagenase B 及 L 9mg/ml 2. lmg/ml DNase I。
9.根據權利要求6的生物制劑，其中該步驟(c)中，將該絨毛膜組織浸泡于4攝氏度環境持續消化分解12 16小時而形成糜粥狀。
10.根據權利要求6的生物制劑，其中步驟(d)中，該過濾篩網選自70 100微米孔徑。
11.根據權利要求6的生物制劑，其中步驟(e)中，該細胞培養溶液選自MCDB201培養基，以及進一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS及O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
12.根據權利要求6的生物制劑，其中該步驟(e)中，以每三日更換新鮮細胞培養溶液直至形成細胞濃度為I 9X IOfVcm2。
13.根據權利要求6的生物制劑，其中步驟(f)中，該細胞選自由胎盤間葉干細胞、組織前驅細胞、母細胞、組織特化細胞、基質細胞、組織前趨細胞、間葉細胞、脂肪衍生基質細胞、脂肪衍生干細胞及胎盤衍生干細胞所組成的群。
14.根據權利要求6的生物制劑,其中步驟(f)中，該生物物質組份系選自由Laminin、Fibronectin> Human Collagen Type1、Human Collagen Type IV 及它們的衍生物所構成的群組。
15.根據權利要求6的生物制劑，其中步驟(f)中，該生物物質組分選自由HumanCollagen Type IV及其衍生物所構成的群組。
16.根據權利要求6的生物制劑，其中該步驟(f)中，以數量O.1 1. Omg/cm2的生物物質組分涂布固定于培養載體。
17.根據權利要求6的生物制劑，其中該步驟(f)中，有效提供I 9XIOVcm2生物材料即初代胎盤絨毛膜間葉干細胞以供使用。
18.根據權利要求2的生物制劑，其中該溶液選自MCDB201培養基，以及進一步包含O.9% 1. l%(v/v) ITS、0. 9% 1. 1%(ν/ν)憐酸鹽緩沖液及 9ng/ml llng/ml EGF,使得該干細胞持續繼代培養。
19.根據權利要求2的生物制劑，其特征為至少包含重復進行該繼代培養的重復次數達到20次仍可保持該生物材料穩定的外觀形態，其中至少包含重復次數達到10次仍可保持該生物材料穩定的外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
20.根據權利要求14至17任一所述的生物制劑，其特征為有效篩選目標細胞，選自無血清培養基的黏附型未分化干細胞。
21.一種根據權利要求2至20任一所述的促進組織再生、組織修復、血管新生、造血功能及輔助免疫調節的生物制劑，其用途為應用于醫學美容領域、再生醫學領域、組織工程領域及醫藥領域。
22.一種制造促進組織再生、組織修復、血管新生、造血功能及輔助免疫調節的生物制劑的方法，該方法包括下述連續步驟(a)將胎盤清潔洗凈并以手術刀手動剝離該胎盤的絨毛膜組織；(b)將附于該絨毛膜組織的血塊清潔洗凈；(c)分解消化并同時以手術刀手動切碎該絨毛膜組織；(d)以篩網過濾該絨毛膜組織進而取得含該組織分離出來的細胞的濾液；(e)將該濾液以無血清細胞培養溶液進行細胞培養；(f)再將該細胞均勻分布于涂固有生物物質的培養載體，持續培養24小時后，移除未貼附該培養皿的細胞，將篩選取得初代(PO)胎盤絨毛膜間葉干細胞以供使用；(g)提供無血清細胞繼代培養溶液進行擴增培養。
23.根據權利要求22的方法，其中步驟(a)與(b)中，該清潔洗凈溶液選自HBSS培養基，以及進一步包含O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
24.根據權利要求22的方法，其中步驟(c)中，該組織分解消化溶液系選自SMEM培養基，以及進一步包含 O. 9mg/ml 1. lmg/ml Protease 14、0· 9mg/ml 1. lmg/mlCollagenase B 及 L 9mg/ml 2. lmg/ml DNase I。
25.根據權利要求22的方法，其中該步驟(c)中，將該絨毛膜組織浸泡于4攝氏度環境持續消化分解12 16小時而形成糜粥狀。
26.根據權利要求22的方法，其中步驟(d)中，該過濾篩網選自70 100微米孔徑。
27.根據權利要求22的方法，其中步驟(e)中，該細胞培養溶液選自MCDB201培養基，以及進一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS及O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液。
28.根據權利要求22的方法，其中該步驟(e)中，以每三日更換新鮮細胞培養溶液直至形成細胞濃度為I 9X IOfVcm2。
29.根據權利要求22的方法，其中步驟(f)中，該細胞選自由胎盤間葉干細胞、組織前驅細胞、母細胞、組織特化細胞、基質細胞、組織前趨細胞、間葉細胞、脂肪衍生基質細胞、月旨肪衍生干細胞及胎盤衍生干細胞所組成的群。
30.根據權利要求22的方法，其中步驟(f)中，該生物物質組份系選自由Laminin、Fibronectin、Human Collagen Type1、Human Collagen Type IV 及它們的衍生物所構成的群組。
31.根據權利要求22的方法,其中步驟(f)中，該生物物質組分選自由HumanCollagenType IV及其衍生物所構成的群組。
32.根據權利要求22的方法，其中該步驟(f)中，以數量O.1 1. Omg/cm2的生物物質組分涂布固定于培養載體。
33.根據權利要求22的方法，其中該步驟(f)中，有效提供I 9XIOVcm2生物材料即初代胎盤絨毛膜間葉干細胞以供使用。
34.根據權利要求22的方法，其中步驟(g)中，該細胞繼代培養溶液選自MCDB201培養基，以及進一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS、0. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸鹽緩沖液及9ng/ml llng/ml EGF0
35.根據權利要求30至33任一所述的方法，其特征為有效篩選目標細胞，選自無血清培養基的黏附型未分化干細胞。
36.根據權利要求34的方法，至少包含重復進行該繼代培養的重復次數達到20次仍可保持該篩選取得的初代胎盤絨毛膜間葉干細胞穩定的外觀形態，其中系至少包含重復次數達到10次仍可保持該干細胞穩定的外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
37.根據權利要求22的方法，其中篩選取得的細胞特征為對至少一種選自由CD73、⑶90、⑶105及HLA-G組成的群組中的細胞標記的測試呈陽性反應；對至少一種選自由⑶14、⑶34、⑶45組成的群組中的細胞標記的測試呈陰性反應。
38.根據權利要求36的方法，其中繼代培養的細胞特征為對至少一種選自由CD73、⑶90、⑶105及HLA-G組成的群組中的細胞標記的測試呈陽性反應；對至少一種選自由⑶14、⑶34、⑶45組成的群組中的細胞標記的測試呈陰性反應。
39.權利要求36至38任一所述的方法，其特征為進行重復繼代培養仍可保持該干細胞穩定的外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
40.一種根據權利要求22至39任一所述的方法，其應用于醫學美容領域、再生醫學領域、組織工程領域及醫藥領域。
全文摘要
本發明揭示一種簡易的由胎盤特定組織中取得大量成體干細胞制成生物制劑的方法，其主要特征在于使用分解液浸潤組織且同時配合全體組織剝離切碎及篩網過濾程序，將切碎物置入涂固有特定物質的器皿使其黏附于上。本發明亦揭示含有一種無血清的培養液進行成體干細胞培養的方法，其特征在于培養全程使用適當的無血清培養液，可將該未分化的成體干細胞培養于涂固有特定物質的器皿，藉此成體干細胞的增生及分化潛力得以被保持，此方法可以被用于體外擴增成體干細胞而不會喪失其復制及分化能力。因此，本發明的方法可以被應用于再生醫學、組織工程以及使用在其它來源的干細胞須具備有抑制免疫力、修復組織與造血功能需求上。
文檔編號A61L27/38GK103031273SQ20121028648
公開日2013年4月10日 申請日期2012年8月13日 優先權日2011年9月28日
發明者林泰元, 陳耀昌, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:林泰元, 陳耀昌